祁自柏-体外诊断试剂的分类和基本原理

1、体外诊断试剂的分类和基本原理中国药品生物制品检定所祁自柏TEL：01067095386E.Mail:QIZIBAI263.NET十六个体系考核类型分类十六个体系考核类型分类表表分类产品型别及产品举例（第一类）酶联免疫（酶标板、磁珠、微粒子）类试剂酶联免疫法：乙型肝炎病毒e抗体诊断试剂盒（酶联免疫法）；癌胚抗原定量测定试剂盒(免疫荧光法)化学发光法：人生长激素（GH）定量测定试剂盒增强化学发光免疫分析法：巨细胞病毒抗体检测试剂盒时间分辨荧光法：游离甲状腺素（FT4）定量测定试剂盒电化学发光法：甲型肝炎病毒抗体诊断试剂盒微粒子酶免法：丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒（第二类）胶体金（硒、乳胶）类试剂胶体

2、金法：梅毒抗体-乙肝表面抗原诊断试剂盒胶体硒法：HIV(1+2+0)试剂盒（第三类）免疫印迹试剂免疫印迹试剂盒:风湿病自身抗体检测试剂盒（免疫印迹法）（第四类）蛋白芯片（微阵列）类试剂蛋白芯片（微阵列）：丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒（蛋白芯片法）；多肿瘤标志物检测试剂盒（蛋白芯片法）（第五类）单抗类试剂血型定型类试剂：血型定型试剂盒（单克隆抗体）免疫组化：ImmuChem免疫组化试剂盒（单抗）免疫比浊：血清载脂蛋白A1免疫比浊试剂盒乳胶凝集：D-dimer二聚体乳胶凝集试剂盒（第六类）多抗类试剂血型定型类试剂：血型定型试剂盒（人血清/马血清）免疫组化：癌胚抗原检测试剂盒（多抗）免疫比浊：-微球蛋

3、白测定试剂盒（免疫比浊法）乳胶凝集：沙门氏菌乳胶凝集试剂盒（第七类）诊断血清（菌液）诊断血清：侵袭性大肠埃希氏菌诊断血清；志贺氏菌属四种混合多价血清诊断菌液：伤寒沙门菌菌体（O）抗原、鞭毛（H）抗原诊断菌液（第八类）血球凝集类试剂抗体致敏血球：破伤风抗体诊断试剂（血凝法）；白喉抗体诊断试剂（血凝法）（第九类）核酸扩增类试剂荧光PCR：乙型肝炎病毒核酸定量测定试剂盒PCR-ELISA：结核分支杆菌检测试剂盒（核酸扩增酶联免疫法）PCR-毛细管电泳：性染色体多倍体（分型与突变）检测试剂盒；PCR-电泳：-地中海贫血基因诊断试剂盒（gap-PCR法）转录介导扩增（TMA）：沙眼衣原体与结核分枝杆菌检

4、测试剂盒第十类）基因芯片（微阵列）类试剂基因芯片（微阵列）：-地中海贫血基因芯片诊断试剂盒PCR-杂交：人乳头瘤病毒基因分型检测试剂盒（PCR-反向杂交法）（第十一类）探针放大（原位杂交）类试剂bDNA类：HIV-1bDNA检测试剂盒；mRNA检测试剂盒(生物素原位杂交法)（第十二类）普通生化类试剂（十万级要求）（包括酶类化学试剂、凝血试剂类等试剂）酶类化学试剂:丙氨酸氨基转移酶（ALT）测定试剂盒；碱性磷酸酶（ALP）测定试剂盒凝血试剂:凝血酶原时间（PT）测定试剂盒；组织纤溶酶原激活物（t-PT）测定试剂盒（第十三类）普通生化类试剂（清洁环境）（包括一般化学试剂、血气电解质类、血液分析仪用

5、试剂类等）一般化学试剂：无机离子（铝、镉等）测定试剂盒；白蛋白测定试剂盒（BCG法）；总胆固醇测定试剂盒（COD-CE-PAP法）血气电解质:电解质分析仪随机试剂；生化分析仪用稀释液、冲洗液血液分析仪用试剂:血液分析仪用稀释液、溶血剂（第十四类）干化学类试剂干化学试剂（条、卡或盒）：干化学尿液分析试纸条；尿微量白蛋白（UALB）测试卡（第十五类）药敏类试剂药敏纸片（卡）：抗生素药敏纸片；随机专用药敏试剂（盒）（卡）（第十六类）培养基类马丁干粉培养基；人胚胎干细胞无血清培养基 我国体外试剂的几个发展阶段我国体外试剂的几个发展阶段1 七十年代末，七十年代末， 乳胶凝集，血球凝乳胶凝集，血球凝(PH

6、A,RPHA）2 八十年代初期，放射免疫测定八十年代初期，放射免疫测定(RIA)， 抗抗HBs单克隆抗体单克隆抗体3 八十年代中期，酶联免疫试剂，基因工程表达乙肝八十年代中期，酶联免疫试剂，基因工程表达乙肝 病毒核心抗原和病毒核心抗原和e抗原抗原4 九十年代，九十年代， 聚合酶链反应聚合酶链反应(PCR)，丙肝，戊肝，丙肝，戊肝 病毒基因被克隆，各种基因工程抗病毒基因被克隆，各种基因工程抗 原被应用原被应用5 近期，近期， 发光免疫发光免疫,生物芯片技术生物芯片技术(基因芯片，基因芯片， 蛋白芯片蛋白芯片)（第一类）酶联免疫（酶标板、磁珠、微粒子）类试剂 酶联免疫法：乙型肝炎病毒e抗体诊断试剂

7、盒（酶联免疫法）； 癌胚抗原定量测定试剂盒(免疫荧光法) 化学发光法：人生长激素（GH）定量测定试剂盒 增强化学发光免疫分析法：巨细胞病毒抗体检测试剂盒 时间分辨荧光法：游离甲状腺素（FT4）定量测定试剂盒 电化学发光法：甲型肝炎病毒抗体诊断试剂盒 微粒子酶免法：丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒酶联免疫试剂 抗原抗体之间的特异反应与酶的高效催化反应有机的结合。固相样品放大 抗原抗体抗抗体-酶-底物-显色 抗体抗原抗体-酶-底物-显色酶标板酶标板样品中样品中HCV 抗原抗原HRP 酶标记抗酶标记抗HCV抗体抗体抗抗 HCV 抗体抗体HRP酶酶单克隆抗体单克隆抗体丙肝抗原ELISA试剂HIV-1p24抗

8、原检测试剂的原理 1 双抗体夹心法应用双抗体夹心法应用 HBsAg, HBeAg, HBcAg, pres1, pres22 双抗原夹心法双抗原夹心法 应用应用 抗抗HBs，抗，抗HIV 3竞争法竞争法 应用应用 抗抗HBc, 抗抗pres2 4 中和抑制法中和抑制法 应用应用 抗抗Hbe 5 捕获法捕获法 应用应用 抗抗HBc IgM 6 间接法应用间接法应用 抗抗HCV, 抗抗HEV, 几种主要的酶联免疫方法模式几种主要的酶联免疫方法模式 鲁米诺及其衍生物的增敏化学发光系统（鲁米诺及其衍生物的增敏化学发光系统（HRPHRP） NH2NHONHONH2NHNHOOOOH-N2NH2OOOOH

9、*NH2OOOOH+光鲁米诺及其衍生物的增强剂（鲁米诺及其衍生物的增强剂（EnhancerEnhancer）+电化学发光法原理电化学发光法原理 在电场的作用下，三丙胺 （TPA） 被氧化成阳离子自由基TPA+，后者很不稳定，可自发失去一个质子（H+），形成自由基TPA，这是一种很强的还原剂，可将一个电子给三价的三联吡啶钌衍生物 Ru(bpy)33+，使其形成激发态的Ru(bpy)32+，而TPA自身被氧化成二丙胺和丙醛。 激发态的Ru(bpy)32+通过荧光机制衰减，发射出一个波长620nm的光子，重新生成基态的Ru(bpy)32+。该过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，光电倍增管检测

10、光强度，光强度与Ru(bpy)32+的浓度呈线性关系，故可测出待测抗原的含量。 时间分辨荧光增强原理时间分辨荧光增强原理优点：结构简单，运行成本低优点：结构简单，运行成本低缺点：明显的易产生交叉污染，工作效缺点：明显的易产生交叉污染，工作效率受限。率受限。生产厂商产品技术类型反应体系产品特点仪器类型ROCHE电化学发光、磁微珠肿瘤标志物E170ABBOTT化学发光、磁微珠碱性磷酸酶、吖啶酯乙肝项目I2000Bayer化学发光、磁微珠吖啶酯内分泌项目ADVIACentaurBeckman化学发光、磁微珠碱性磷酸酶UniCelDxI800DPC化学发光、塑料球碱性磷酸酶药物分析Immuline20

11、00强生化学发光辣根过氧化物酶丙肝生物梅里埃化学发光碱性磷酸酶HIVPE(Wallac)时间分辨荧光（第二类）胶体金（硒、乳胶）类试剂 胶体金法：梅毒抗体-乙肝表面抗原诊断试剂盒 胶体硒法：HIV(1+2+0)试剂盒胶体金试剂原理硝酸纤维膜加样检测区对照区(HBsAg)-玻璃纤维膜-抗HBs羊抗鼠鼠抗HBs胶体金免疫层析法反应示意图胶体金免疫层析法反应示意图吸样垫胶体金垫包被T线包被C线上样垫NC膜支撑物HIV胶体金类快速诊断试剂检测结果第三类）免疫印迹试剂 免疫印迹试剂盒:风湿病自身抗体检测试剂盒（免疫印迹法）免免 疫疫 印印 迹迹 法法 示示 意意 图图q 用于用于RR样品的样品的HCV抗

12、体确认抗体确认q 独特的独特的IgG（I/II）及）及hSOD内部质控设计内部质控设计q 用于检测的固相化抗原用于检测的固相化抗原 重组表达蛋白重组表达蛋白：c33c，NS5 合成肽抗原合成肽抗原：c100p（5-1-1p），），c22pIgG control IIIgG control IIDc100(p)5-1-1(p)c33cc22(p)hSODNS5RIBA HCV 3.0c100-3NS5c33cc22-3SOD3+ Control1+ ControlPosINDPosNegINDRIBA模式图模式图3 + control band (serum addition)CapsidNS3

13、-1NS3-2NS4NS51+ control band(reagent addition)GLD HCV BLOT 3.0（第四类）蛋白芯片（微阵列）类试剂 蛋白芯片（微阵列）：丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒（蛋白芯片法）； 多肿瘤标志物检测试剂盒（蛋白芯片法）每张芯片检测48个样本，每个样本同时检测5个指标，丙型肝炎病毒分片断抗体检测蛋白芯片NS4NS4NS3NS3CC总总NS5NS5（C代表核心,NS3,NS4,NS5代表非结构区抗原）阳性对照阴性对照空白对照（第五类）单抗类试剂 血型定型类试剂：血型定型试剂盒（单克隆抗体） 免疫组化：ImmuChem免疫组化试剂盒（单抗） 免疫比浊：血清载

14、脂蛋白A1免疫比浊试剂盒 乳胶凝集：D-dimer二聚体乳胶凝集试剂盒（第六类）多抗类试剂 血型定型类试剂：血型定型试剂盒（人血清/马血清） 免疫组化：癌胚抗原检测试剂盒（多抗） 免疫比浊：-微球蛋白测定试剂盒（免疫比浊法） 乳胶凝集：沙门氏菌乳胶凝集试剂盒抗原 抗原：指进入有免疫活性的组织（宿主）而引发免疫应答的物质。或虽不能引发免疫，但可以同抗体结合的物质。蛋白质，多糖，核酸，糖脂，青霉素 全抗原性具有多个抗原决定族抗体 宿主对体内存在的外来分子，微生物或其他因子的应答而产生的蛋白质（免疫球蛋白，丙种球蛋白） 根据抗体性质：多克隆抗体，单克隆抗体 根据抗体分子结构：IgA,D,E,G,MI

15、gGIgM抗体模式图抗体模式图单克隆抗体 由一株淋巴细胞产生，针对一种抗原决定族 抗原免疫小鼠-取脾脏-与瘤细胞融合-克隆筛选-单克隆抗体细胞株 扩增细胞-注射入小鼠腹腔-采腹水-纯化抗体流流程程杂交瘤技术杂交瘤技术多克隆抗体 针对多个抗原决定族 抗原免疫动物-采集动物血清 纯化抗体 血型血型 抗原抗原/RBC 抗体抗体/外周血外周血 A A anti-B B B anti-A O none anti-A & anti-B AB A & B noneABO血型测定血型测定空气柱空气柱玻璃珠玻璃珠反应舱反应舱试剂试剂（第七类）诊断血清（菌液） 诊断血清：侵袭性大肠埃希氏菌诊断血清； 志贺氏菌属四

16、种混合多价血清 诊断菌液：伤寒沙门菌菌体（O）抗原、鞭毛（H）抗原诊断菌液诊断血清工艺流程诊断血清工艺流程采集血清收集抗体（离心机）效价检测等分装、冻干免疫动物免疫抗原制备分离血清灭活处理吸收非特异性抗体吸收用抗原制备诊断菌液工艺流程诊断菌液工艺流程效价检测等效价检测等分装、包装分装、包装细菌培养细菌培养灭活处理灭活处理（第八类）血球凝集类试剂 抗体致敏血球：破伤风抗体诊断试剂（血凝法）； 白喉抗体诊断试剂（血凝法）间接凝集试验示意图间接凝集试验示意图+ 用可溶性抗原致敏红细胞或其它颗粒性介质，可以用可溶性抗原致敏红细胞或其它颗粒性介质，可以用来测定细菌、病毒等微生物的抗体用来测定细菌、病毒等

17、微生物的抗体。间接血凝试剂基本生产工艺流程间接血凝试剂基本生产工艺流程 醛化红细胞的制备醛化红细胞的制备致敏抗原或抗体的制备致敏抗原或抗体的制备红细胞的采集红细胞的采集致敏抗原（或抗体）的制备致敏抗原（或抗体）的制备 红细胞的醛化红细胞的醛化（洗涤、离心、醛化）（洗涤、离心、醛化）致敏抗原（或抗体）的检定致敏抗原（或抗体）的检定对照血球的制备对照血球的制备 红细胞的致敏红细胞的致敏（鞣化、致敏、封闭）（鞣化、致敏、封闭）稀释液的制备稀释液的制备半成品检定半成品检定分装、冻干、包装分装、冻干、包装成品检定成品检定（第九类）核酸扩增类试剂 荧光PCR：乙型肝炎病毒核酸定量测定试剂盒 PCR-ELI

18、SA：结核分支杆菌检测试剂盒（核酸扩增酶联免疫法） PCR-毛细管电泳：性染色体多倍体（分型与突变）检测试剂盒； PCR-电泳：-地中海贫血基因诊断试剂盒（gap-PCR法） 转录介导扩增（TMA）：沙眼衣原体与结核分枝杆菌检测试剂盒PCR基本原理示意图PCR过氧化过氧化物酶联物酶联物物96孔酶标法孔酶标法加样加样分析分析观察观察数据数据96孔酶标法孔酶标法Polymerization5 5 3 3 5 Forward Primer5 Reverse PrimerStrand Displacement5 5 3 3 5 5 P 3 RQRQProbeP 3 RQCleavage5 5 3 3

19、5 5 P 3 RQPolymerizationCompleted5 5 3 3 5 5 P 3 RQReporterQuencherContinuouscyclingDegrade RNA with RNase H activityand primer 2 hybridizesChiron Procleix HIV-1/HCV AssayStep 2: Transcription-Mediated AmplificationRNA transcription by RNA polymeraseRNA amplification productIsothermalincubation109 f

20、oldamplificationin one hourcDNA synthesis by reverse transcriptaseDNA synthesis by reverse transcriptase Target RNAPromoter-primer hybridizes（第十类）基因芯片（微阵列）类试剂 基因芯片（微阵列）：-地中海贫血基因芯片诊断试剂盒 PCR-杂交：人乳头瘤病毒基因分型检测试剂盒（PCR-反向杂交法）基因芯片法联合检测基因芯片法联合检测HBV DNAHCV RNA 乙型肝炎病毒基因多态性检测芯片芯片外观及点样区示意图如上：芯片外观及点样区示意图如上：点阵信息：点

21、阵信息：点阵信息：点阵信息：A1: 1896A1: 1896野生型野生型 B1: 1896 B1: 1896 突变型突变型A2: 1814A2: 1814野生型野生型 B2: 1814 B2: 1814 突变型突变型A3: 1762A3: 1762野生型野生型 B3: 1762 B3: 1762 突变型突变型A4: 1764A4: 1764野生型野生型 B4: 1764 B4: 1764 突变型突变型A5: PA5: P区区528528位位 野生型野生型 B5: PB5: P区区528528位突变型位突变型A6: PA6: P区区552552位位 野生型野生型 B6: PB6: P区区5525

22、52位位 突变型突变型A7: PA7: P区区552552位位 突变型突变型 B7B7： 阴性参照阴性参照 检测结果图1762/64位点联合变异丙型肝炎病毒基因分型检测芯片示意图：阳性内参照：阳性内参照I；：阴性内参照：阴性内参照I； ：阳性内参照：阳性内参照II；：阴性内参照：阴性内参照II。 A1: I型型 B1: I型型A2: 1a/2a B2: 1a/1b A3: 1b B3: 1 b A4: II型型 B4: II型型A5: 2a B5: 2aA6: 3a/3b B6: 3bA7: 3b B7: 6aA8： 阴性阴性 A8：阴性：阴性 丙型肝炎病毒基因分型芯片示意图（第十一类）探针放

23、大（原位杂交）类试剂 bDNA类：HIV-1bDNA检测试剂盒； mRNA检测试剂盒(生物素原位杂交法)探针放大类试剂探针放大类试剂-支链支链DNA技术技术病毒的病毒的RNA释放后加入微孔板中释放后加入微孔板中板孔中包被有可与病毒特异结合的一板孔中包被有可与病毒特异结合的一系列靶探针（系列靶探针（Target Probe），另一系列靶探针的一端可标记在游离的病毒），另一系列靶探针的一端可标记在游离的病毒核酸链上，另一端可与核酸链上，另一端可与bDNA结合结合bDNA信号放大信号放大加入酶标记物对结加入酶标记物对结合的合的bDNA进行标记进行标记经过清洗后加入底物进行反应，测定反应强度。经过清洗

24、后加入底物进行反应，测定反应强度。（第十二类）普通生化类试剂（十万级要求）（包括酶类化学试剂、凝血试剂类等试剂） 酶类化学试剂:丙氨酸氨基转移酶（ALT）测定试剂盒； 碱性磷酸酶（ALP）测定试剂盒 凝血试剂:凝血酶原时间（PT）测定试剂盒； 组织纤溶酶原激活物（t-PT）测定试剂盒普通生化类试剂普通生化类试剂(十万级要求十万级要求)（1）原理：原理： 临床普通生化类试剂是一类用于测定人血液、尿液等中各项生化临床普通生化类试剂是一类用于测定人血液、尿液等中各项生化指标的试剂。含有各种非特异性蛋白成分，要求在十万级洁净环指标的试剂。含有各种非特异性蛋白成分，要求在十万级洁净环境中生产。检测方法均

25、为比色法，方法学原理均为显色反应。境中生产。检测方法均为比色法，方法学原理均为显色反应。 产品涉及：产品涉及： 1、酶类：含酶、辅酶与牛血清白蛋白等、剂型为干粉或液体。、酶类：含酶、辅酶与牛血清白蛋白等、剂型为干粉或液体。 2、血凝类：试剂组分中含有其他活性类组分（如兔脑粉等）。、血凝类：试剂组分中含有其他活性类组分（如兔脑粉等）。生产工艺：原材料称量、溶解、定容、中试、分装、组装、成品生产工艺：原材料称量、溶解、定容、中试、分装、组装、成品检验。检验。 关键控制点：原料称量、配制、物料平衡。关键控制点：原料称量、配制、物料平衡。细则细则要求：应在要求：应在10万级净化环境中进行生产操作。万级

26、净化环境中进行生产操作。（第十三类）普通生化类试剂（清洁环境）（包括一般化学试剂、血气电解质类、血液分析仪用试剂类等） 一般化学试剂：无机离子（铝、镉等）测定试剂盒； 白蛋白测定试剂盒（BCG法）； 总胆固醇测定试剂盒（COD-CE-PAP法） 血气电解质:电解质分析仪随机试剂；生化分析仪用稀释液、冲洗液 血液分析仪用试剂:血液分析仪用稀释液、溶血剂普通生化类试剂（清洁环境）普通生化类试剂（清洁环境）原理：与普通生化试剂（十万级要求）类相同。原理：与普通生化试剂（十万级要求）类相同。产品涉及：无机离子检测、血气电解质类、血产品涉及：无机离子检测、血气电解质类、血液分析仪用试剂类等试剂。液分析仪

27、用试剂类等试剂。 工艺要求：除生产可在清洁环境中进行操作工艺要求：除生产可在清洁环境中进行操作外，生产工艺和关键控制点与普通生化试剂外，生产工艺和关键控制点与普通生化试剂（十万级要求）类相同。（十万级要求）类相同。（第十四类）干化学类试剂 干化学试剂（条、卡或盒）：干化学尿液分析试纸条； 尿微量白蛋白（UALB）测试卡干化学类试剂干化学类试剂原理：以滤纸为载体，将各种试剂组分浸渍后干燥，原理：以滤纸为载体，将各种试剂组分浸渍后干燥，作为试剂层，固定在支持物上，试纸上的各测试块与作为试剂层，固定在支持物上，试纸上的各测试块与被测样品中的成分发生酶化学反应，使试纸块发生不被测样品中的成分发生酶化学

28、反应，使试纸块发生不同的颜色变化，颜色深浅与样品中的成份含量成正比，同的颜色变化，颜色深浅与样品中的成份含量成正比，再由光电耦合元件对测试块的颜色进行判读，达到测再由光电耦合元件对测试块的颜色进行判读，达到测定样品中化学成分含量的目的。定样品中化学成分含量的目的。 生产工艺主要环节：生产工艺主要环节： 特定试剂的配制、试剂条的浸润、干燥、切割、分包装特定试剂的配制、试剂条的浸润、干燥、切割、分包装等；等； （第十五类）药敏类试剂 药敏纸片（卡）：抗生素药敏纸片；随机专用药敏试剂（盒）（卡）药敏类试剂药敏类试剂原理：是将抗菌药物吸收到特定的纸片中，然后置于已接种待测原理：是将抗菌药物吸收到特定的纸片中，然后置于已接种待测定菌的固体培养基上，抗菌药物通过向培养基内的扩散，抑制敏定菌的固体培养基上，抗菌药物通过向培养基内的扩散，抑制敏感细菌的生长，从而出现抑菌环（带）。由于药物扩散的距离越感细菌的生长，从而出现抑菌环（带）。由于药物扩散