第一章显微镜发展历史与主要技术参数

1、普通光学显微镜：普通光学显微镜：人的眼睛不能直接观察到比0.1mm更小的物体或物质的结构细节。在显微镜发明出来之前，人类关于周围世界的观念局限在用肉眼，或者靠手持透镜帮助肉眼所看到的东西。人要想看得到更小的物质结构，就必须利用工具，这种工具就是显微镜。 很早以前，人们就知道某些光学装置能够“放大”物体。比如在墨经里面就记载了能放大物体的凹面镜。公元前一世纪，人们就已发现通过球形透明物体去观察微小物体时，可以使其放大成像。后来逐渐对球形玻璃表面能使物体放大成像的规律有了认识。至于凸透镜是什么时候发明的，可能已经无法考证。凸透镜有的时候人们把它称为“放大镜”能够聚焦太阳光，也能让你看到放大后的物体

2、，这是因为凸透镜能够把光线偏折，形成放大的虚像。单个凸透镜能够把物体放大几十倍，这远远不足以让我们看清某些物体的细节。早在1590年，荷兰和意大利的眼镜制造者已经造出类似显微镜的放大仪器。1610年前后，意大利的伽利略和德国的开普勒在研究望远镜的同时，改变物镜和目镜之间的距离，得出合理的显微镜光路结构，当时的光学工匠遂纷纷从事显微镜的制造、推广和改进。大约在16世纪末，荷兰的眼镜商詹森（Zaccharias Janssen）和他的儿子把几块镜片放进了一个圆筒中，结果发现通过圆筒看到附近的物体出奇的大，这就是现在的显微镜和望远镜的前身。詹森制造的是第一台复合式显微镜。使用两个凸透镜，一个凸透镜把

3、另外一个所成的像进一步放大，这就是复合式显微镜的基本原理。1665年，英国科学家罗伯特胡克用他的显微镜观察软木塞切片的时候，惊奇的发现其中存在着一个一个“单元”结构，胡克把它们称作“细胞”。胡克的显微镜能够放大约140倍，其中加入粗动和微动调焦机构、照明系统和承载标本片的工作台等，使得操作更加方便。这些部件经过不断改进，成为现代显微镜的基本组成部分。意大利科学家伽利略最早把复式显微镜用于科学研究工作。 1610 年前后，他用复式显微镜研究昆虫，观察到了昆虫的复眼。 在这一时期，伽利略和德国的开普勒在研究望远镜的同时，改变物镜和目镜之间的距离，得出合理的显微镜光路结构，提出了“显微镜”这一术语。

4、荷兰人安东尼冯列文虎克（Anthony Von Leeuwenhoek ，1632-1723)制造的显微镜让人们大开眼界。他制造的显微镜其实就是一片凸透镜，而不是复合式显微镜。不过，由于他的技艺精湛，磨制的单片显微镜的放大倍数将近270倍，超过了以往任何一种显微镜。当列文虎克把他的显微镜对准一滴雨水的时候，他惊奇的发现了其中令人惊叹的小小世界：无数的微生物游曳于其中。他把这个发现报告给了英国皇家学会，引起了一阵轰动十八世纪时的显微镜都存在很大的像差和色差，成像很模糊。这时显微镜主要是在外观上的发展在外观上，几乎所有的显微镜的基座都连在一个木盒子上。盒子的作用很多:有的用来放一些常用物品;有的用

5、来放显微镜上的一些零件;更有甚者，被作为显微镜的镜箱。当显微镜不用时，把显微镜折叠后放进盒子里，就可以长期保存。 十八世纪中使用最广泛的显微镜:卡夫(Cuff)显微镜。 十九世纪，随着工业革命的进行，显微科学也同其它学科一起飞速发展起来。其主要的原因是机械的使用使透镜的质量大大提高，光学的发展使显微镜的结构更加符合光学原理。在这个世纪里，人们制造出了没有色差和像差的高质量显微镜以及分辨率极高的暗视野显微镜，从而带来了生物学和显微科学的革命。1850 年出现了偏光显微术。1876 年 Abbe( 阿比 ) ：剖析影像在显微镜中成像时所产生的绕射作用，试图设计出最理想的显微镜， 奠定了显微镜成像的

6、古典理论基础。 1886 年 Zeiss( 蔡斯 ) ：打破一般可见光理论上的极限，他的发明 - 阿比式及其它一系列的镜头为显微学者另辟一新的解像天地。 1893 年出现了干涉显微术； 代表性的显微镜有：Ladd的学生显微镜:这个显微镜由英国人WilliamLadd在1864年制造。它采用了当时最先进的齿轮调焦装置（这一装置在今天仍然被大多数光学显微镜所使用）。这个显微镜的镜臂上多出了一个在前几个世纪的显微镜上都看不到的东西-聚光镜。聚光镜的出现对显微科学的发展起到了重要的作用。因为聚光镜是后来的一些新型显微镜的重要结构之一。1684年前后，荷兰学者惠更斯设计并制造出结构简单而且效果较好的双透

7、镜目镜惠更斯目镜，至今仍然广泛地应用在各种普通显微镜上。19世纪中叶，高质量消色差浸液物镜的出现，使显微镜观察微细结构的能力大为提高。1827年阿米奇第一个采用了浸液物镜。19世纪70年代，德国人阿贝奠定了显微镜成像的古典理论基础。这些都促进了显微镜制造和显微观察技术的迅速发展，并为19世纪后半叶包括科赫、巴斯德等在内的生物学家和医学家发现细菌和微生物提供了有力的工具。在接下来的两个世纪中，复合式显微镜得到了充分的完善。20世纪初期的显微镜 19世纪中期的显微镜19世纪末至20世纪初，欧洲的一些科学家致力于提高显微镜的分辨率及观察效果，设计并制造出了反射镜、消色差物镜、大数值孔径物镜、油浸物镜

8、、暗视野聚光镜、偏光附件及补偿目镜等光学部件，使得显微镜的性能不断提高，应用范围越来越广泛。 随后，人们又利用光波动某些特性和现象，对成像光路作了改进。1902年艾夫斯奠定了现代双目镜的基本系统。如果仅仅凭借光的直线传播和折射等原理，我们可以想象出任意放大倍数的显微镜。但是光的波动性质使得光学透镜的诸多弊端原形毕露，而且即使消除掉透镜形状的缺陷，任何光学仪器仍然无法完美的成像。原因很简单：普通光学显微镜已经达到了分辨率的极限。光在通过显微镜的时候要发生衍射简单的说，物体上的一个点在成像的时候不会是一个点，而是一个衍射光斑。如果两个衍射光斑靠得太近，我们就没法把它们分辨开来。显微镜的放大倍数再高

9、也无济于事了。1.1.分辨率分辨率：指显微镜在25厘米的明视距离处，能分辨出标本上相互接近的两点间的最小距离的能力。对于使用可见光作为光源的显微镜，它的分辨率极限是0.2微米。任何小于0.2微米的结构都没法识别出来。2.反差：反差：指物体与背景之间的对比度。增大反差可使物体清晰可见 解决方法：a.对于无色样品，可以通过染色增强反差 b.利用特别设计的显微镜加强反差，如使用暗视野显微镜、相差显微镜、偏振光显微镜等复杂显微镜。在显微镜本身结构发展的同时，人们对于光学知识的不断积累，使得人们对显微镜的光学成像原理有了新的认识，并开始从新的角度来改进显微技术。人们在显微观察技术上典型的创新有： 185

10、0年出现了偏光显微术； 1893年出现了干涉显微术； 1935年荷兰物理学家泽尔尼克创造了相衬显微术，他为此在1953年获得了诺贝尔物理学奖。相衬显微镜 古典的光学显微镜只是光学元件和精密机械元件的组合，它以人眼作为接收器来观察放大的像。随着摄影技术和感光胶片、硅晶片等记录存储技术的产生和发展，人们开始把这些技术应用到显微镜装置中，以感光胶片作为可以记录和存储的接收器，代替人眼的直接观察。现代又普遍采用光电元件、电视摄像管和电荷耦合器等作为显微镜的接收器，配以微型电子计算机后构成完整的图像信息采集和处理系统，使得显微技术得到飞速发展和更加广泛的利用。带自动照相机的光学显微镜配有电脑设备的显微镜

11、光学显微镜的使用，使得人们用肉眼仅能够分辨0.1mm的物体的极限被突破，达到了0.2um。但是，这个厚度对于微观世界来说依然是很大的，不能满足人们对于微观世界的进一步探索的渴望。依据显微镜的成像原理，提高显微镜分辨率的途径之一就是设法减小光的波长，或者用具有更短波长的电子束来代替光。根据德布罗意的物质波理论，运动的电子具有波动性，而且速度越快，它的“波长”就越短。如果能把电子的速度加到足够高，并且汇聚它，就有可能用来放大物体。1938年，德国工程师Max Knoll和Ernst Ruska制造出了世界上第一台透射电子显微镜（TEM）。1952年，英国工程师Charles Oatley制造出了第

12、一台扫描电子显微镜（SEM）。电子显微镜是20世纪最重要的发明之一。由于电子的速度可以加到很高，电子显微镜的分辨率可以达到纳米级（10-9m）。很多在可见光下看不见的物体例如病毒在电子显微镜下现出了原形。透射式电子显微镜扫描电子显微镜用电子代替光，这或许是一个反常规的主意。但是还有更令人吃惊的。1983年，IBM公司苏黎世实验室的两位科学家Gerd Binnig和Heinrich Rohrer发明了所谓的扫描隧道显微镜（STM）。这种显微镜比电子显微镜更激进，它完全失去了传统显微镜的概念。很显然，你不能直接“看到”原子。因为原子与宏观物质不同，它不是光滑的、滴溜乱转的削球，更不是达芬奇绘画时候

13、所用的模型。扫描隧道显微镜依靠所谓的“隧道效应”工作。如果舍弃复杂的公式和术语，这个工作原理其实很容易理解。隧道扫描显微镜没有镜头，它使用一根探针。探针和物体之间加上电压。如果探针距离物体表面很近大约在纳米级的距离上隧道效应就会起作用。电子会穿过物体与探针之间的空隙，形成一股微弱的电流。如果探针与物体的距离发生变化，这股电流也会相应的改变。这样，通过测量电流我们就能知道物体表面的形状，分辨率可以达到单个原子的级别。因为这项奇妙的发明，Binnig和Rohrer获得了1986年的诺贝尔物理学奖。这一年还有一个人分享了诺贝尔物理学奖，那就是电子显微镜的发明者Ruska。STM工作原理模型第一代显微

14、镜：光学显微镜，极限分辨率是200纳米。由于光的衍射效应，分辨率受制于半波长，可见光的最短波长为0.4微米。 第二代显微镜：电子显微镜。1924年，德布罗意提出了微观粒子具有波粒二象性的假设，后来这种假设得到了实验证实。此后物理学家们利用电子在磁场中的运动与光线在介质中的传播相似的性质，研制成功了电子透镜，在此基础上于1933年发明了电子显微镜。TEM的点分辨率为0.20.5nm，晶格分辨率为0.10.2nm，扫描电镜的分辨率为610nm。它们的工作环境都要求高真空，并且使用成本很高，在一定程度上限制了电子显微镜的发展。第三代显微镜：扫描探针显微镜。80年代初期，IBM公司苏黎世实验室的G.B

15、inning 和H.Rohrer发明了扫描隧道显微镜，它的分辨率达到0.01纳米。STM的诞生，使人类第一次在实间观测到了原子，并能够在超高真空超低温的状态下操纵原子。因为这两项重大的意义，这两位科学家荣获了1986年的诺贝尔物理奖。在STM的基础上，又发明了原子力显微镜、磁力显微镜、近场光学显微镜等等，这些显微镜都统称扫描探针显微镜。因为它们都是靠一根原子线度的极细针尖在被研究物质的表面上方扫描，检测采集针尖和样品间的不同物理量，以此得到样品表面的形貌图像和一些有关的电化学特性。光学显微镜有多种分类方法，根据结构的复杂程度可以分为单式和复式显微镜两种：单式显微镜单式显微镜结构简单，通常仅由一

16、块或几块透镜组成，一般只进行一次放大，放大倍率和机械性能都不高。早期的显微镜是单式显微镜。复式显微镜复式显微镜的构造比较复杂，各类透镜由透镜组合有机结合而成，机械性能和自动化程度都较高。其结构不仅有物镜和目镜之分，还配有专用的照相目镜及相应的设备。现代显微镜多半是复杂显微镜。根据结构和功能的不同可以分为三种：普及型、专用型和高级型1.普及型普及型，这类显微镜结果相对简单，造价适中，普及性较好，通常用于教学、常规镜检和一般性研究工作。2.专用型专用型，这类显微镜是根据不同的光学原理设计而成的，专门用来在特定的环境下进行特殊的观察和研究，例如暗视场、相位差、微分干涉、荧光、偏光显微镜等。3.高级型

17、高级型，也叫研究型显微镜研究型显微镜，更高级一些的多用途显微镜又叫万能显微镜万能显微镜。这类显微镜大多配件齐全，附带多种物镜、目镜、聚光器及电影、照相设备和电脑系统等。按使用目镜的数目可分为:双目、单目和共览显微镜；按图像是否有立体感可分为立体视觉和非立体视觉显微镜；按光学原理可分为偏光、相衬和微差干涉对比显微镜等；按光源类型可分为普通光、荧光、紫外光、红外光和激光显微镜等；按接收器类型可分为目视、数码（摄像）显微镜等。常用的显微镜有双目体视显微镜、金相显微镜、偏光显微镜、紫外荧光显微镜等。双目体视显微镜：双目体视显微镜：是利用双通道光路，为左右两眼提供一个具有立体感的图像。它实质上是两个单镜

18、筒显微镜并列放置，两个镜筒的光轴构成相当于人们用双目观察一个物体时所形成的视角，以此形成三维空间的立体视觉图像。双目体视显微镜在生物、医学领域广泛用于切片操作和显微外科手术。金相显微镜是专门用于观察金属和矿物等不透明物体金相组织的显微镜。照明光束从物镜方向射到被观察物体表面，被物面反射后再返回物镜成像。这种反射照明方式也广泛用于集成电路硅片的检测工作。紫外荧光显微镜：紫外荧光显微镜：是用紫外光激发荧光来进行观察的显微镜。某些标本在可见光中觉察不到结构细节，但经过染色处理，以紫外光照射时可因荧光作用而发射可见光，形成可见的图像。这类显微镜常用于生物学和医学中。电视显微镜和电荷耦合器显微镜：电视显

19、微镜和电荷耦合器显微镜：是以电视摄像靶或电荷耦合器作为接收元件的显微镜。在显微镜的实像面处装入电视摄像靶或电荷耦合器取代人眼作为接收器，通过这些光电器件把光学图像转换成电信号的图像，然后对之进行尺寸检测、颗粒计数等工作。这类显微镜的可以与计算机联用，这便于实现检测和信息处理的自动化，多应用于需要进行大量繁琐检测工作的场合。扫描显微镜：扫描显微镜：是成像光束能相对于物面作扫描运动的显微镜。在扫描显微镜中依靠缩小视场来保证物镜达到最高的分辨率，同时用光学或机械扫描的方法，使成像光束相对于物面在较大视场范围内进行扫描，并用信息处理技术来获得合成的大面积图像信息。这类显微镜适用于需要高分辨率的大视场图

20、像的观测。显微镜和放大镜起着同样的作用，就是把近处的微小物体成一放大的像，以供人眼观察。只是显微镜比放大镜可以具有更高的放大率而已。物体位于物镜前方，离开物镜的距离大于物镜的焦距，但小于两倍物镜焦距。所以，它经物镜以后，必然形成一个倒立的放大的实像AB。 AB靠近F2的位置上。再经目镜放大为虚像AB后供眼睛观察。目镜的作用与放大镜一样。所不同的只是眼睛通过目镜所看到的不是物体本身，而是物体被物镜所成的已经放大了一次的像。 与望远镜相反，显微镜必须从距离很近、范围极小、厚度极薄且明亮清晰的样本上采集光线。因此显微镜不需要巨大的物镜。相反，显微镜的物镜很小，而且呈球形，这就意味着显微镜两侧的焦距都

21、要短得多。物镜将物体的图像对焦在显微镜镜筒内的不远处。随后图像由第二个透镜放大，这个透镜称为接目镜接目镜或目镜目镜，使物体如同在您眼前一般。 在镜检时，人们总是希望能清晰而明亮的理想图象，这就需要显微镜的各项光学技术参数达到一定的标准，并且要求在使用时，必须根据镜检的目的和实际情况来协调各参数的关系。只有这样，才能充分发挥显微镜应有的性能，得到满意的镜检效果。 显微镜的光学技术参数包括：数值孔径、分辨率、放大率、焦深、视场宽度、覆盖差、工作距离和图像亮度与视场亮度等等。这些参数并不都是越高越好，它们之间是相互联系又相互制约的，在使用时，应根据镜检的目的和实际情况来协调参数间的关系，但应以保证分

22、辨率为准。 数值孔径简写NA，数值孔径是物镜和聚光镜的主要技术参数，是判断两者（尤其对物镜而言）性能高低的重要标志。其数值的大小，分别标刻在物镜和聚光镜的外壳上。 数值孔径（NA）是物镜前透镜与被检物体之间介质的折射率（n）和孔径角（u）半数的正弦之乘积。用公式表示如下：NA=n.sin(u/2) 以空气为介质（干燥系）的物镜的NA值多在0.05-0.95之间。空气的折射率为n=1，二孔径角最大不能超过180度，否则会因为物镜工作距离等于零而无法工作。Sin(180/2)=1，所以空气介质的NA值小于1。用高倍显微镜观察时，若想增大NA值，孔径角是无法进一步增大的，唯一的办法是增大介质的折射率

23、n值。基于这一原理，就产生了水浸物镜和油浸物镜，因介质的折射率n值大于1，NA值就能大于1。 水的折射率为1.333，水浸系物镜的NA值最大可达到1.25。香柏油的折射率为1.515左右，因此一般油浸物镜的数值孔径最大值（NA值）为1.4，这个数值在理论上和技术上都达到了极限。目前，高级物镜用折射率高的溴萘作介质，溴萘的折射率为1.66,所以NA值可大于1.4。数值孔径与其他技术参数有着密切的关系，它几乎决定和影响着其他各项技术参数。它与分辨率成正比，与放大率成正比，与焦深成反比，NA值增大，视场宽度与工作距离都会相应地变小。这里必须指出，为了充分发挥物镜数值孔径的作用，在观察时，聚光镜的NA

24、值应等于或略大于物镜的NA值。 显微镜的分辨率是指能被显微镜清晰区分的两个物点的最小间距，又称鉴别率。其计算公式是=/NA 式中为最小分辨距离；为光线的波长；NA为物镜的数值孔径。可见物镜的分辨率是由物镜的NA值与照明光源的波长两个因素决定。NA值越大，照明光线波长越短，则值越小，分辨率就越高。 要提高分辨率，即减小值，可采取以下措施 （1）降低波长值，使用短波长光源。 （2）增大介质n值以提高NA值（NA=nsinu/2）。 （3）增大孔径角u值以提高NA值。 （4）增加明暗反差。 提高分辨率的效果显微镜的放大率也叫放大倍数，是指被检测物体经过物镜和目镜放大后，人眼所看到的最终图像的大小与物

25、体实际大小的比值。一般用长度来衡量。由于经过物镜和目镜的两次放大，所以显微镜总的放大率应该是物镜放大率和目镜放大率1的乘积： =1 显然，和放大镜相比，显微镜可以具有高得多的放大率，并且通过调换不同放大率的物镜和目镜，能够方便地改变显微镜的放大率。 放大率也是显微镜的重要参数，但也不能盲目相信放大率越高越好。显微镜放大倍率的极限即有效放大倍率。 分辨率和放大倍率是两个不同的但又互有联系的概念。有关系式：500NA1000NA 当选用的物镜数值孔径不够大，即分辨率不够高时，显微镜不能分清物体的微细结构，此时即使过度地增大放大倍率，得到的也只能是一个轮廓虽大但细节不清的图像，称为无效放大倍率。反之

26、如果分辨率已满足要求而放大倍率不足，则显微镜虽已具备分辨的能力，但因图像太小而仍然不能被人眼清晰视见。所以为了充分发挥显微镜的分辨能力，应使数值孔径与显微镜总放大倍率合理匹配。根据：总放大率=物距/物镜焦距相距（250mm）/目镜焦距；增大物距即镜筒长度，可以提高放大率，但是镜筒不能无限拉长，通常国际标准长度为160mm。焦深为焦点深度的简称，即在使用显微镜时，当焦点对准某一物体时，不仅位于该点平面上的各点都可以看清楚，而且在此平面的上下一定厚度内，也能看得清楚，这个清楚部分的厚度就是焦深。焦深大,可以看到被检物体的全层，而焦深小，则只能看到被检物体的一薄层，焦深与其他技术参数有以下关系： （

27、1）焦深与总放大倍数及物镜的数值孔径成反比。 （2）焦深大，分辨率降低。 观察显微镜时，所看到的明亮的圆形范围叫视场，它的大小是由目镜里的视场光阑决定的。 视场直径也称视场宽度，是指在显微镜下看到的圆形视场内所能容纳被检物体的实际范围。视场直径愈大，愈便于观察。 有公式F=FN/ 式中F:视场直径，FN：视场数（FieldNumber,简写为FN，标刻在目镜的镜筒外侧），:物镜放大率。 由公式可看出： （1）视场直径与视场数成正比。 （2）增大物镜的倍数，则视场直径减小。因此，若在低倍镜下可以看到被检物体的全貌，而换成高倍物镜，就只能看到被检物体的很小一部份。 不同目镜的视场直径显微镜的光学系统也包括盖玻片在内。由于盖玻片的厚度不标准，光线