第三章 细胞生物学研究方法

1、第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法 细胞形态结构的观察方法细胞形态结构的观察方法 细胞组分的分析方法细胞组分的分析方法 细胞培养、细胞工程与显微操作技术细胞培养、细胞工程与显微操作技术第一节第一节 细胞形态结构的细胞形态结构的 观察方法观察方法 光学显微镜技术光学显微镜技术（light microscopy） 电子显微镜技术电子显微镜技术 (Electro microscopy) 扫描探针显微镜（扫描探针显微镜（Scanning Probe Scanning Probe MicroscopeMicroscope） 扫描遂道显微镜扫描遂道显微镜 (scanning tunneli

2、ng microscope ) 第二节第二节 细胞组分的分析方法细胞组分的分析方法 离心分离技术离心分离技术 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的 显示方法显示方法 特异蛋白抗原的定位与定性特异蛋白抗原的定位与定性 细胞内特异核酸的定位与定性细胞内特异核酸的定位与定性 放射自显影技术放射自显影技术 定量细胞化学分析技术定量细胞化学分析技术第三节第三节 细胞培养、细胞培养、细胞工程与显微操作技术细胞工程与显微操作技术 细胞的培养细胞的培养 细胞工程细胞工程 一、光学显微镜技术一、光学显微镜技术（light microscopy) 普通复式光学显微镜技术普通复式

3、光学显微镜技术 荧光显微镜技术荧光显微镜技术 激光共焦扫描显微镜技术激光共焦扫描显微镜技术 相差显微镜相差显微镜 微分干涉显微镜微分干涉显微镜 录像增差显微镜技术录像增差显微镜技术 二、二、 电子显微镜技术电子显微镜技术 电子显微镜的基本知识电子显微镜的基本知识电镜与光镜的比较电镜与光镜的比较电镜与光镜光路图比较电镜与光镜光路图比较电子显微镜的基本构造电子显微镜的基本构造 主要电镜制样技术主要电镜制样技术负染色技术负染色技术冰冻蚀刻技术冰冻蚀刻技术超薄切片技术超薄切片技术电镜三维重构技术电镜三维重构技术 扫描电镜扫描电镜三、三、 扫描遂道显微镜扫描遂道显微镜Scanning Probe Mic

4、roscope,SPM (80年代发展起来的检测样品微观结构的仪器年代发展起来的检测样品微观结构的仪器) 包括：包括：STMSTM、AFMAFM、磁力显微镜、摩擦力显微镜等、磁力显微镜、摩擦力显微镜等原理原理：扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产生彼此间相互作用力，如：扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产生彼此间相互作用力，如 量子力学中的隧道效应（隧道电流）、原子间作用力、磁力、摩擦力等，量子力学中的隧道效应（隧道电流）、原子间作用力、磁力、摩擦力等， 并在计算机显示出来，从而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等。并在计算机显示出来，从而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等。

5、 装置：扫描的压电陶瓷，逼近装置，电子学反馈控制系统和数据采集、处理、显示装置：扫描的压电陶瓷，逼近装置，电子学反馈控制系统和数据采集、处理、显示系统。系统。特点：（特点：（1 1）可对晶体或非晶体成像，无需复杂计算，且分辨本领高。）可对晶体或非晶体成像，无需复杂计算，且分辨本领高。 （侧分辨率为（侧分辨率为0.10.10.2nm0.2nm，纵分辨率可达，纵分辨率可达0.01nm0.01nm）；）；（2 2）可实时得到样品表面三维图象，可测量厚度信息；）可实时得到样品表面三维图象，可测量厚度信息； （3 3）可在真空、大气、液体等多种条件下工作；非破坏性测量。）可在真空、大气、液体等多种条件下

6、工作；非破坏性测量。（4 4）可连续成像，进行动态观察）可连续成像，进行动态观察用途：纳米生物学研究领域中的重要工具用途：纳米生物学研究领域中的重要工具, ,在原子水平上揭示样本表面的结构。在原子水平上揭示样本表面的结构。 普通复式普通复式光学显微镜技术光学显微镜技术 光镜样本制作光镜样本制作分辨率分辨率是指区分开两个质点间的最小距离是指区分开两个质点间的最小距离荧光显微镜技术（荧光显微镜技术（Fluorescence Fluorescence MicroscopyMicroscopy）原理与应用原理与应用 直接荧光标记技术直接荧光标记技术 间接免疫荧光标记技术间接免疫荧光标记技术 在光镜水平

7、用于特异蛋白质在光镜水平用于特异蛋白质 等生物大分子的定性定位：等生物大分子的定性定位： 如绿色荧光蛋白如绿色荧光蛋白(GFP)(GFP)的应用的应用 激光共焦扫描显微镜技术激光共焦扫描显微镜技术（Laser Scanning ConfocalLaser Scanning Confocal MicroscopyMicroscopy）原理原理应用：应用：排除焦平面以外光的干扰，增强排除焦平面以外光的干扰，增强 图像反差和提高分辨率图像反差和提高分辨率(1.41.7)(1.41.7)， 可重构样品的三维结构。可重构样品的三维结构。相差显微镜相差显微镜（phase-contrast microsco

8、pe）将光程差或相位差转换成振幅差，可用于将光程差或相位差转换成振幅差，可用于观察活细胞观察活细胞 微分干涉显微镜微分干涉显微镜（differential-interference microscope） 偏振光经合成后，使样品中厚度上的微小区别转化成偏振光经合成后，使样品中厚度上的微小区别转化成 明暗区别，增加了样品反差且具有立体感。适于研究明暗区别，增加了样品反差且具有立体感。适于研究 活细胞中较大的细胞器活细胞中较大的细胞器录像增差显微镜技术录像增差显微镜技术（video-enhance microscopyvideo-enhance microscopy） 计算机辅助的计算机辅助的DI

9、C显微镜可在高分辨率下研究活显微镜可在高分辨率下研究活 细胞中的颗粒及细胞器的运动细胞中的颗粒及细胞器的运动电镜与光镜的比较电镜与光镜的比较 显微镜分辨本领光源透镜真空成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可见光（400-700） 紫外光（约200nm)电子束（0.01-0.9）玻璃透镜玻璃透镜电磁透镜不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-51.33x10-3Pa利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差电镜与光镜光路图比较电镜与光镜光路图比较电子显微镜的基本构造电子显微镜的基本构造主要电镜制样技术主要电镜制样技术 超薄切片技术超薄切片技术

10、用于电镜观察的样本制备用于电镜观察的样本制备示意图示意图 负染色技术负染色技术（Negative staining）与）与金属投影金属投影 染色背景，衬托出样品的精细结构染色背景，衬托出样品的精细结构冰冻蚀刻技术（冰冻蚀刻技术（Freeze etching） （技术示意图技术示意图） 冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒 和膜表面结构。和膜表面结构。 快速冷冻快速冷冻深度蚀刻技术深度蚀刻技术（quick freeze deep etchingquick freeze deep etching）电镜三维重构技术电镜三维重构技术电

11、子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的 具有重要应用前景的一门新技术。具有重要应用前景的一门新技术。电镜三维重构技术与电镜三维重构技术与X-X-射线晶体衍射技术及核磁共振射线晶体衍射技术及核磁共振 分析技术相结合，是当前结构生物学分析技术相结合，是当前结构生物学（Structural BiologyStructural Biology） 主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。 扫描电镜扫描电镜原理与应用原理与应用：电子电子“探针探针”扫描，激发样品表面放出二次电子，

12、扫描，激发样品表面放出二次电子，探测器收集二次电子成象。探测器收集二次电子成象。 COCO 2 2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张临界点干燥法防止引起样品变形的表面张 力问题力问题一、一、 离心分离技术离心分离技术用途：于分离细胞器与生物大分子及其复合物用途：于分离细胞器与生物大分子及其复合物 差速离心差速离心：分离密度不同的细胞组分：分离密度不同的细胞组分 密度梯度离心密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离：精细组分或生物大分子的分离二、二、 细胞内核酸、蛋白质、细胞内核酸、蛋白质、 酶、糖与脂类等的显示方法酶、糖与脂类等的显示方法原理原理：利用一些显色剂与所检测物质中一些：利用一些显

13、色剂与所检测物质中一些 特殊基团特异性结合的特征，通过显特殊基团特异性结合的特征，通过显 色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来 判断某种物质在细胞中的判断某种物质在细胞中的分布和含量分布和含量。 Feulgen Staining三、特异蛋白抗原的定位与定性三、特异蛋白抗原的定位与定性 免疫荧光技术免疫荧光技术：快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限 （图图） 蛋白电泳蛋白电泳(SDS-PAGE)(SDS-PAGE) 与免疫印迹反应与免疫印迹反应(Western-Blot)(Western-Blot) 免疫电镜技术免疫电镜技术：免疫铁

14、蛋白技术免疫铁蛋白技术免疫酶标技术免疫酶标技术免疫胶体金技术免疫胶体金技术 应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等四、细胞内特异核酸的定位与定性四、细胞内特异核酸的定位与定性 光镜水平的原位杂交技术光镜水平的原位杂交技术 （同位素标记或荧光素标记的探针）（同位素标记或荧光素标记的探针） 电镜水平的原位杂交技术电镜水平的原位杂交技术 （生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合）（生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结

15、合） PCRPCR技术技术 五、放射自显影技术五、放射自显影技术原理及应用：原理及应用：利用同位素的利用同位素的放射自显影放射自显影，对细胞内生物大分子进，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究；行定性、定位与半定量研究；实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。步骤：步骤：前体物掺入细胞（标记：持续标记和脉冲标记）前体物掺入细胞（标记：持续标记和脉冲标记） 放射自显影放射自显影六定量细胞化学分析技术六定量细胞化学分析技术 细胞显微分光光度术细胞显微分光光度术（Microspectrophotometry）利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定

16、这些物质利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质 （如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。（如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。 包括：包括： 紫外光显微分光光度测定法紫外光显微分光光度测定法 可见光显微分光光度测定法可见光显微分光光度测定法 流式细胞仪流式细胞仪（Flow Cytometry）主要应用主要应用：用于定量测定细胞中的用于定量测定细胞中的DNADNA、RNARNA或某一特异蛋白的含量；或某一特异蛋白的含量；测定细胞群体中不同时相细胞的数量；测定细胞群体中不同时相细胞的数量；从细胞群体中分离某些特异染色的细胞；从细胞群体中分离某些特异染色的细胞；分离分离DNADNA含量不同的中期

17、染色体。含量不同的中期染色体。 一、细胞的培养一、细胞的培养 动物细胞培养动物细胞培养 类 型 ： 原 代 培 养 细 胞类 型 ： 原 代 培 养 细 胞（primary culture cellprimary culture cell） 1-101-10代以内的细胞代以内的细胞 贴壁培养：培养细胞贴壁生长，呈多态性，单层生长，保持接触抑制，也叫单层细胞培养。 细胞系：能够传代40-50次并且仍保持原来染色体的二倍体数量及接触抑制行为的传代细胞。 细胞株：经过生物学鉴定具有特殊遗传标记或性质的细胞克隆 连续细胞系：50代以后的，遗传物质发生改变、能够无限制的传代培养下去的细胞 特点：染色体明

18、显改变，一般呈亚二倍体或非整倍体植物细胞培养 类型类型： 原生质体培养原生质体培养 （体细胞培养）（体细胞培养） 单倍体细胞培养（花药培养）单倍体细胞培养（花药培养） 二、细胞工程二、细胞工程 细胞融合细胞融合（cell fusioncell fusion）与细胞杂交（）与细胞杂交（cell hybridizationcell hybridization）技术技术单克隆抗体（单克隆抗体（monoclonemonoclone antibody antibody）技术）技术 图图细胞拆合与显微操作技术细胞拆合与显微操作技术物理法结合显微操作技术物理法结合显微操作技术( (图图1 1、图图2 2)

19、)化学法结合离心技术化学法结合离心技术制备核体（制备核体（karyoplastkaryoplast）和胞质体（）和胞质体（cytoplastcytoplast）。）。 其它技术其它技术 遗传分析（遗传分析（mutant, knock out, knock in） 细胞拆合：把细胞核细胞质分离开来，然后把不同来源的胞质体和核体相互组合，形成核质杂交细胞。 细胞操作技术：早起建立的一种实验胚胎学技术，即在显微镜下，用显微操作装置对细胞进行解剖和微量注射的技术。第四节细胞及生物大分子的动态变化 一、荧光漂白恢复技术(FPR)用亲脂性或亲水性的荧光分子与蛋白或脂质偶联，用于检测所标记分子在活体细胞表面

20、活细胞内部的运动及其迁移速率。 原理：利用高能激光束照射细胞的某一特定区域，使该区域内的标记分子发生不可逆的淬灭，称为漂白区，随着脂质分子或蛋白质的运动，漂白去逐渐恢复到原有水平。二、单分子技术与细胞生命活动的研究 单分子技术：在细胞内实现观测单一分子运动规律的技术，可以在纳米空间尺度和毫秒时间尺度上精确测量单个分子的距离、位置、指向、分布、结构以及各种动态过程 以工作原理分类：单分子光谱及成像、单分子操作及力学性质测量 优点：实现直接观测单个分子的反应动力学的途径 测量单一分子间相互作用力 捕捉单一分子随机过程和分子构想变化的中间态 测量稀发但重要的信号和分布 测量非平衡态和不同步的体系三、

21、酵母双杂交技术 转录激活因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成, 其中有DNA结合结构域（BD）和转录激活结构域（AD），单独的BD能与特定基因的启动区结合，但不能激活基因的转录，而由不同转录调控因子的BD和AD所形成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。四、荧光共振能量转移技术 原理：在一定波长的激发光照下，只有携带发光基团A的供体分子可以被激发出波长是A的荧光，而同一激发光不能激发携带发光基团B的受体分子发出波长是B的荧光，当吸收光谱A和吸收光谱B重叠，并且两个发光基团距离小到一定程度时会发生不同程度的能量转移，受体分子发出了波长是B的荧光五、放射自显影技术原理：利用放射性同位素的电离射

22、线对乳胶的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究步骤：选合适的放射性前体分子做标记按标记时间做标记制片曝光再显影定影观察特点：可以对细胞内生物大分子进行动态研究和追踪第五节第五节 模式生物与功能基因组的研究模式生物与功能基因组的研究 一、细胞生物学研究常用的模式生物 理想的研究材料是研究成功的关键 在生物研究中通常采用：噬菌体、大肠杆菌、酵母、线虫、果蝇、四膜虫、黏菌海胆、拟南芥、斑马鱼和小鼠等 特征：个体较小、容易培养、操作简单 大肠杆菌大肠杆菌 原核生物的代表，一条环状DNA，大约编码4288个基因 特点：培养方便，生长快，基因结构简单，突变株的诱导、分离和鉴定容易 酵母酵母 单细胞真核细胞的代表，有芽殖酵母，裂殖酵母 线虫 成体长约1mm，由959个细胞组成 线虫繁殖快，生长周期为3天，在显微镜下通体透明。胚胎发育过程中细胞分裂、分化及死亡具有高度的程序性 果蝇 黑腹果蝇大约编码13600个基因作为遗传学的模式生物有100多年，与人类基因有很高的同源性二、突变体制备技术 RNA干扰法包括瞬时干扰和永久干扰 RNAi是利用一段特意的双链RNA或单