第03章 显微镜课件

1、 第三章第三章 显微镜显微镜掌握常掌握常用显微用显微镜的结镜的结构及性构及性能特点能特点熟悉显微熟悉显微技术的基技术的基础理论，础理论，显微镜的显微镜的应用应用了解显微了解显微镜的维护，镜的维护，显微技术显微技术的进展的进展教教 学学 基基 本本 要要 求求内内 容容 提提 要要第一节第一节 光学显微镜光学显微镜第二节第二节 电子显微镜电子显微镜第三节第三节 特殊特殊显微镜显微镜第四节第四节 显微镜的性能参数、使用、维护显微镜的性能参数、使用、维护、常见故障及排除常见故障及排除第一节第一节 光光 学学 显显 微微 镜镜一、光学显微镜的工作原理一、光学显微镜的工作原理二、光学显微镜的基本结构二、

2、光学显微镜的基本结构三、光学显微镜的性能参数三、光学显微镜的性能参数四、光学显微镜的不足之处四、光学显微镜的不足之处一、光学显微镜的工作原理一、光学显微镜的工作原理 显微镜是由两组会聚透镜组成的光学折射成像系统。把显微镜是由两组会聚透镜组成的光学折射成像系统。把焦距较短、靠近观察物、成实像的透镜组称为物镜（焦距较短、靠近观察物、成实像的透镜组称为物镜（object lens），而焦距较长，靠近眼睛、成虚像的透镜组称为目镜），而焦距较长，靠近眼睛、成虚像的透镜组称为目镜（ocular lens）。被观察物体位于物镜的前方，被物镜作第）。被观察物体位于物镜的前方，被物镜作第一级放大后成一倒立的实像

3、，然后此实像再被目镜作第二级一级放大后成一倒立的实像，然后此实像再被目镜作第二级放大，放大， 得到最大放大效果的倒立的虚像，位于人眼的明视距得到最大放大效果的倒立的虚像，位于人眼的明视距离处。离处。光学显微镜的工作原理图光学显微镜的工作原理图二、光学显微镜的基本结构二、光学显微镜的基本结构三、光学显微镜的性能参数三、光学显微镜的性能参数(一一)数值孔径数值孔径(二二)分辨率分辨率(三三)放大率放大率(四四)视野视野(五五) 景深与焦长景深与焦长(六六)镜像亮度和清晰度镜像亮度和清晰度(七七)工作距离工作距离(一一) 数数 值值 孔孔 径径 数值孔径数值孔径(numerical aperture

4、)又叫镜又叫镜口率，是物体与物镜间媒质的折射率口率，是物体与物镜间媒质的折射率n与物与物镜孔径角的一半镜孔径角的一半()正弦值的乘积，通常缩正弦值的乘积，通常缩写为写为NA，即，即 NA=nsin 显微镜的数值孔径与其放大率成正比，显微镜的数值孔径与其放大率成正比，与分辨率、景深成反比，它的平方与图像与分辨率、景深成反比，它的平方与图像亮度成正比。亮度成正比。 NA=nsinNA=nsin 最高数值孔径最高数值孔径油浸物镜油浸物镜 较高数值孔径较高数值孔径干物镜干物镜 低数值孔径低数值孔径干物镜干物镜 油油油油(一一) 数数 值值 孔孔 径径 分辨率：显微镜的最重要参数，指透镜分辨率：显微镜的

5、最重要参数，指透镜能分辨两点之间的最小距离。能分辨两点之间的最小距离。D=0.61Nsin/2D：分：分 辨辨 率率 ：光波的波长：光波的波长N：介质折射率：介质折射率 ：物镜镜口角：物镜镜口角N与与D成反比成反比 ，与与D成正比成正比(二二) 分分 辨辨 率率提高显微镜分辨率的方法提高显微镜分辨率的方法 （1）增大物镜的数值孔径）增大物镜的数值孔径 在物镜和盖玻片之间充以在物镜和盖玻片之间充以n 较大的油，较大的油，如香柏油如香柏油n =1.52,不仅使不仅使n 增大，而且孔径增大，而且孔径角也增大。角也增大。 （2）用短波长的光照射）用短波长的光照射 如紫外光显微镜，电子显微镜。如紫外光显

6、微镜，电子显微镜。(三三) 放放 大大 率率 显微镜的放大率显微镜的放大率(amplification)或称放大倍数是或称放大倍数是指显微镜经多次成像后最终所成指显微镜经多次成像后最终所成(放大的放大的)像的大小相像的大小相对于原物体大小的比值，常记作对于原物体大小的比值，常记作M。 M=maq M是显微镜的总放大倍数；是显微镜的总放大倍数；m是物镜的放大倍数；是物镜的放大倍数；a是目镜的放大是目镜的放大倍率，一般表达为明视距离倍率，一般表达为明视距离(正常视力者为正常视力者为25cm)与目镜焦距之比；与目镜焦距之比；q为为在双目显微镜中所增设的棱镜所起的放大倍数，一般取值为在双目显微镜中所增

7、设的棱镜所起的放大倍数，一般取值为1.6倍。倍。 (四四) 视视 野野 视野视野(visual field)又称视场又称视场(field)，是指通过显微镜所能看到，是指通过显微镜所能看到标本所在空间的范围。标本所在空间的范围。 (五五) 景景 深深 与与 焦焦 长长 景深景深(depth of field)又称焦点深度，又称焦点深度，是指在成一幅清晰像的前提下，像平面是指在成一幅清晰像的前提下，像平面不变，景物沿光轴前后移动的距离称不变，景物沿光轴前后移动的距离称“景深景深”。 景物不动，像平面沿光轴前后移动景物不动，像平面沿光轴前后移动的距离称的距离称“焦长焦长”。 (六六) 镜镜 像像 亮

8、亮 度度 和和 清清 晰晰 度度 镜像亮度即显微镜的图像亮度的简称。镜像亮度即显微镜的图像亮度的简称。高倍率工作条件下的暗场、偏光、摄影显高倍率工作条件下的暗场、偏光、摄影显微镜等都需要足够的亮度，与照明及物镜微镜等都需要足够的亮度，与照明及物镜的性能参数相关。的性能参数相关。 镜像清晰度是指图像的轮廓清晰、衬镜像清晰度是指图像的轮廓清晰、衬度适中的程度。度适中的程度。 (七七) 工工 作作 距距 离离 工作距离是指从物镜前表面中心到被观察标本工作距离是指从物镜前表面中心到被观察标本间满足工作要求的距离范围，与物镜的数值孔径成间满足工作要求的距离范围，与物镜的数值孔径成反比。反比。 一般情况下

9、，物镜的数值孔径赿大，其工作距一般情况下，物镜的数值孔径赿大，其工作距离赿小。离赿小。四、光学显微镜的不足之处四、光学显微镜的不足之处1.1.放大倍数的极限放大倍数的极限 20002000 2.2.分辨率的极限分辨率的极限 0.20.2 m m （可见光照明）（可见光照明）3.3.景深的极限景深的极限 0.10.1 m m （要求金相准备）（要求金相准备）4.4.不能分析化学成分不能分析化学成分第第 二节二节 电电 子子 显显 微微 镜镜一、电子显微镜的基本结构一、电子显微镜的基本结构二、电子显微镜的分类及其应用二、电子显微镜的分类及其应用 一、电子显微镜的基本结构一、电子显微镜的基本结构 电

10、子光学系统电子光学系统 真空系统真空系统 供电系统供电系统 机械系统机械系统 观察显示系统观察显示系统照明系统照明系统成像系统成像系统（一）电子光学系统（一）电子光学系统-照明系统照明系统 电子光学系统主要由电子光学系统主要由电子枪电子枪和和聚光镜聚光镜组成。组成。 电子枪是发射电子的照明光源。电子枪是发射电子的照明光源。 聚光镜是把电子枪发射出来的电子会聚而成的交聚光镜是把电子枪发射出来的电子会聚而成的交叉点进一步会聚后照射到样品上。叉点进一步会聚后照射到样品上。 照明系统的作用就是提供一束亮度高、照明孔径照明系统的作用就是提供一束亮度高、照明孔径角小、平行度好、束流稳定的照明源。角小、平行

11、度好、束流稳定的照明源。 1. 电电 子子 枪枪 电子枪是电镜的电子发射源，其作用电子枪是电镜的电子发射源，其作用是形成电子束，并控制电子束的发射，获是形成电子束，并控制电子束的发射，获得一高亮度和高稳定度的照明电子光源。得一高亮度和高稳定度的照明电子光源。 常用的电子枪是热阴极三极电子枪，常用的电子枪是热阴极三极电子枪，它由发夹形钨丝阴极、栅极和阳极组成。它由发夹形钨丝阴极、栅极和阳极组成。 电子枪的结构及工作原理图电子枪的结构及工作原理图灯灯 丝丝2. 聚聚 光光 镜镜 聚光镜用来会聚电子枪射出的电子束，聚光镜用来会聚电子枪射出的电子束，以最小的损失照明样品，调节照明强度、以最小的损失照明

12、样品，调节照明强度、孔径角和束斑大小。一般都采用双聚光镜孔径角和束斑大小。一般都采用双聚光镜系统。第一聚光镜是强激磁透镜而第二聚系统。第一聚光镜是强激磁透镜而第二聚光镜是弱激磁透镜。光镜是弱激磁透镜。（一）电子光学系统（一）电子光学系统成像系统成像系统 电子透镜：能使电子束聚焦的装置电子透镜：能使电子束聚焦的装置 电子透镜是电镜的核心部件，其工作方式是电子透镜是电镜的核心部件，其工作方式是利用复杂的电极和线圈结构形成静电场和磁场。利用复杂的电极和线圈结构形成静电场和磁场。 电子透镜存在各种像差（电子透镜存在各种像差（aberrationaberration），这），这是影响成像质量的主要因素。

13、是影响成像质量的主要因素。 电子透镜电子透镜电电 子子 透透 镜镜 的的 结结 构构 电子电子电子源电子源电子轨迹电子轨迹铜导线铜导线软铁壳软铁壳软铁壳软铁壳焦点焦点(二二) 真真 空空 系系 统统 主要由机械泵、油扩散泵或离子泵、主要由机械泵、油扩散泵或离子泵、联动控制阀门、真空排气管道、空气联动控制阀门、真空排气管道、空气过滤器和用于真空度指示的真空测量过滤器和用于真空度指示的真空测量规等组成。规等组成。(三三) 供供 电电 系系 统统 供电系统包括高压电源、真空供电系统包括高压电源、真空系统供电电源、透镜电源、辅助系统供电电源、透镜电源、辅助电源及安全保护系统的电源等。电源及安全保护系统

14、的电源等。 (四四) 机机 械械 系系 统统 机械系统包括电镜座、标本室、机械系统包括电镜座、标本室、磁屏蔽外壳、镜筒、制冷系统及控制磁屏蔽外壳、镜筒、制冷系统及控制工作台等，这些部分都有着相当高的工作台等，这些部分都有着相当高的性能。性能。 (五五) 观观 察察 显显 示示 系系 统统 观察显示系统由荧光屏和照相室两部观察显示系统由荧光屏和照相室两部分组成。分组成。 电镜通过显像管的荧光屏把电子所成电镜通过显像管的荧光屏把电子所成的像转换成光学影像后供肉眼观察。的像转换成光学影像后供肉眼观察。 电子感光板是常用的记录手段之一，电子感光板是常用的记录手段之一，可以利用照相机在照相室内拍照。可以

15、利用照相机在照相室内拍照。二、电子显微镜的分类及其应用二、电子显微镜的分类及其应用电子显微镜的电子显微镜的（一）透（一）透 射射 电电 子子 显显 微微 镜镜（Transmission electron Microscope，TEM）光镜、透射电镜和扫描电镜的工作原理图光镜、透射电镜和扫描电镜的工作原理图1. 成成 像像 原原 理理电子束和固体样品的作用电子束和固体样品的作用2. 的的 工工 作作 原原 理理 透射电子显微镜是以电子束透过样品透射电子显微镜是以电子束透过样品经过聚焦与放大后所产生的物像，经过聚焦与放大后所产生的物像， 投射到投射到荧光屏上或照相底片上进行观察。荧光屏上或照相底片

16、上进行观察。 透射电镜的分辨率为透射电镜的分辨率为0.10.10.2nm0.2nm，放，放大倍数为几万几十万倍。大倍数为几万几十万倍。3. 的的 结结 构构 照明系统照明系统 成像系统成像系统 放大系统放大系统 纪录系统纪录系统电子枪电子枪聚光镜聚光镜物镜物镜中间镜中间镜投影镜投影镜3. 的结构的结构成像系统成像系统 物镜是用来形成第一幅高分辨率电子显微图物镜是用来形成第一幅高分辨率电子显微图像或电子衍射花样的透镜。透射电子显微镜分辨像或电子衍射花样的透镜。透射电子显微镜分辨本领的高低主要取决于物镜。因为物镜的任何缺本领的高低主要取决于物镜。因为物镜的任何缺陷都被成像系统中其它透镜进一步放大。

17、欲获得陷都被成像系统中其它透镜进一步放大。欲获得物镜的高分辨率，必须尽可能降低像差。通常采物镜的高分辨率，必须尽可能降低像差。通常采用强激磁，短焦距的物镜。用强激磁，短焦距的物镜。3. 的结构的结构成像系统成像系统 中间镜是一个弱激磁的长焦距变倍中间镜是一个弱激磁的长焦距变倍透镜，可在透镜，可在0 02020倍范围调节。在电镜操倍范围调节。在电镜操作过程中，主要是利用中间镜的可变倍作过程中，主要是利用中间镜的可变倍率来控制电镜的放大倍数。率来控制电镜的放大倍数。 3. 的结构的结构成像系统成像系统 如果把中间镜的物平面和物镜的像平面如果把中间镜的物平面和物镜的像平面重合，则在荧光屏上得到一幅放

18、大像，这就重合，则在荧光屏上得到一幅放大像，这就是电子显微镜中的成像操作。如果把中间镜是电子显微镜中的成像操作。如果把中间镜的物平面和物镜的后焦面重合，则在荧光屏的物平面和物镜的后焦面重合，则在荧光屏上得到一幅电子衍射花样，这就是电子显微上得到一幅电子衍射花样，这就是电子显微镜中的电子衍射操作。镜中的电子衍射操作。3. 的结构的结构成像系统成像系统 投影镜的作用是把经中间镜放大（或缩小）投影镜的作用是把经中间镜放大（或缩小）的像进一步放大，并投影到荧光屏上，它和物镜的像进一步放大，并投影到荧光屏上，它和物镜一样，是一个短焦距的强磁透镜。投影镜的激磁一样，是一个短焦距的强磁透镜。投影镜的激磁电流

19、是固定的。因为成像电子束进入投影镜时孔电流是固定的。因为成像电子束进入投影镜时孔镜角很小，因此它的景深和焦距都非常大。即使镜角很小，因此它的景深和焦距都非常大。即使改变中间镜的放大倍数，使显微镜的总放大倍数改变中间镜的放大倍数，使显微镜的总放大倍数有很大的变化，也不会影响图像的清晰度。有很大的变化，也不会影响图像的清晰度。4. 透透 射射 电电 镜镜 的的 主主 要要 部部 件件 样品台的作用是承载样品，并使样样品台的作用是承载样品，并使样品能作平移、倾斜、旋转，以选择感兴趣的品能作平移、倾斜、旋转，以选择感兴趣的样品区域或位向进行观察分析。样品区域或位向进行观察分析。 样品台样品台4. 透透

20、 射射 电电 镜镜 的的 主主 要要 部部 件件 消像散器可以是机械式的，可以是电磁式消像散器可以是机械式的，可以是电磁式的。机械式的是在电磁透镜的磁场周围放置几块的。机械式的是在电磁透镜的磁场周围放置几块位置可以调节的导磁体，用它们来吸引一部分磁位置可以调节的导磁体，用它们来吸引一部分磁场，把固有的椭圆形磁场校正成接近旋转对称的场，把固有的椭圆形磁场校正成接近旋转对称的磁场。电磁式的是通过电磁极间的吸引和排斥来磁场。电磁式的是通过电磁极间的吸引和排斥来校正椭圆形磁场的。校正椭圆形磁场的。 消像散器消像散器4. 透透 射射 电电 镜镜 的的 主主 要要 部部 件件 在透射电子显微镜中有许多固定

21、光在透射电子显微镜中有许多固定光阑和可动光阑，它们的作用主要是挡掉阑和可动光阑，它们的作用主要是挡掉发散的电子，保证电子束的相干性和照发散的电子，保证电子束的相干性和照射区域。射区域。光阑光阑5. 透射电子显微镜的优点透射电子显微镜的优点 主要优点：分辨率高，可用来主要优点：分辨率高，可用来观察组织和细胞内部的超微结构以观察组织和细胞内部的超微结构以及微生物和生物大分子的全貎。及微生物和生物大分子的全貎。 扫描电子显微镜的工作原理是用一束扫描电子显微镜的工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子由探测体收集，并出次级电子，次级电

22、子由探测体收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，再经光电在那里被闪烁器转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。的扫描图像。 2. 扫扫 描描 电电 镜镜 的的 结结 构构二次电子探测器的工作原理图二次电子探测器的工作原理图3. 扫扫 描描 电电 镜镜 的的 特特 点点分辨率高分辨率高(可达可达3nm)3. 扫扫 描描 电电 镜镜 的的 特特 点点立立体体感感强强3. 扫扫 描描 电电 镜镜 的的 特特 点点放大倍率范围广放大倍率范围广( (可放大十几倍到几十万

23、倍可放大十几倍到几十万倍) )脑细胞的实验小鼠脑细胞的实验小鼠3. 扫扫 描描 电电 镜镜 的的 特特 点点样品适应性大样品适应性大应用范围广应用范围广样品台样品台探针探针步进电机步进电机双螺旋双螺旋测微头测微头1.扫描隧道显微镜的工作原理扫描隧道显微镜的工作原理 扫描隧道显微镜是根据量子力学原理中的隧道扫描隧道显微镜是根据量子力学原理中的隧道效应和三维扫描而设计。当原子尺度的针尖在不到效应和三维扫描而设计。当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（外加一电压（2mV2mV2V2V），针尖与样品之间产生隧），针尖与

24、样品之间产生隧道效应而有电子逸出，形成隧道电流，通过隧道电道效应而有电子逸出，形成隧道电流，通过隧道电流获取显微图像，而不需要光源和透镜。流获取显微图像，而不需要光源和透镜。“扫描隧扫描隧道显微镜道显微镜”因此而得名。因此而得名。扫描隧道显微镜的工作原理图扫描隧道显微镜的工作原理图2. STM 的的 基基 本本 结结 构构 STM STM 仪器由具有减振系统的仪器由具有减振系统的STM STM 头部头部( (含探针和含探针和样品台样品台) )、电子学控制系统和包括、电子学控制系统和包括A/D A/D 多功能卡的计多功能卡的计算机组成。算机组成。2. STM 的的 重重 要要 部部 件件 隧道针

25、尖的结构是扫描隧道显微技术要解决的主隧道针尖的结构是扫描隧道显微技术要解决的主要问题之一。针尖的大小、形状和化学同一性不仅影要问题之一。针尖的大小、形状和化学同一性不仅影响着扫描隧道显微镜图像的分辨率和图像的形状，而响着扫描隧道显微镜图像的分辨率和图像的形状，而且也影响着测定的电子态。且也影响着测定的电子态。针尖、压电陶瓷针尖、压电陶瓷 、三维扫描控制器、减震系统、三维扫描控制器、减震系统3. STM 的的 工工 作作 模模 式式恒恒 高高 模模 式式3. STM 的的 工工 作作 模模 式式恒恒 流流 模模 式式4. STM 的的 特特 点点分辨率高：横向分辨率可达分辨率高：横向分辨率可达0

26、.1nm0.1nm，纵向分辨率可，纵向分辨率可达达0.01nm0.01nm可在真空、大气、液体等条件下工作可在真空、大气、液体等条件下工作非破坏性测量非破坏性测量可实时地得到实空间中表面的三维图像，可用于可实时地得到实空间中表面的三维图像，可用于具有周期性或不具备周期性的表面结构研究。具有周期性或不具备周期性的表面结构研究。配合扫描隧道谱可以得到有关表面结构的信息配合扫描隧道谱可以得到有关表面结构的信息第三节第三节 特殊显微镜特殊显微镜一、荧光显微镜一、荧光显微镜二、相衬显微镜二、相衬显微镜三、倒置显微镜三、倒置显微镜四、暗视野显微镜四、暗视野显微镜五、偏光显微镜五、偏光显微镜六、激光扫描共聚

27、焦显微镜六、激光扫描共聚焦显微镜七、紫外光显微镜七、紫外光显微镜八、干涉相衬显微镜八、干涉相衬显微镜九、近场扫描光学显微镜九、近场扫描光学显微镜一、荧一、荧 光光 显显 微微 镜镜 荧光显微镜荧光显微镜 (fluorescence microscopy)(fluorescence microscopy)是以是以紫外线为光源来激发生物标本中的荧光物质，产生紫外线为光源来激发生物标本中的荧光物质，产生能观察到各种颜色荧光的一种光学显微镜。利用它能观察到各种颜色荧光的一种光学显微镜。利用它可研究荧光物质在组织和细胞内的分布。可研究荧光物质在组织和细胞内的分布。 为防止紫外线进入物镜，可以采用暗视场照

28、明。为防止紫外线进入物镜，可以采用暗视场照明。 一、荧一、荧 光光 显显 微微 镜镜荧光（荧光（FluorescenceFluorescence）：）： 细胞中的某些物质（如叶绿素）经紫外线照细胞中的某些物质（如叶绿素）经紫外线照射后能发出可见光线，称为荧光。射后能发出可见光线，称为荧光。 自发荧光：由细胞本身存在的物质经紫外线自发荧光：由细胞本身存在的物质经紫外线照射后发出的荧光。照射后发出的荧光。 荧光（荧光（FluorescenceFluorescence）：）： 诱发荧光：一些细胞成分本身经紫外线照射诱发荧光：一些细胞成分本身经紫外线照射后不发荧光，但用荧光染料（酸性品红、甲基绿、后不

29、发荧光，但用荧光染料（酸性品红、甲基绿、吖叮橙等荧光色素）进行活体染色或固定后切片吖叮橙等荧光色素）进行活体染色或固定后切片染色，就能在荧光镜下看见荧光，这种荧光叫诱染色，就能在荧光镜下看见荧光，这种荧光叫诱发荧光。发荧光。透透 射射 荧荧 光光 显显 微微 镜镜 原原 理理落落 射射 荧荧 光光 显显 微微 镜镜 原原 理理二、相二、相 衬衬 显显 微微 镜镜 光线只有通过染色标本时其波长、振幅发生光线只有通过染色标本时其波长、振幅发生变化，人眼才能看见。变化，人眼才能看见。 活细胞和未染色的标本由于光的波长和振幅活细胞和未染色的标本由于光的波长和振幅不发生变化，人眼看不到，但其相位有变化，

30、因不发生变化，人眼看不到，但其相位有变化，因此利用光的干涉和衍射效应把透过标本不同区域此利用光的干涉和衍射效应把透过标本不同区域的光波光程差转变成振幅差，使细胞内各种结构的光波光程差转变成振幅差，使细胞内各种结构之间呈现清晰可见的明暗对比。之间呈现清晰可见的明暗对比。 二、相二、相 衬衬 显显 微微 镜镜 相衬显微镜比普通光学显微镜多了相衬显微镜比普通光学显微镜多了2 2个部件：个部件： 在聚光器上增加一个环形光阑；在聚光器上增加一个环形光阑； 在物镜后焦面增加一个相板，相板上有一个在物镜后焦面增加一个相板，相板上有一个环形区，通过环形区的光比从其它区域透过的光环形区，通过环形区的光比从其它区

31、域透过的光超前或滞后超前或滞后1/41/4，这样就使通过标本不同区域光，这样就使通过标本不同区域光波的相位差转变为振幅差。波的相位差转变为振幅差。相衬显微镜照明原理相衬显微镜照明原理二、相二、相 衬衬 显显 微微 镜镜 光通过标本致密区时发生衍射，产生偏折光，光通过标本致密区时发生衍射，产生偏折光，相位和未受影响的直射光相比被推迟了相位和未受影响的直射光相比被推迟了1/41/4。只有未发生偏折的的直射光可通过相位板的环形只有未发生偏折的的直射光可通过相位板的环形区，其它的偏折光在物镜的后焦面上产生了一个区，其它的偏折光在物镜的后焦面上产生了一个与通过相位板的环形区的光不同的与通过相位板的环形区

32、的光不同的1/41/4的光程的光程差。两组光在平面上成像。差。两组光在平面上成像。二、相二、相 衬衬 显显 微微 镜镜 如果相板的环形区使直射光超前如果相板的环形区使直射光超前1/41/4，加上，加上开始直射光超前的开始直射光超前的1/41/4，直射光共超前，直射光共超前1/21/2，直，直射光和偏折光叠加形成的合成波振幅减少，产生暗射光和偏折光叠加形成的合成波振幅减少，产生暗反差。反差。 如果相板的环形区使直射光滞后如果相板的环形区使直射光滞后1/41/4，加上，加上开始直射光超前的开始直射光超前的1/41/4，两者相抵直射光不发生，两者相抵直射光不发生变化，直射光和偏折光无相位变化，形成的

33、合成波变化，直射光和偏折光无相位变化，形成的合成波振幅增加，产生明反差。振幅增加，产生明反差。三、倒三、倒 置置 显显 微微 镜镜 倒置显微镜倒置显微镜(Inverted Microscope)(Inverted Microscope)的的组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具载物台之上，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。有相差物镜。倒置显微镜倒置显微镜四、暗视野显微镜四、暗视野显微镜 暗视野显微镜（暗视野显微镜（dark field microsco

34、pe）的聚光镜中央有档光片，使）的聚光镜中央有档光片，使照明光线不直接进入物镜，只允许被标本照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至种显微镜能见到小至 4nm200nm的微粒的微粒子，分辨率可比普通显微镜高子，分辨率可比普通显微镜高50倍。倍。暗视野照明方式 五、偏五、偏 光光 显显 微微 镜镜 偏光显微镜是利用光的偏振特性，对具有双折偏光显微镜是利用光的偏振特性，对具有双折射性射性( (即可以使一束入射光经折射后分成两束折射即可以使一束

35、入射光经折射后分成两束折射光光) )的晶体、液晶态物质进行观察和研究的重要光的晶体、液晶态物质进行观察和研究的重要光学仪器。学仪器。 利用它可以清楚地观察到纤维丝、纺锤体、胶利用它可以清楚地观察到纤维丝、纺锤体、胶原、染色体、卵巢、骨骼、毛发、活细胞的结晶或原、染色体、卵巢、骨骼、毛发、活细胞的结晶或液晶态的内含物、神经纤维、肌肉纤维、植物纤维液晶态的内含物、神经纤维、肌肉纤维、植物纤维等的细微结构，从而可以分析细胞、组织的变化过等的细微结构，从而可以分析细胞、组织的变化过程。程。 五、偏五、偏 光光 显显 微微 镜镜 偏光显微镜是在一般显微镜的基础上偏光显微镜是在一般显微镜的基础上增添了使普

36、通光转变成线偏振光和检测偏振增添了使普通光转变成线偏振光和检测偏振光的装置或观察干涉图样的特殊透镜。即光光的装置或观察干涉图样的特殊透镜。即光源前有偏振片（起偏器），使进入显微镜的源前有偏振片（起偏器），使进入显微镜的光线为偏振光，镜筒中有检偏器（一个偏振光线为偏振光，镜筒中有检偏器（一个偏振方向与起偏器垂直的起偏器）。方向与起偏器垂直的起偏器）。五、偏五、偏 光光 显显 微微 镜镜 偏光显微镜的载物台是可以旋转的。偏光显微镜的载物台是可以旋转的。当载物台无样品时，无论如何旋转载物台，当载物台无样品时，无论如何旋转载物台，由于两个偏振片是垂直的，显微镜里看不到由于两个偏振片是垂直的，显微镜里看

37、不到光线。而放入旋光性物质后，由于光线通过光线。而放入旋光性物质后，由于光线通过这类物质时发生偏转，因此旋转载物台便能这类物质时发生偏转，因此旋转载物台便能检测到这种物体。检测到这种物体。偏光显微镜的结构偏光显微镜的结构激光扫描共聚焦显微镜原理图激光扫描共聚焦显微镜原理图六、激光扫描共聚焦显微镜六、激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜实物图激光扫描共聚焦显微镜实物图1. 激光扫描共聚焦显微镜工作原理激光扫描共聚焦显微镜工作原理 激光扫描共聚焦显微镜是在荧光显激光扫描共聚焦显微镜是在荧光显微镜成像的基础上装有激光扫描装置，以微镜成像的基础上装有激光扫描装置，以单色激光作为光源，使样品被激发出

38、荧光，单色激光作为光源，使样品被激发出荧光，利用计算机进行图像处理，从而得到细胞利用计算机进行图像处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像。或组织内部微细结构的荧光图像。1. 激光扫描共聚焦显微镜工作原理激光扫描共聚焦显微镜工作原理 共聚焦显微镜利用激光扫描束经照明孔形成点共聚焦显微镜利用激光扫描束经照明孔形成点光源对标本内焦平面上的每一点扫描，由于照明孔光源对标本内焦平面上的每一点扫描，由于照明孔与检测孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的与检测孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明孔和检测孔，焦平面以外的点不点同时聚焦于照明孔和检测孔，焦平面以外的点不会在检测孔处成像

39、，这样就得到了标本清晰的光学会在检测孔处成像，这样就得到了标本清晰的光学切面图，克服了普通光镜图像模糊的缺点。切面图，克服了普通光镜图像模糊的缺点。 1. 激光扫描共聚焦显微镜工作原理激光扫描共聚焦显微镜工作原理 在显微镜载物台上加一个微量步进马在显微镜载物台上加一个微量步进马达，使载物台上下移动，改变焦平面，不达，使载物台上下移动，改变焦平面，不同层次的光切面图像经计算机图像三维重同层次的光切面图像经计算机图像三维重组，就能获得样品的立体结构图像。组，就能获得样品的立体结构图像。2. 激光扫描共聚焦显微镜的基本结构激光扫描共聚焦显微镜的基本结构1.1.抑制图像的模糊，获得清晰的图像抑制图像的

40、模糊，获得清晰的图像2.2.具有更高的轴向分辨率，并可获取连续光具有更高的轴向分辨率，并可获取连续光学切片学切片3.3.增加侧向分辨率增加侧向分辨率4.4.由于点对点扫描去除了杂散光的影响由于点对点扫描去除了杂散光的影响3. 共焦显微镜与传统显微镜的区别共焦显微镜与传统显微镜的区别4. LSCM在医学检验中的应用在医学检验中的应用1 1细胞的三维重建细胞的三维重建 2 2细胞定量荧光测定细胞定量荧光测定 3 3 细胞内钙离子、细胞内钙离子、pHpH值和其他离子的动态分析值和其他离子的动态分析 4 4 细胞间通讯和膜的流动性细胞间通讯和膜的流动性 七、紫七、紫 外外 光光 显显 微微 镜镜 紫外

41、光源可以明显提高显微镜的分辨率，对紫外光源可以明显提高显微镜的分辨率，对于生物样品使用紫外光照明还具有独特的效果。细于生物样品使用紫外光照明还具有独特的效果。细胞中的原生质对可见光几乎是不吸收的，而蛋白质胞中的原生质对可见光几乎是不吸收的，而蛋白质和核酸等生物大分子对紫外光具有特殊的吸收作用。和核酸等生物大分子对紫外光具有特殊的吸收作用。因此，可以使用紫外光显微镜（因此，可以使用紫外光显微镜（ultraviolet ultraviolet microscopemicroscope）研究单个细胞的组成与变化情况。）研究单个细胞的组成与变化情况。 八、干涉相衬显微镜八、干涉相衬显微镜 干涉相衬显微

42、镜利用偏振光，有四个特殊的光干涉相衬显微镜利用偏振光，有四个特殊的光学组件：偏振器、棱镜、滑行器和检偏器。学组件：偏振器、棱镜、滑行器和检偏器。 偏振器直接装在聚光系统的前面，使光线发生偏振器直接装在聚光系统的前面，使光线发生线性偏振。在聚光器中安装了石英线性偏振。在聚光器中安装了石英Wollaston棱镜，棱镜，可将一束光分解成偏振方向不同的两束光（可将一束光分解成偏振方向不同的两束光（x和和y），），二者成一小夹角。聚光器将两束光调整成与显微镜二者成一小夹角。聚光器将两束光调整成与显微镜光轴平行的方向。最初两束光相位一致，在穿过标光轴平行的方向。最初两束光相位一致，在穿过标本相邻的区域后，

43、由于标本的厚度和折射率不同，本相邻的区域后，由于标本的厚度和折射率不同，引起两束光发生光程差。引起两束光发生光程差。八、干涉相衬显微镜八、干涉相衬显微镜 在物镜的后焦面处安装了第二个在物镜的后焦面处安装了第二个WollastonWollaston棱镜棱镜( (滑行器滑行器) )，把两束光波合并成一束。这时两束光的，把两束光波合并成一束。这时两束光的偏振面（偏振面（x x和和y y）仍然存在。）仍然存在。 最后光束穿过第二个偏振装置最后光束穿过第二个偏振装置( (检偏器检偏器) )，检偏，检偏器将两束垂直的光波组合成具有相同偏振面的两束器将两束垂直的光波组合成具有相同偏振面的两束光，使二者发生干

44、涉。光，使二者发生干涉。八、干涉相衬显微镜八、干涉相衬显微镜 x x和和y y波的光程差决定着透射光的多波的光程差决定着透射光的多少，光程差值为少，光程差值为0 0时，没有光穿过检偏时，没有光穿过检偏器；光程差值等于波长一半时，穿过的器；光程差值等于波长一半时，穿过的光达到最大值。于是在灰色的背景上，光达到最大值。于是在灰色的背景上，标本结构呈现明暗差。标本结构呈现明暗差。八、干涉相衬显微镜八、干涉相衬显微镜 为了使影像的反差达到最佳状态，可调为了使影像的反差达到最佳状态，可调节滑行器的纵行微调改变光程差，光程差可节滑行器的纵行微调改变光程差，光程差可改变影像的亮度。调节滑行器可使标本的细改变

45、影像的亮度。调节滑行器可使标本的细微结构呈现出正或负的投影形象，通常是一微结构呈现出正或负的投影形象，通常是一侧亮，而另一侧暗，这便造成了标本的人为侧亮，而另一侧暗，这便造成了标本的人为三维立体感，类似大理石上的浮雕。三维立体感，类似大理石上的浮雕。干涉相衬显微镜的光路图干涉相衬显微镜的光路图九、近场扫描光学显微镜九、近场扫描光学显微镜 近场扫描光学显微镜的微探头是一个中空的、近场扫描光学显微镜的微探头是一个中空的、针状的、顶部小于针状的、顶部小于150nm150nm，内孔直径为，内孔直径为50nm50nm的玻璃的玻璃微管，管壁镀铝膜，最终使光线只能从直径为微管，管壁镀铝膜，最终使光线只能从直

46、径为50nm50nm（可见波长的（可见波长的1/101/10左右）的内孔射入，微管左右）的内孔射入，微管的尾部接上十分灵敏的光量子探测器测量进入内的尾部接上十分灵敏的光量子探测器测量进入内孔的光量。孔的光量。九、近场扫描光学显微镜九、近场扫描光学显微镜 近场扫描光学显微镜技术的理论分辨率极限约近场扫描光学显微镜技术的理论分辨率极限约10nm10nm。由于采用可见光对生物样品损害很少，而且。由于采用可见光对生物样品损害很少，而且既可以用在空气中（与电子显微镜在真空条件下相既可以用在空气中（与电子显微镜在真空条件下相比要优越），又可以用在水中（与一般的光学显微比要优越），又可以用在水中（与一般的光

47、学显微镜相比也有优越性）。镜相比也有优越性）。 近场扫描光学显微镜技术将对研究活体中的病近场扫描光学显微镜技术将对研究活体中的病毒和染色体等生物物质的结构和形态发挥作用。毒和染色体等生物物质的结构和形态发挥作用。 第四节第四节 显微镜的维护、常见故障及其排除显微镜的维护、常见故障及其排除一、光学显微镜的使用一、光学显微镜的使用二、光学显微镜的维护与保养二、光学显微镜的维护与保养三、光学显微镜的常见故障及排除三、光学显微镜的常见故障及排除四、显微镜拆装的注意事项四、显微镜拆装的注意事项五、电子显微镜的维护及常见故障排除五、电子显微镜的维护及常见故障排除一、一、 光学显微镜的使用光学显微镜的使用低

48、倍镜的使用：低倍镜的使用： 1.1.对光对光 转动粗调节螺旋，降低载物台；旋转动粗调节螺旋，降低载物台；旋转物镜转换器，使转物镜转换器，使1010倍物镜头对准镜台孔；然后倍物镜头对准镜台孔；然后升高聚光镜，打开光圈，将反光镜的凹面对准光升高聚光镜，打开光圈，将反光镜的凹面对准光源，直至视野明亮为止。源，直至视野明亮为止。 2.2.将要观察的切片放在载物台上，固定好，将要观察的切片放在载物台上，固定好，并将要观察的部位移至中央。并将要观察的部位移至中央。 一、一、 光学显微镜的使用方法光学显微镜的使用方法低倍镜的使用：低倍镜的使用： 3.3.调焦距调焦距 旋转粗调螺旋，升高载物台，至物镜旋转粗调

49、螺旋，升高载物台，至物镜距玻片约距玻片约0.5cm0.5cm时，再缓慢降低镜台，直到看清图像时，再缓慢降低镜台，直到看清图像为止。为止。 4.4.调节两瞳孔间的距离调节两瞳孔间的距离 一边用双眼自目镜中观一边用双眼自目镜中观察，一边用双手握住两个目镜管，前后或左右移动，察，一边用双手握住两个目镜管，前后或左右移动，直到双眼看到一共同视野为止。直到双眼看到一共同视野为止。 5.5.为使右眼图像更清晰，可轻轻转动微调螺旋，为使右眼图像更清晰，可轻轻转动微调螺旋，欲使左眼图像清晰，需旋转镜管长度调节环。欲使左眼图像清晰，需旋转镜管长度调节环。一、光学显微镜的使用一、光学显微镜的使用高倍镜的使用：高倍

50、镜的使用： 用低倍镜看清图像后，将要进一步放大的结用低倍镜看清图像后，将要进一步放大的结构移至视野中央，一边从侧面观察，一边旋转物构移至视野中央，一边从侧面观察，一边旋转物镜转换器，将高倍镜头对准镜台孔；升高聚光镜，镜转换器，将高倍镜头对准镜台孔；升高聚光镜，将光线调节到最亮的程度；然后，稍微转动微调将光线调节到最亮的程度；然后，稍微转动微调螺旋，即可观察到清晰的图像。螺旋，即可观察到清晰的图像。一、光学显微镜的使用一、光学显微镜的使用油镜的使用：油镜的使用： 用低倍镜看清图像后，将所要观察的结构移用低倍镜看清图像后，将所要观察的结构移至视野中央，在标本所要观察的部位滴一滴镜油，至视野中央，在

51、标本所要观察的部位滴一滴镜油，旋转物镜转换器，将油镜头对准镜台孔，使油镜旋转物镜转换器，将油镜头对准镜台孔，使油镜头下端与镜油接触，然后，轻轻转动微调螺旋，头下端与镜油接触，然后，轻轻转动微调螺旋，即可看清物像。使用油镜时，应把聚光镜的光圈即可看清物像。使用油镜时，应把聚光镜的光圈充分开大。用完油镜后，必须用擦镜纸蘸清洗剂，充分开大。用完油镜后，必须用擦镜纸蘸清洗剂，将镜头和玻片擦净。将镜头和玻片擦净。二、光学显微镜的维护二、光学显微镜的维护 1. 1.搬动显微镜时，应该用右手握镜臂搬动显微镜时，应该用右手握镜臂, ,左手托左手托镜座，平贴胸前，以防撞碰。切勿用一只手斜提，镜座，平贴胸前，以防

52、撞碰。切勿用一只手斜提，前后摇摆。前后摇摆。 2.2.每次使用显微镜前，要检查显微镜的主要部每次使用显微镜前，要检查显微镜的主要部件有无缺损，发现问题，及时报告。使用时，要严件有无缺损，发现问题，及时报告。使用时，要严格按操作程序，正确地缓慢移动有关机械部分。格按操作程序，正确地缓慢移动有关机械部分。 二、光学显微镜的维护二、光学显微镜的维护 3. 3.禁止拆卸显微镜的各个部件，更不允许与其禁止拆卸显微镜的各个部件，更不允许与其它显微镜对换，以免安装不当影响观察效果。它显微镜对换，以免安装不当影响观察效果。 4.4.如镜头表面有灰尘，应该用擦镜纸擦，不允如镜头表面有灰尘，应该用擦镜纸擦，不允许

53、用口吹、手指抹，或用其他纸、布擦。许用口吹、手指抹，或用其他纸、布擦。 5.5.显微镜用完后，将显微镜用完后，将4 4倍镜头对准镜台孔，升倍镜头对准镜台孔，升高镜台，降下聚光器，打开光圈，盖好防尘罩，放高镜台，降下聚光器，打开光圈，盖好防尘罩，放回原处。回原处。三、光学显微镜的常见故障及排除 ( (一一) ) 常见光学故障及排除常见光学故障及排除 1 1镜头成像质量降低镜头成像质量降低 2 2双像不重合双像不重合 3 3视场中的光线不均匀视场中的光线不均匀 4 4视场中有污物视场中有污物三、光学显微镜的常见故障及排除( (二二) )常见机械故障及排除常见机械故障及排除 1 1粗调的自动下滑粗调

54、的自动下滑 2. 2. 升降时手轮梗跳升降时手轮梗跳 3 3微调装置的故障微调装置的故障四、电子显微镜的维护及常见故障的排除四、电子显微镜的维护及常见故障的排除( (一一) )电子显微镜的日常维护电子显微镜的日常维护 1 1镜筒部分要保持高度洁净镜筒部分要保持高度洁净 2 2真空系统的维护真空系统的维护 3 3电器部分的维护电器部分的维护四、电子显微镜的维护及常见故障的排除四、电子显微镜的维护及常见故障的排除( (二二) )电子显微镜的常见故障及排除电子显微镜的常见故障及排除 电子显微镜的常见故障，就是灯丝损电子显微镜的常见故障，就是灯丝损坏，通常坏，通常3 3个月左右更换一次。在安装灯丝个月左右更换一次。在安装灯丝时，必须使灯丝尖端与栅极孔的中心严格时，必须使灯丝尖端与栅极孔的中心严格对正。对正。 第五节第五节 显显 微微 摄摄 影影 术术 利用显微摄影装置拍摄显微镜利用显微摄影装置拍摄显微镜( (或解剖镜或解剖镜) )视野中物像的技术称为视野中物像的技术称为显微摄影显微摄影。 显