真核基因表达系统

1、第八章第八章 真核表达系统真核表达系统Chapter 8 Eukaryotic expression system 概述概述( introduction ) 真核基因结构及表达调控特点真核基因结构及表达调控特点( Features of eukaryotic gene structure and regulation) 真核表达系统真核表达系统(eukaryotic gene expression system) 酵母表达系统酵母表达系统(yeast expression system) 哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统(mammalian cell expression) 昆虫细胞表

2、达系统昆虫细胞表达系统(insect cell expression ) 内内 容容第一节第一节 概述概述一、真核基因组的复杂性一、真核基因组的复杂性二、原核表达系统的局限性二、原核表达系统的局限性三、真核表达系统的必要性及优势三、真核表达系统的必要性及优势一、真核基因组的复杂性一、真核基因组的复杂性 1. . 真核基因组巨大真核基因组巨大 大肠杆菌基因组约4106bp，哺乳类基因组在109bp数量级 大肠杆菌约有4000个基因，人则约有10万个基因2. 真核生物遗传信息复杂真核生物遗传信息复杂 原核生物的基因组基本上是单倍体，而真核基因组是二倍体 真核生物主要的遗传物质与组蛋白等构成染色质，

3、被包裹在核膜内，核外还有遗传成分(如线粒体DNA等)，这就增加了基因表达调控的层次和复杂性。 细菌多数基因按功能相关成串排列，组成操纵子，共同开启或关闭，转录出多顺反子(polycistron)的mRNA； 真核生物则是一个结构基因转录生成一条mRNA，即mRNA是单顺反子(monocistron)，基本上没有操纵子的结构。 真核细胞的许多活性蛋白是由相同和不同的多肽形成的亚基构成的，这就涉及到多个基因协调表达的问题，真核生物基因协调表达要比原核生物复杂得多。 3. 真核生物基因协调表达真核生物基因协调表达4. 真核生物基因编码复杂真核生物基因编码复杂 原核基因组的大部分序列都为基因编码，而核

4、酸杂交等实验表明：哺原核基因组的大部分序列都为基因编码，而核酸杂交等实验表明：哺乳类基因组中仅约乳类基因组中仅约10%10%的序列为蛋白质、的序列为蛋白质、rRNArRNA、tRNAtRNA等编码，其余约等编码，其余约90%90%的序列功能至今还不清楚。的序列功能至今还不清楚。 原核生物的基因为蛋白质编码的序列绝大多数是连续的，而真核生物原核生物的基因为蛋白质编码的序列绝大多数是连续的，而真核生物为蛋白质编码的基因绝大多数是不连续的，即有外显子为蛋白质编码的基因绝大多数是不连续的，即有外显子(exon)(exon)和内含和内含子子(intron)(intron)，转录后需经剪接，转录后需经剪接

5、(splicing)(splicing)去除内含子，才能翻译获得去除内含子，才能翻译获得完整的蛋白质，这就增加了基因表达调控的环节。完整的蛋白质，这就增加了基因表达调控的环节。 原核基因组中除原核基因组中除rRNArRNA、tRNAtRNA基因有多个拷贝外，重复序列不多。哺乳基因有多个拷贝外，重复序列不多。哺乳动物基因组中则存在大量重复序列动物基因组中则存在大量重复序列(repetitive sequences)(repetitive sequences)。 真核生物真核生物mRNA 5mRNA 5有帽状结构，有帽状结构，33末端有末端有PolyAPolyA尾巴尾巴 1、没有转录后的剪接和加工

6、系统、没有转录后的剪接和加工系统 2、缺乏翻译后加工修饰系统：、缺乏翻译后加工修饰系统：不能进行糖基不能进行糖基化、磷酸化、甲基化的修饰，影响某些蛋化、磷酸化、甲基化的修饰，影响某些蛋白的活性。白的活性。二、二、 原核表达系统的局限性原核表达系统的局限性3、在原核细胞中表达的真核蛋白不稳定、在原核细胞中表达的真核蛋白不稳定 易被细菌蛋白酶降解易被细菌蛋白酶降解; 难实现真正的分泌出胞，其产量很低难实现真正的分泌出胞，其产量很低; 而且容易而且容易出现信号肽不被切割，或不在特异位置上切割。出现信号肽不被切割，或不在特异位置上切割。 表达产物常以包涵体的形式存在，后期变性、复性的效率低表达产物常以

7、包涵体的形式存在，后期变性、复性的效率低4、内毒素的污染、内毒素的污染 (contamination of endotoxin)1. 具转录后加工系统具转录后加工系统:2. 具翻译后修饰系统具翻译后修饰系统3. 可实现真正的分泌表达可实现真正的分泌表达三、真核表达系统的必要性及优势三、真核表达系统的必要性及优势 ( advantages of eukaryotic expression system ) （一）真核基因表达调控特点（一）真核基因表达调控特点 -多层次、多方面多层次、多方面（二）真核基因表达的调控模式（二）真核基因表达的调控模式第二节第二节 真核基因表达调控特点真核基因表达调控特

8、点Features of Eukaryotic gene structure and expression真核基因表达的调控模式真核基因表达的调控模式 ( The regulating model of eukaryotic gene expression) 1、转录前水平转录前水平(基因组水平基因组水平) ：gene level 2、转录水平调控转录水平调控: transcription level3、转录后调控、转录后调控: post-transcription level4、翻译水平的调控、翻译水平的调控: translation level5、翻译后修饰、翻译后修饰: post-tra

9、nslation modification 1、转录前水平转录前水平(基因组水平基因组水平)： gene level 基因结构的改变、稳定持久、不可逆基因结构的改变、稳定持久、不可逆，组蛋组蛋白修饰，白修饰，DNA甲基化等甲基化等2. 转录水平调控转录水平调控 顺式调控元件顺式调控元件(cis-acting element) 反式作用因子反式作用因子(trans-acting factor) （1 ）顺式调控元件顺式调控元件(cis-acting element) 结构基因周围能与特异转录因子结合而启动结构基因周围能与特异转录因子结合而启动 转录的转录的DNA序列，主要包括序列，主要包括： 起

10、正性调节作用：启动子、增强子起正性调节作用：启动子、增强子 起负性调节作用：沉寂子，终止子，加尾信号起负性调节作用：沉寂子，终止子，加尾信号 启动子启动子 位于基因位于基因55末端与转录起始有关的核苷酸序列。作用特点是近距末端与转录起始有关的核苷酸序列。作用特点是近距离作用、具有方向性、空间位置较恒定。一般包括离作用、具有方向性、空间位置较恒定。一般包括 核心启动子元件（核心启动子元件（core promoter elements)core promoter elements) ： 指指RNARNA聚合酶起始转录所必需的最小的聚合酶起始转录所必需的最小的DNADNA序列，决定基因转录的序列，决

11、定基因转录的精确起始位点产生基础水平的转录精确起始位点产生基础水平的转录，包括：转录起始点及，包括：转录起始点及-30-30区的区的TATA-boxTATA-box 上游启动子元件（上游启动子元件（upstream promoter elementsupstream promoter elements) ) 包括包括 -70-70到到-80bp-80bp区域的区域的CAATCAAT盒及其两侧的盒及其两侧的GCGC盒，协同决定转录的盒，协同决定转录的基础效率基础效率 组织特异性元件组织特异性元件 诱导性启动子元件诱导性启动子元件真核启动子结构模式图真核启动子结构模式图核心启动子元件核心启动子元件

12、上游启动子元件上游启动子元件 哺乳类哺乳类RNA聚合酶聚合酶启动子中常见的元件启动子中常见的元件元件名称元件名称共同序列共同序列结合的蛋白因子结合的蛋白因子名称名称 分子量分子量 结合结合DNA长度长度TATA boxTATAAAATBP 30,000 10bpGC box GGGCGGSP-1 105,000 20bpCAAT boxGGCCAATCTCTF/NF1 60,000 22bpOctamerATTTGCATOct-1 76,000 20bpOct-2 53,000 23bpk BGGGACTTTCCNFkB 44,000 10bpATFGTGACGTAFT ? 20bp 增强子增

13、强子(enhancer) 是一种能够提高转录效率的顺式调控元件是一种能够提高转录效率的顺式调控元件 增强子要有启动子才能发挥作用，但增强子对启动增强子要有启动子才能发挥作用，但增强子对启动子没有严格的专一性子没有严格的专一性 无方向性（无方向性（序列序列、位置、位置） 远距离作用（远距离作用（1-4kB） 无基因特异性无基因特异性 具组织特异性具组织特异性构建载体构建载体沉寂子（沉寂子（silencer)silencer)或衰减子（或衰减子（dehancer)dehancer) 是一类抑制基因转录的调控因子，作用方式 与增强子相同转录终止信号：转录终止信号： 控制基因转录的终止，由polyA上

14、游的10-20bp处的加尾信号（AATAA）和poly A下游的G/T簇构成 （2）反式作用因子反式作用因子(trans-acting factor) 由位于不同或相同染色体上相距较远的由位于不同或相同染色体上相距较远的基因所编码的蛋白质因子，通过与顺式调控基因所编码的蛋白质因子，通过与顺式调控元件和元件和RNA聚合酶的聚合酶的相互作用相互作用而调节基因转而调节基因转录活性。录活性。转录信号转录信号1PTrans-acting factorTrans-acting factor (DNA结合蛋白）结合蛋白）Cis-acting factorA genemRNA of AProtein AB g

15、enemRNA of BProtein BDNA3 3、转录后的修饰、转录后的修饰 内含子的剪接内含子的剪接 外显子的拼接外显子的拼接 mRNAmRNA的加尾和加帽的加尾和加帽 mRNAmRNA的稳定性的稳定性 4 4、翻译水平的调控、翻译水平的调控 主要是主要是microRNAmicroRNA对对mRNAmRNA、tRNA tRNA 和和rRNArRNA的的调控调控5 5、翻译后的调控、翻译后的调控 切除信号肽切除信号肽 糖基化糖基化 乙酰化乙酰化 磷酸化磷酸化 甲基化甲基化 蛋白质的降解蛋白质的降解第三节第三节 真核表达系统真核表达系统组成：组成： 真核表达载体真核表达载体 受体细胞受体细

16、胞真核表达载体真核表达载体 适用于在真核细胞中表达外源基因的载体。适用于在真核细胞中表达外源基因的载体。真核载体根据受体不同，又可分为几种：真核载体根据受体不同，又可分为几种： 酵母表达载体酵母表达载体 哺乳动物细胞表达载体哺乳动物细胞表达载体 昆虫杆状病毒表达载体昆虫杆状病毒表达载体受体细胞受体细胞据受体细胞及表达载体的不同分为据受体细胞及表达载体的不同分为3 3种：种： 酵母表达系统酵母表达系统 哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统 昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统 发酵简单、快速、便宜发酵简单、快速、便宜 真核生物，有翻译后修饰功能真核生物，有翻译后修饰功能 可分泌表达，简化了纯化工

17、艺可分泌表达，简化了纯化工艺 受体细胞安全受体细胞安全一、酵母表达系统一、酵母表达系统（一）酵母载体（一）酵母载体: : 1 1、概念：、概念： 携带外源基因在酵母细胞中复制、扩增携带外源基因在酵母细胞中复制、扩增 和表达的载体，包括克隆载体和表达载体。和表达的载体，包括克隆载体和表达载体。 2 2、组成元件、组成元件：遗传标记：遗传标记 调控序列调控序列1 1）遗传标记：用于重组子的筛选和鉴定遗传标记：用于重组子的筛选和鉴定 营养标记基因：亮氨酸（营养标记基因：亮氨酸（LeuLeu） 抗生素选择标记基因：抗生素选择标记基因：ZeocinZeocin 2）调控序列调控序列 ARS：酵母复制起始

18、区：酵母复制起始区(点点) 酵母启动子：常用的有酵母启动子：常用的有: PGK(磷酸甘油激酶磷酸甘油激酶) GAP（3-磷酸甘油醛脱氢酶）磷酸甘油醛脱氢酶） ADH1(醇脱氢酶醇脱氢酶) SUC(蔗糖酶蔗糖酶) Apase(碱性磷酸酶碱性磷酸酶) 酵母着丝粒区段酵母着丝粒区段(CEN)：增加转化子稳定性：增加转化子稳定性 3 3、类型、类型( types) ( types) 酵母克隆载体酵母克隆载体(yeast clone vector) ：不含酵母启动子，不能在酵母中不含酵母启动子，不能在酵母中表达外源基因，如表达外源基因，如YIPYIP、YRPYRP、YEPYEP 酵母表达载体酵母表达载体

19、(yeast expression vector) )：酵母克隆载体酵母克隆载体+ +酵母启动子酵母启动子, ,若引入信号肽序列，则成为分泌型载体若引入信号肽序列，则成为分泌型载体 酵母人工染色体（酵母人工染色体（yeast artificial chromosome, YAC) ) 克隆大片段克隆大片段DNADNA， 2M质粒质粒：酵母核质中的小的环状酵母核质中的小的环状DNA，可以独立复制并转录。可以独立复制并转录。（1）酵母克隆载体的构建）酵母克隆载体的构建 酵母整合型质粒酵母整合型质粒( yeast integrated plasmid. Yip)( yeast integrated

20、plasmid. Yip) 细菌质粒细菌质粒DNA+DNA+酵母遗传标记，通过同源重组整合入酵母染色酵母遗传标记，通过同源重组整合入酵母染色体，转化子稳定，但转化率极低体，转化子稳定，但转化率极低。 酵母复制型质粒酵母复制型质粒(Yeast replicable plasmid, YRp)(Yeast replicable plasmid, YRp) 细菌质粒细菌质粒DNA+DNA+酵母遗传标记酵母遗传标记(YIp)+(YIp)+酵母复制序列酵母复制序列(ARS(ARS),),可可自主复制，但稳定性差自主复制，但稳定性差 酵母附加子型质粒酵母附加子型质粒, YEp, YEp ：细菌质粒：细菌质

21、粒DNA+DNA+酵母标记基因酵母标记基因(YIp)+(YIp)+酵母酵母2 2MM质粒质粒，游离于核外存在并自主复制，游离于核外存在并自主复制酵母酵母复制复制序列序列酵母酵母2M质粒质粒（2）酵母表达载体）酵母表达载体 特点特点：含酵母启动子：含酵母启动子 穿梭载体穿梭载体(shuttle vector)： 既可以携带外既可以携带外源基因在原核细胞中复制，又可以使其在真核细源基因在原核细胞中复制，又可以使其在真核细胞中表达的载体。胞中表达的载体。 种类种类：啤酒酵母表达载体：啤酒酵母表达载体 毕赤酵母表达载体：毕赤酵母表达载体： 分泌型表达载体分泌型表达载体 非分泌型表达非分泌型表达啤酒酵母

22、表达载体啤酒酵母表达载体毕赤酵母表达载体毕赤酵母表达载体-整合型整合型(3) (3) 酵母人工染色体（酵母人工染色体（yeast artificial yeast artificial chromosome,YAC)- chromosome,YAC)-克隆大片段克隆大片段DNADNA 由下列元件组成由下列元件组成 酵母染色体酵母染色体 2umDNA2umDNA的复制起始区的复制起始区 着丝粒序列（着丝粒序列（CEN)CEN) 四膜虫端粒四膜虫端粒DNA(TEL)DNA(TEL) YAC: 利用酵母的着丝粒区段（利用酵母的着丝粒区段（CEN ）、自动复制序列）、自动复制序列（ARS）及）及四膜虫

23、端粒四膜虫端粒DNA(TEL)DNA(TEL)构建的人工染色体构建的人工染色体 结构：结构： 左臂：左臂：TEL、选择标记、选择标记、ARS 、CEN 右臂：右臂：TEL、选择标记、选择标记 特点：容量大（特点：容量大（50-1000kb），稳定性差），稳定性差 作用：构建基因组文库作用：构建基因组文库 二）受体细胞二）受体细胞 1 1. .啤酒酵母：啤酒酵母： 较早使用，了解清楚较早使用，了解清楚 安全性高，被安全性高，被FDAFDA确认为安全生物确认为安全生物 表达量较低表达量较低 过量糖基化过量糖基化 转化子不稳定，易发生质粒丢失转化子不稳定，易发生质粒丢失2. 毕赤酵母：毕赤酵母：新发

24、展的酵母受体细胞新发展的酵母受体细胞 高表达（高表达（12g/L） 高稳定高稳定-载体为整合型载体为整合型 高分泌（高分泌（10g/L）三）三）转化转化 1. 原生质体法：去除厚壁原生质体法：去除厚壁 2.电穿孔法：效率较高，整合型载体转化前要酶切电穿孔法：效率较高，整合型载体转化前要酶切线性化线性化3. LiCl法：做成感受态细胞法：做成感受态细胞四）外源基因在酵母菌中的表达四）外源基因在酵母菌中的表达1 1、胞内表达：、胞内表达：直接表达外源基因，直接表达外源基因， 如：如：HBsAgHBsAg的酵母重组疫苗的酵母重组疫苗2 2、分泌表达：、分泌表达：在在MCS前加入信号肽序列，前加入信号

25、肽序列， pGAPZ ,利用利用 因子分泌表达因子分泌表达 五）高表达的策略五）高表达的策略（1 1）利用诱导型强启动子：）利用诱导型强启动子：毕赤酵母表达载体中常用启动能毕赤酵母表达载体中常用启动能力强的力强的GAPGAP启动子启动子（2 2）提高整合拷贝数：）提高整合拷贝数：可利用载体中提供的抗生素遗传标记，利用载体中提供的抗生素遗传标记，以抗生素加压筛选含有多拷贝的转化子以抗生素加压筛选含有多拷贝的转化子。（3 3）控制蛋白酶降解活性）控制蛋白酶降解活性：采用蛋白酶缺陷型宿主菌，改变采用蛋白酶缺陷型宿主菌，改变发酵培养基的发酵培养基的PHPH值，或在培养基中补加氨基酸或多肽，均可值，或在

26、培养基中补加氨基酸或多肽，均可避免产物被降解避免产物被降解。（4 4）分泌表达：）分泌表达：也是一种避免产物被降解的良好策略也是一种避免产物被降解的良好策略。酵母双杂交系统酵母双杂交系统Yeast Two-Hybrid System 酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母酵母中进行的，研究中进行的，研究活活细胞内细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能通过也能通过报告基因报告基因的表达产物敏感地检测得到。的表达产物敏感地检测得到。 1989年美国纽约州立大学的年美国纽约州立大学的Fields和和Song首先

27、描述了酵母首先描述了酵母双杂交系统双杂交系统(yeast two-hybrid system)。蛋白的酵母双杂交实。蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相互作用对真核基因转录调控影响的实验。互作用对真核基因转录调控影响的实验。 很早就已知道，转录活化蛋白可以和很早就已知道，转录活化蛋白可以和DNA 上特异的序上特异的序列结合而启动相应基因的转录反应。这种列结合而启动相应基因的转录反应。这种DNA 结合与转结合与转录激活的功能是由转录活化蛋白上两个相互独立的结构域录激活的功能是由转录活化蛋白上两个相互独立的结构域

28、即即DNA 结合结构域结合结构域 (Binding Domain, BD)和转录活化结构和转录活化结构域域 (Activation Domain, AD)分别来完成的，并且这两个结分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录活化都是必须的构域对于基因的转录活化都是必须的 转录激活因子转录激活因子DNA结合结构域结合结构域(BD)(DNA binding domain) 转录激活结构域转录激活结构域(AD)(activation domain) 这两个结构域各具功能，互不影响这两个结构域各具功能，互不影响, 单独存单独存在时没有转录激活的功能，只有两者通过共价或非在时没有转录激活的功能，只有两者

29、通过共价或非共价键连接建立起来的空间结构方可表现出一个完共价键连接建立起来的空间结构方可表现出一个完整的激活特定基因表达的激活因子的功能。整的激活特定基因表达的激活因子的功能。 基本原理基本原理 在利用在利用GAL4 系统筛选系统筛选cDNA 文库或研究蛋白间的相文库或研究蛋白间的相互作用时，互作用时，DNA 结合结构域与靶蛋白即结合结构域与靶蛋白即“诱饵诱饵”相结合，相结合，转录活化结构域与文库蛋白或要验证的蛋白相结合。一般转录活化结构域与文库蛋白或要验证的蛋白相结合。一般情况下，单独的情况下，单独的BD 可以与可以与GAL4 上游活化序列（上游活化序列（GAL UAS）结合但不能引起转录，

30、单独的）结合但不能引起转录，单独的AD 则不能与则不能与GAL UAS 结合，只有当结合，只有当BD 与与AD 分别表达的融合蛋白由于相分别表达的融合蛋白由于相互作用而导致两者在空间上相互靠近时，互作用而导致两者在空间上相互靠近时，BD 与与AD 才能才能与与GAL UAS 结合并且引起报道基因的转录。结合并且引起报道基因的转录。ADYADYXDNA-BDGAL4 UASPromoterlacZ(or HIS) reporter genetranscriptionGAL4 UASPromoterlacZ(or HIS) reporter geneGAL4 UASPromoterlacZ(or

31、HIS) reporter geneXDNA-BDtranscriptiontranscription已知蛋白已知蛋白X与与BD-fusion -诱饵（诱饵（bait）未知蛋白未知蛋白Y与与AD-fusion -猎物或靶蛋白（猎物或靶蛋白（prey or target protein）报告基因（报告基因（reporter gene） -Lac Z（编码（编码-半乳糖苷酶）半乳糖苷酶）LacZ reporter - Blue/White ScreeningHIS3 reporter - Screen on His+ media (usually need to add 3AT to increa

32、se selectivity)LEU2 reporter - Screen on Leu+ mediaADE2 reporter - Screen on Ade+ mediaURA3 reporter - Screen on Ura+ media (can do negative selection by adding FOA)报告基因报告基因已知蛋白的已知蛋白的cDNAcDNA序列为诱饵序列为诱饵(bait)(bait)，将其与，将其与DNADNA结合域（结合域（BDBD）融合，构建成诱饵质粒融合，构建成诱饵质粒将待筛选蛋白的将待筛选蛋白的cDNAcDNA序列与转录激活域序列与转录激活域(A

33、D)(AD)融合，构建成融合，构建成文库质粒文库质粒将这两个质粒共转化于酵母细胞中将这两个质粒共转化于酵母细胞中酵母细胞中，已分离的酵母细胞中，已分离的DNADNA结合域和转录激活域不会相互作用，结合域和转录激活域不会相互作用，但诱饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激但诱饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录活报告基因的转录酵母双杂交系统的优点酵母双杂交系统的优点1. 高敏感性。高敏感性。2. 真实性。真实性。检测在活细胞内进行，作用条件与作用力检测在活细胞内进行，作用条件与作用力无需模拟，在一定程度上代表细胞内的真实情况。无需模拟，在一定程度上代

34、表细胞内的真实情况。3. 简洁性。简洁性。融合蛋白相互作用后，减少了制备抗体和融合蛋白相互作用后，减少了制备抗体和纯化蛋白质的繁琐步骤。纯化蛋白质的繁琐步骤。4. 广泛性。广泛性。采用不同组织器官细胞类型和分化时期的采用不同组织器官细胞类型和分化时期的材料构建材料构建cDNA文库，能分析不同亚细胞部位和功文库，能分析不同亚细胞部位和功能的蛋白质，适用于部分细胞质、细胞核及膜结合能的蛋白质，适用于部分细胞质、细胞核及膜结合蛋白。蛋白。 分析已知蛋白之间的相互作用分析已知蛋白之间的相互作用 对蛋白质功能域的分析，如可将待测蛋白质进行点对蛋白质功能域的分析，如可将待测蛋白质进行点突变或缺失突变再进行

35、双杂交。突变或缺失突变再进行双杂交。 用已知功能蛋白质筛选双杂交用已知功能蛋白质筛选双杂交cDNA文库，研究蛋文库，研究蛋白质之间相互作用的传递途径，发现新基因。白质之间相互作用的传递途径，发现新基因。 分析新基因的生物学功能。即以功能未知的新基因分析新基因的生物学功能。即以功能未知的新基因去筛选文库，再根据筛的已知基因推测新基因功能。去筛选文库，再根据筛的已知基因推测新基因功能。 绘制蛋白质相互作用系统图谱绘制蛋白质相互作用系统图谱 在药物设计中的应用在药物设计中的应用酵母双杂交系统的应用现状酵母双杂交系统的应用现状 进行完全的翻译后修饰进行完全的翻译后修饰 可表达产生有功能的膜蛋白可表达产

36、生有功能的膜蛋白 用途：表达大量的外源蛋白用途：表达大量的外源蛋白 研究基因的功能研究基因的功能 基因治疗基因治疗两部分：两部分： 哺乳动物表达载体哺乳动物表达载体 受体：哺乳动物细胞受体：哺乳动物细胞二、哺乳动物细胞表达系统二、哺乳动物细胞表达系统1 1、主要元件主要元件2 2、载体的类型载体的类型 非病毒性载体非病毒性载体 病毒性载体病毒性载体 一）哺乳动物细胞表达载体一）哺乳动物细胞表达载体(一）主要元件一）主要元件1）启动子启动子 病毒来源的病毒来源的： SV40 : 绿猴空泡病毒（绿猴空泡病毒（Simian vacuolating virus-40） CMV: 巨细胞病毒（巨细胞病毒

37、（Cytomegalovirus ） RSV: 肉瘤病毒（肉瘤病毒（Rous sarcoma virus） ADV: adenovirus （腺病毒）（腺病毒） LTR: 逆转录病毒长末端重复序列（逆转录病毒长末端重复序列（Long terminal repeat from retrovirus） 细胞来源的细胞来源的： HSP：heat shock protein（热休克蛋白）（热休克蛋白）(Promoter + ori) (PolyA)ori2）增强子增强子 许多来源于病毒的许多来源于病毒的增强子增强子在不同种属细胞中都有极强在不同种属细胞中都有极强的促进转录能力的促进转录能力 SV40

38、enhancer RSV enhancer CMV enhancer LTR enhancer3 3）筛选标记筛选标记 胸苷激酶胸苷激酶(tk)基因基因 Thymidine kinase gene 二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶(dhfr)基因基因 Dihydrofolate reductase ,dhfr 新霉素抗性基因新霉素抗性基因 neomycin resistance gene胸苷激酶胸苷激酶(tk)(tk)基因基因tk+细胞细胞中：胸苷中：胸苷(T) 胸苷胸苷一一磷酸磷酸二氢叶酸二氢叶酸二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶 四氢叶酸四氢叶酸 dCTPdATP dTTP氨基喋呤氨基喋呤(Amin

39、opterin) tk阻断阻断补加次黄嘌呤（补加次黄嘌呤（Hypoxanthine）死亡死亡存活存活DihydrofolateThymidine（1）（2）（3）HAT二氢叶酸还原二氢叶酸还原酶基因筛选法原理酶基因筛选法原理 携带外源基因的载体连接有携带外源基因的载体连接有dhfr基因基因，可以表达，可以表达二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶 以以dhfr-细胞为受体细胞为受体 :CHO细胞细胞 dhfr-细胞无法在普通培养基中存活，而转化入细胞无法在普通培养基中存活，而转化入dhfr基因后可以存活，并表达外源基因。基因后可以存活，并表达外源基因。 若在培养基内加入若在培养基内加入甲氨蝶呤甲氨蝶呤，

40、进行加压筛选，可，进行加压筛选，可以提高外源基因表达量以提高外源基因表达量 新霉素的类似物新霉素的类似物G418对原核、真核均有毒对原核、真核均有毒 neo编码的酶可使编码的酶可使G418灭活灭活 此种筛选方法对受体细胞无要求，应用更简便此种筛选方法对受体细胞无要求，应用更简便新霉素抗性基因新霉素抗性基因(neo)(neo)4）转录终止信号和多聚腺苷酸信号转录终止信号和多聚腺苷酸信号 使转录后的使转录后的mRNA 能有效进行切割和多聚腺能有效进行切割和多聚腺苷酸化苷酸化多聚腺苷多聚腺苷酸信号酸信号5 5）复制元件：）复制元件： 使载体在受体细胞中复制，使载体在受体细胞中复制， 提高外源基因的表

41、达水平提高外源基因的表达水平6 6）原核细胞的部分序列）原核细胞的部分序列 在原核细胞复制的复制起始为点（在原核细胞复制的复制起始为点（ori)ori) 在原核细胞复制筛选的抗生素抗性基因在原核细胞复制筛选的抗生素抗性基因（AMPrAMPr） 复制元件复制元件复制元件复制元件 1 1）非病毒性载体非病毒性载体 2 2）病毒性载体病毒性载体：腺病毒，慢病毒等：腺病毒，慢病毒等2、 载体的类型载体的类型1）非病毒型非病毒型 (复制子型复制子型, 质粒型）质粒型） 由真核复制信号、启动子由真核复制信号、启动子,转录单位及转录单位及质粒片段组成质粒片段组成,不需要包装细胞。不需要包装细胞。 如：如：

42、pSV系列、系列、pCDNA3等等( (二）载体的类型二）载体的类型2）病毒型载体病毒型载体 外源外源DNA插入病毒插入病毒DNA或或取代病毒基因某一片段，取代病毒基因某一片段，重组重组DNA随病毒颗粒而复随病毒颗粒而复制制 (多需辅助病毒或包装细多需辅助病毒或包装细胞的存在胞的存在)。如：。如：逆转录病逆转录病毒载体毒载体、腺病毒载体腺病毒载体等等病毒型载体的类型病毒型载体的类型 整合型整合型 整合入宿主染色体，随染色体复制而复制整合入宿主染色体，随染色体复制而复制 可持续表达外援基因可持续表达外援基因 安全性低：插入诱变安全性低：插入诱变 SV40SV40载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体载

43、体、逆转录病毒载体、慢病毒载体 游离型游离型 不整合不整合 生物安全性高生物安全性高 瞬时表达瞬时表达 腺病毒载体、痘苗病毒载体腺病毒载体、痘苗病毒载体1、CHO细胞（中国仓鼠卵巢癌细胞）细胞（中国仓鼠卵巢癌细胞） -可大规模培养可大规模培养2、COS细胞（猴肾细胞系）：可合成细胞（猴肾细胞系）：可合成SV40复制的大复制的大T抗抗原，可使每个细胞中的原，可使每个细胞中的SV40载体拷贝数多达载体拷贝数多达10万个，万个，适合于大量表达适合于大量表达SV40载体上的基因载体上的基因3、其他动物的细胞：、其他动物的细胞： 如如Hela细胞（人宫颈癌细胞）细胞（人宫颈癌细胞）、HEK293细胞细胞二）受体细胞二）受体细胞-哺乳动物细胞哺乳动物细胞三）基因转移技术三）基因转移技术转化：将质粒或以质粒为载体构建的重组转化：将质粒或以质粒为载体构建的重组DNA导入细胞导入细胞的方法。的方法。 1. 磷酸钙共沉淀法磷酸钙共沉淀法 2. DEAE-Dextran 3. 脂