质粒构建流程.doc

1、质粒构建流程一、引物设计1）取得目的基因序列，可选用数据库 NCBI2）软件分析目的基因可用酶切位点。使用 primer5分析出序列不包含的酶切位点，即为可 用没切位点。3）选择载体。根据转染细胞和实验室资源，选择合适载体。如 pcDNA3.1（+）,4）选择酶切位点。对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点，选择二者共有的作为备选。载体上两个酶切位点的距离应有几十bp以上，选实验室常用酶切位点。5）使用primer5设计目的基因引物，目的产物应包含从启动子到终止子全部碱基。6）根据选择的酶切位点，查找对应的酶切位点保护碱基，将对应片段添加到设计的引物两端，注意酶切位点的前后顺序。一般选择三

2、个保护碱基。7）引物设计完成，送公司合成。、目的片段获取1. RNA提取试剂盒：Bioteke高纯总RNA快速提取试剂盒 离心柱型（裂解液RL 4C、漂洗液RW -20 C 保存）准备：冰盒、4 c预冷离心机、EP管2套、吸附柱 RA 一套操作步骤：1）将1000 M裂解液RL加入细胞中，混合 5min。2）加200 d氯仿混合，震荡15s,室温孵育3min。3） 4C, 12000rpm 离心 10min。4）最上层水相转移至新 EP管中（体积约550 M）5）加入1倍体积（550 pl） 70%乙醇，混匀6）全部转移到套收集管的吸附柱RA中，4C, 10000rpm离心45s 7）弃废液，

3、重套收集管，力口 500 口去蛋白液 RE, 12000rpm离心45s8）弃废液，重套收集管，加 700 口去漂洗液RW, 12000rpm离心60s9）弃废液，重套收集管，加 500 口去漂洗液 RW, 12000rpm离心60s10）弃废液，重套收集管，12000rpm空离2min11）吸附柱放入新 EP管，力口 50RNase free water于膜上，室温放置 2min 12） 4 C, 12000rpm 离心 60s13）点样：5 M RNA+ 1 J 10x buffer, 1.5%琼脂糖凝胶电泳，100V, 3min ,可见3条亮带。14） -20C 保存2. RNA反转录试

4、剂盒：TaKaRa primescript RT reagent kit with gDNA eraser （-20 C保存）准备：冰盒，取出解冻，为酶不可取出，预冷离心管操作步骤：1）基因组DNA去除（10J体系） 5 x gDNA eraser buffer2 gDNA eraser1 口Total RNA4 M（可根据RNA浓度调整） RNase free water3 JPCR仪中进行，程序： 42 C, 2min-4 c注：RNA的量可根据浓度调整，混合液冰上配制，酶最后加入2）反转录反应（20体系） 5 x primerScript buffer 24 M primerScript

5、 RT enzyme mix I 1 口 RT primer mix1 RNase free water4 口1）反应液10力PCR 仪：37 C, 15min - 85C, 5s 4 c注：可直接将第2步反混合液好后加入到第1步反应液中3） 1.5mlEP管收集，-20 C长期保存3. PCR扩增高保真酶primerstar扩增，50体系如下：5X PS buffer10MPCR程序：dNTP4M95 c5min 、dH2O32.5 d95 c30sPrimerstar0.5 J56 c30s j35cyclecDNA14口受）72 c1minR-primer1 d72 c10minF-pr

6、imer1 H注：可根据不同基因调节退货温度，延伸时间，循环数。点样：5d PCR产物+ 1 4 6 x buffer, 1.5%琼脂糖凝胶电泳，100V, 15min4） PCR产物纯化1）液相纯化（产物电泳结果只含目的条带）试剂盒：Microelute cycle-pure spin protocol（OMEGA bio-tek） D6293-01 将PCR产物加入1.5mlEP管，加入5倍体积buffer CP,混匀。 转移至 HiBind MicroElution DNA 柱（套收集管）,室温离心 10000g, 1min。 弃废液，力口 700 口 DNA wash buffer （

7、含乙醇）到柱子，室温离心10000g, 1min。弃废液，重复 弃废液，空管离心 13000g, 1min柱子放入新 EP管，加10-20 M Elution buffer到膜上，室温孵育 3-5min ,离心10000g, 1min电泳检测2）割胶回收（产物电泳结果含杂带）将含目的条带的琼脂糖凝胶切下（切得尽量小），放入1.5ml EP管。 加等体积（1g=1ml） binding buffer （XP2） ,60C金属浴7min左右至胶溶解（溶液为淡黄 色），混匀2min 溶液加入离心柱，离心 10000g, 1min ,废液倒回再离一次 弃废液，力口 300 口 binding buff

8、er （XP2）,离心 10000g, 1min 弃废液，力口 700 口 SPW washing buffer ,离心 10000g, 1min重复 空管离心13000g, 2min,弃废液，柱子转移到新 EP管加入 30-50（1 elution buffer 于膜上，室温孵育 1min,离心 13000g, 1min电泳检测三、双酶切30（J反应体系如下:PCR纯化产物15MVector12 d10X M/L/K buffer3 口10 x M/L/K buffer3 J3dH2O1043dH2O13i酶A1 M酶A1 M酶B1 4酶B1 M反应条件：takara酶30c水浴1h65c金

9、属浴10min终止反应 注：buffer类别依使用的酶具体选择，见附表四、连接1）双酶切后，可将质粒酶切产物琼脂糖电泳1-2 M2）酶切产物液相纯化3） 20 d连接体系（皆可）PCR产物5 UPCR产物6.31pcDNA3.12日pcDNA3.10.710X T4buffer2M10 x T4buffer2日T4 ligase1 uT4 ligase1 d3dH2O10d3dH2O孙PCR仪中进行：22 C, 30min 4 c冰箱过夜注：连接产物-20 C可长期保存五、转化准备：碎冰，灭菌 EP管、LB空液体培养基，带抗性培养板，超净工作台，移液枪，水浴 锅加热42 C1）将感受态细胞置于

10、冰上，待其融化2）超净工作台中，将连接产物10 d加入100式感受态细胞，或质粒 1-3 M加入100 M感受态细胞3）轻混匀，冰浴 30min4）热击水浴 42 C, 45s,冰浴1min5）力口 900 d LB 空培养基，摇菌 150rpm, 37 C , 1h6）浓缩离心13000rpm, 1min,上清液留约200 M重悬菌体，部分涂板（50-100日）7）完全吸收后，37 c倒置培养12-16h六、菌落PCR1）以rTaq酶50 d体系配制PCR反应液，每个 PCR管分装15 口，体系如下：3dH2O35.7 dPCR程序：10X buffer5M95 c5minMgCl23M95

11、 c30s ,dNTP4M56 c30s" 35cyclerTaq0.3 pl72 c1minR-primer1 u72 c10min注：程序与DNA扩土歆-样F-primer1 "2）灭菌牙签挑单菌落放入PCR体系中搅一下，再在新板划板（注意编号），每板挑10个菌。新划的板37 c倒置培养12-16h。3）琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产物，记录含目的条带的菌落号备用。七、测序1 .摇菌1） PCR检测有目的条带白菌落，挑选2-3个较好的以供摇菌2）三角瓶中分装10ml LB抗性液体培养基3）用10 口枪头挑起选择的菌落打到培养基中4 ） 37 Co 250rpm 摇菌 12

12、-16h5 .送样每瓶取1ml管液，送华大基因测序6 .比对将测序结果与基因序列进行比对，比对正确则构建成功，比对错误则重新构建。（注：数据库中基因序列可能有误，若出现少数突变，可换其他数据库比对试试）八、国种保存菌种比对成功，则可保存菌种备用。1）超净工作台中取 1.5mlEP管，力口 200 M 80%灭菌甘油。2）再加入800 M管液，轻混匀。3）液氮冻存。（一个基因冻2管即可）九、质粒提取菌种比对成功，冻存菌种后，管液用于提取质粒。试剂盒：AXYGEN axyprep plasmid miniprep kit 250-prep操作步骤：1）取3-5ml管液，室温下离心 10000g,

13、1min2）弃上清，力口 250（1 solution I/ RNase A 重悬菌落，混匀3）加250solution II ,倒置轻混匀，孵育 2min。（整个裂解反应不超过5min）4）加入250solution III ,立即倒置混匀，直到生成白色絮状沉淀。5）室温离心 13000g, 10min6）上清液小心转入 HiBind miniprep column（有套管），室温离心 10000g, 1min7）弃废液，力口 500 U buffer HB ,室温离心 10000g, 1min8）选择性步骤：重复第 7步9）弃废液，空管室温离心 13000g, 2min 10）柱子转入新

14、EP管，力口 30-50 口 elution buffer或3dH20到膜上，室温孵育 1-2min11）室温离心 13000g, 1min12）提取的质粒-20 C保存备用附：感受态制备方法（皆采用LB 空白培养基）：1. 菌种活化1）用接种环直接取冻存的E.coli/ DH5 a菌种，在LB平板上划线，37c倒置培养16h2）挑单菌落转到2-10ml LB 液体培养基中，摇菌37，250rpm， 12-16h3）取1ml管液加入到100ml LB液体培养基，摇菌 37 C , 250rpm , 3h4）检测管液 OD600W0.5 （0.3-0.4）2. 感受态制备准备： 0.1M CaC

15、l 2灭菌， 50ml 离心管灭菌，冰水，1.5ml 离心管冰上预冷，离心机4预冷。步骤：1）将管液用50ml离心管分装，调平，4c离心3000rpm , 8min2）弃上清，0.1M CaCl210ml 重悬（冰水中进行，动作轻），两管合成一管3）冰上放置一段时间，4离心2500rpm， 8min4）弃上清，0.1M CaCl 2 10ml 重悬，4冰箱过夜沉淀5）上清液取出8ml,剩2ml,加670 口 80%甘油（管液：80%甘油=3:1）,轻混匀6） 1.5mlEP管分装，每管分装 100 口，液氮冻存。试剂配制:1 .琼脂糖凝胶（1.2%）琼脂糖粉0.6g2 X TAE50ml微波炉加热溶解，冷却一会儿后加入1口 gold view核酸染料，混匀，倒板3 .电泳缓冲液 TAE （50X