流式细胞术实验方法及应用

1、会计学1流式细胞术实验方法及应用流式细胞术实验方法及应用 科研型科研型 分选功能分选功能488nm488nm激光激光 四色荧光四色荧光(525(525、575575、610610、675nm675nm） 流式细胞仪的发展起源于细胞计数自动化的流式细胞仪的发展起源于细胞计数自动化的研究。其原理是被荧光染色的单细胞或颗粒，研究。其原理是被荧光染色的单细胞或颗粒，经过高速的液流系统形成细胞柱，排列成单细经过高速的液流系统形成细胞柱，排列成单细胞依次通过流动室，在激光照射区域，携带荧胞依次通过流动室，在激光照射区域，携带荧光素细胞受激发产生不同的荧光信号，这些荧光素细胞受激发产生不同的荧光信号，这些荧

2、光信号可以反映细胞的生物特性。光信号可以反映细胞的生物特性。前向散射激光FCMFCM的液流系统（如的液流系统（如何形成单个细胞流）何形成单个细胞流）样本管样本管鞘液管鞘液管流式细胞术的应用范围流式细胞术的应用范围细胞大小细胞大小细胞表面分子细胞表面分子:CD:CD系列系列细胞浆内分子：胞内细胞因子细胞浆内分子：胞内细胞因子细胞核内分子：细胞核内分子：P53P53细胞功能检测细胞功能检测: :细胞周期、细胞凋亡细胞周期、细胞凋亡其他：线粒体膜电位、细胞内钙离子浓度其他：线粒体膜电位、细胞内钙离子浓度激发光波长（激发光波长（nm ） 发射波长发射波长(nm)异硫氰酸（异硫氰酸（FITC） 488

3、525（绿）（绿）藻红蛋白（藻红蛋白（PE） 488 575（橙）（橙）碘化丙啶（碘化丙啶（PI） 488 610（红）（红）藻红蛋白偶联物（藻红蛋白偶联物（PE-CY5） 488 667（红）（红）藻红蛋白偶联物（藻红蛋白偶联物（PE-CY7） 488 767（红外）（红外）别藻青蛋白（别藻青蛋白（APC）633 660（红）（红）别藻青蛋白偶联物别藻青蛋白偶联物（APC-CY7）633767（红外）（红外）三、单克隆抗体标记荧光探针选择三、单克隆抗体标记荧光探针选择1.了解激发光波长和发射波长了解激发光波长和发射波长2. 2. 要有高的光子产量要有高的光子产量-提高信号强度。提高信号强度。

4、3. 3. 对激光有强的吸收对激光有强的吸收-降低背景噪音。降低背景噪音。4. 4. 激发光谱和发射光谱之间差距大激发光谱和发射光谱之间差距大-减少减少 干扰。干扰。5. 5. 易与被标记的物质结合，而不影响被标记易与被标记的物质结合，而不影响被标记 物的特异性。物的特异性。6. 6. 稳定性好，不易受光、温度、标本抗凝剂稳定性好，不易受光、温度、标本抗凝剂 和固定剂等影响。和固定剂等影响。单细胞的分离制备单细胞的分离制备 分离液分离液 血液血液+ +生理盐水生理盐水 离心离心 2500r/min2500r/min，20-30min20-30min 单个核细胞单个核细胞单核细胞单核细胞: :

5、利用单核细胞在短时培养贴壁快利用单核细胞在短时培养贴壁快的特性（的特性（30-40min30-40min），可采用短时培），可采用短时培养获得较纯的单核细胞养获得较纯的单核细胞. . 4. 4. 石蜡包埋组织石蜡包埋组织单细胞悬液的单细胞悬液的制备制备 醇乙脱水醇乙脱水：707080%9080%90 95% 95% 100%100%醇乙醇乙二甲苯二甲苯石石蜡包埋蜡包埋脱蜡水化：脱蜡水化：二甲苯脱蜡二甲苯脱蜡 100100醇乙醇乙90%80%7090%80%705050蒸馏水蒸馏水羊抗兔羊抗兔兔抗小鼠兔抗小鼠 小鼠小鼠直直 标标间间 标标3.3.阴性染色对照阴性染色对照已知不表达某种抗原的细胞即

6、为阴已知不表达某种抗原的细胞即为阴性细胞群，如性细胞群，如CD3/CD19CD3/CD19双染检测健康人血液淋巴双染检测健康人血液淋巴细胞亚群时，应有一群不表达这两种抗原的双阴细胞亚群时，应有一群不表达这两种抗原的双阴性细胞群（主要是性细胞群（主要是NKNK细胞），可作阴性对照。细胞），可作阴性对照。4. 4. 同型对照同型对照 与染色的单克隆抗体特异性无关的免与染色的单克隆抗体特异性无关的免疫球蛋白亚型，如疫球蛋白亚型，如IgG-FITCIgG-FITC、IgG-PEIgG-PE任意门、矩形门任意门、矩形门 线性门线性门 四象门四象门 淋巴细胞淋巴细胞T淋巴细胞（淋巴细胞（CD3+）CD3+

7、CD8-IFN-rIL-4（CD4+）参数的意义参数的意义: :FSCFSC的强度与细胞的大小有关，也就是说，细胞越大的强度与细胞的大小有关，也就是说，细胞越大，散射光越强，细胞越小，散射光越强，细胞越小, ,散射光越弱散射光越弱; ;SSCSSC对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可反对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可反映细胞颗粒性程度大小。映细胞颗粒性程度大小。单参数直方图单参数直方图X X轴代表荧光或散射光的强度，轴代表荧光或散射光的强度，Y Y轴代该轴代该道所具有相同光信号细胞的频率或相对的细胞数；道所具有相同光信号细胞的频率或相对的细胞数；双参数散点图双参数散点图X X轴和轴

8、和Y Y轴均代表散射光或荧光的强度轴均代表散射光或荧光的强度. .SSCFSC2C2C4C4C FCMFCM进行细胞周期进行细胞周期DNADNA含量分析时，需要对含量分析时，需要对DNADNA进行染色，进行染色，DNADNA染料（染料（PIPI）与）与DNADNA结合具有特异结合具有特异性，有一定量效关系，即性，有一定量效关系，即DNADNA含量的多少与荧光含量的多少与荧光染料的结合量成正比，荧光强度与染料的结合量成正比，荧光强度与DNADNA吸收荧光吸收荧光分子多少成正比。分子多少成正比。FCMFCM分析一个分析一个 细胞群周期与细胞群周期与DNADNA倍倍 体时，将体时，将DNADNA含量

9、直含量直 方图分为三部分，方图分为三部分， 即即G0/G1G0/G1、S S、G2/MG2/M 三个细胞峰。三个细胞峰。G2/M(4C)G0/G1(2C) S(2C4C)G2/M(4C)G0/G1(2C) S(2C4C)G2/M(4C) 当人体癌变或者具有恶性潜能的癌前病变时，当人体癌变或者具有恶性潜能的癌前病变时，在其发生、发展过程中可伴随有细胞在其发生、发展过程中可伴随有细胞DNADNA倍体及倍体及S S期的改变（异倍体）期的改变（异倍体） 恶性肿瘤细胞增殖周期的判断：恶性肿瘤细胞增殖周期的判断： S10S10、G2/M15G2/M15或或S20S20、G2/M5G2/M5CD3+CD3+

10、CD4+CD3+CD8+ T淋巴细胞淋巴细胞（CD3+）淋巴细胞淋巴细胞 B淋巴细胞淋巴细胞（CD19+） NK细胞细胞（CD16+56）+NKNK细胞细胞: :CD(16+56)CD(16+56)+ +/CD3/CD3- -B B淋巴细胞淋巴细胞: :CD19CD19+ +/CD3/CD3- -NK+/CD3-CD（16+56）+/CD3+（T-cell）CD19+/CD3+（T-cell）CD19+/CD3-、淋巴细胞淋巴细胞T淋巴细胞（淋巴细胞（CD3+）CD3+CD8-（CD4+）IFN-rIL-4PIPI单染色法单染色法Annexin VAnnexin VPIPI双染法。双染法。TU

11、NELTUNEL法法机械损伤细胞：机械损伤细胞： Annexin V -/PI+Annexin V -/PI+ 晚期凋亡、坏死细晚期凋亡、坏死细胞：胞：Annexin V Annexin V +/PI+/PI+早期凋亡细胞：早期凋亡细胞： Annexin V +/PI-Annexin V +/PI-活细胞：活细胞： Annexin V -/PI-Annexin V -/PI-FCMFCM的液流系统（如的液流系统（如何形成单个细胞流）何形成单个细胞流）样本管样本管鞘液管鞘液管羊抗兔羊抗兔兔抗小鼠兔抗小鼠 小鼠小鼠直直 标标间间 标标CD3+CD3+CD4+CD3+CD8+ T淋巴细胞淋巴细胞（CD3+）淋巴细胞淋巴细胞 B淋巴细胞淋巴细胞（CD19+） NK细胞细胞（CD16+56）+NKNK细胞细胞: :CD(16+56)CD(16+56)+ +/CD3/CD3- -B B淋巴细胞淋巴细胞: :CD19CD19+ +/CD3/CD3- -NK+/CD3-CD（16+56