第五章 分子生物学研究法

1、基因操作基因操作也称也称重组重组DNADNA技术技术，主要包括，主要包括DNA分子分子的切割与连接、细胞转化、凝胶电泳、核酸分子杂的切割与连接、细胞转化、凝胶电泳、核酸分子杂交、核酸序列分析以及基因人工合成、定点突变和交、核酸序列分析以及基因人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。扩增等，是分子生物学研究的核心技术。 从从20世纪中叶开始，分子生物学研究得到高世纪中叶开始，分子生物学研究得到高速发展，主要原因之一是研究方法，特别是速发展，主要原因之一是研究方法，特别是基因基因操作操作和和基因工程技术基因工程技术的进步。的进步。基因工程：基因工程：在体外将在体外将核酸分子核

2、酸分子插入病毒、插入病毒、质粒或其他质粒或其他载体分子载体分子中，构成遗传物质的中，构成遗传物质的新新组合组合，使之进入新的宿主细胞内并获得持续，使之进入新的宿主细胞内并获得持续稳定的增殖能力和表达。稳定的增殖能力和表达。第一节第一节 重组重组DNADNA技术回顾技术回顾 40 40年代确定了年代确定了遗传信息的携带者遗传信息的携带者，即基因的，即基因的分子载体是分子载体是DNADNA而不是蛋白质而不是蛋白质，解决了遗传的物，解决了遗传的物质基础问题；质基础问题； 50 50年代提示了年代提示了DNADNA分子的双螺旋结构模型分子的双螺旋结构模型和和半保留复制机制半保留复制机制, ,解决了基因

3、的自我复制和世代解决了基因的自我复制和世代交替问题；交替问题； 50 50年代末至年代末至6060年代，相继提出了年代，相继提出了“中心法则中心法则”和和操纵子学说操纵子学说, ,成功地破译了遗传密码，充分认成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。识了遗传信息的流动和表达。重组重组DNA技术历史上的主要事件技术历史上的主要事件 年份年份事事 件件 1869F Miescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离首次从莱茵河鲑鱼精子中分离DNA。1944O.T. Avery证实证实DNA是遗传物质。是遗传物质。1952A.D. Hershey和和M.Chase再次证实和噬菌体的遗传物质是再次

4、证实和噬菌体的遗传物质是DNA。1953J.D.Watson和和F.H.C.Crick提出提出DNA分子结构的双螺旋模型。分子结构的双螺旋模型。M.Wilkins用用X-射线衍射法证实了这一结构。射线衍射法证实了这一结构。1957A.Kornberg从大肠杆菌中发现了从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶聚合酶I。1958M. Meselson和和F. W. Stahl提出了提出了DNA的半保留复制模型。的半保留复制模型。1959-1960S. Ochoa发现发现RNA聚合酶和信使聚合酶和信使RNA，并证明，并证明mRNA决定了蛋决定了蛋白质分子中的氨基酸序列。白质分子中的氨基酸序列。1961Nire

5、nberg破译了第一相遗传密码；破译了第一相遗传密码；F. Jacob和和J. Monod提出了提出了调节基因表达的操纵子模型。调节基因表达的操纵子模型。1964 C. Yanofsky和和S. Brenner等人证明，多肽链上的氨基酸序列与等人证明，多肽链上的氨基酸序列与该基因中的核苷酸序列存在着共线性关系。该基因中的核苷酸序列存在着共线性关系。1965 S. W. Holley完成了酵母丙氨酸完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定；的全序列测定；科学家证明细菌的抗药性通常由科学家证明细菌的抗药性通常由质粒质粒DNA所决定。所决定。1966 M.W.Nirenberg，S.Ochoa、H.G.

6、Khorana、F.H.C.Crick等人破等人破译了全部遗传密码。译了全部遗传密码。1970H.O.Smith，K.W.Wilcox和和T.J.Kelley分离了第一种限制性核酸分离了第一种限制性核酸内切酶。内切酶。H.M.Temin和和D.Baltimore从从RNA肿瘤病毒中发现反转肿瘤病毒中发现反转录酶。录酶。1972-1973H.Boyer，P.Berg等人发展了等人发展了DNA重组技术，于重组技术，于72年获得第一年获得第一个重组个重组DNA分子，分子，73年完成第一例细菌基因克隆。年完成第一例细菌基因克隆。1975-1977F.Sanger与与A.Maxam、W.Gilbert等

7、人发明了等人发明了DNA序列测定技术。序列测定技术。1977年完成了全长年完成了全长5387bp的噬菌体的噬菌体174基因组测定。基因组测定。1978 首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。岛素。1980美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以专利化。美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以专利化。1981R. D. Palmiter和和R. L. Brinster获得转基因小鼠；获得转基因小鼠；A. C. Spradling和和G. M. Rubin得到转基因果蝇。得到转基因果蝇。1982美、英批准使用第一例基因工程药物

8、美、英批准使用第一例基因工程药物-胰岛素；胰岛素；Sanger等人完成了入噬菌体等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。全序列测定。1983 获得第一例转基因植物。获得第一例转基因植物。1984 斯坦福大学获得关于重组斯坦福大学获得关于重组DNA的专利。的专利。1986 GMO首次在环境中释放。首次在环境中释放。1988 J. D. Watson出任出任人类基因组计划人类基因组计划首席科学家。首席科学家。1989DuPont公司获得转肿瘤基因小鼠公司获得转肿瘤基因小鼠-Oncomouse。1992 欧共体欧共体35个实验室联合完成酵母第三染色体全序列测定。个实验室联合完成酵母第三染色体全

9、序列测定。1994第一批基因工程西红柿在美国上市。第一批基因工程西红柿在美国上市。1996完成了酵母基因组完成了酵母基因组(1.25107bp)全序列测定。全序列测定。1997英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。2000完成第一个高等植物拟南芥的全序列测定。完成第一个高等植物拟南芥的全序列测定。2001完成第一个人类基因组全序列测定。完成第一个人类基因组全序列测定。2004中国科学家完成家蚕基因组全序列测定。中国科学家完成家蚕基因组全序列测定。2005中、美、日科学家联合完成基因组全序列测定。中、美、日科学家联合完成基因组全序列测定。2008年诺贝尔生理学或医学

10、奖年诺贝尔生理学或医学奖 德国哈拉尔德楚尔豪森 弗朗索瓦丝巴尔西诺西吕克蒙塔尼人乳突淋瘤病毒引发子宫颈癌 发现人类免疫缺陷病毒 2008年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖发现和研究绿色荧光蛋白方面做出贡献而获奖发现和研究绿色荧光蛋白方面做出贡献而获奖 钱永健 下村修 马丁查尔菲20092009年度诺贝尔生理学或医学奖年度诺贝尔生理学或医学奖研究主题是研究主题是“染色体如何受到端粒和端粒染色体如何受到端粒和端粒酶的保护酶的保护” 杰克绍斯塔克（杰克绍斯塔克（Jack W. Szostak） 卡罗尔格雷德（卡罗尔格雷德（Carol W.GreiderCarol W.Greider） 伊丽莎白布赖克本（伊

11、丽莎白布赖克本（Elizabeth H.Blackburn） 20092009诺贝尔化学奖诺贝尔化学奖 英国剑桥大学科学家英国剑桥大学科学家文卡特拉曼文卡特拉曼. 拉马克里希南拉马克里希南美国耶鲁大学科学家美国耶鲁大学科学家托马斯托马斯. 施泰茨施泰茨以色列科学家以色列科学家阿达阿达. 约纳特约纳特 对核糖体结构和功能的研究。三位科学家都采用了对核糖体结构和功能的研究。三位科学家都采用了X X射线蛋白质晶体学的技术，标识出了构成核糖体的成射线蛋白质晶体学的技术，标识出了构成核糖体的成千上万个原子。千上万个原子。 v2012年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖两位美国科学家罗伯特莱夫科维茨（Robert

12、 J. Lefkowitz）和布莱恩克比尔卡（Brian K. Kobilka）因“G蛋白偶联受体研究蛋白偶联受体研究”获得2012年诺贝尔化学奖。二人将平均分享800万瑞典克朗奖金。 v2012年诺贝尔生理学或医学奖年诺贝尔生理学或医学奖 2012年诺贝尔生理学或医学奖在瑞典斯德哥尔摩揭晓，京都大学物质-细胞统合系统据点iPS细胞研究中心长山中伸弥、英国发育生物学家约翰戈登因在细胞核重新编程研究领域的杰出贡献而获奖。 一、什么是重组一、什么是重组DNADNA技术？技术？ 按照人的意愿，应用按照人的意愿，应用酶学酶学的方法的方法, 在在体外体外将各种来将各种来源的遗传物质源的遗传物质DNA与与

13、载体载体接合接合成具有自我复制能力成具有自我复制能力的的重组重组DNA分子分子，继而通过，继而通过转化转化或或转染转染宿主细胞宿主细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该DNA分子的分子的大大量拷贝量拷贝，表达相关基因表达相关基因的产物，是进行基因功能研的产物，是进行基因功能研究的基本方法。究的基本方法。重组重组DNA技术包括了一系列的基因操作步骤。技术包括了一系列的基因操作步骤。基因克隆基因克隆操作一般步骤：操作一般步骤：（1 1）获得目的基因；）获得目的基因；（2 2）与克隆载体连接，形成新）与克隆载体连接，形成新的重组的重组DNADNA分子；分子；（3 3）

14、用重组）用重组DNADNA分子转化受体分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；制和遗传；（4 4）对转化子筛选和鉴定；）对转化子筛选和鉴定；（5 5）对获得外源基因的细胞或）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的遗传性状或表达出所需要的产物。的产物。 获得需要的目的基因常用的方法：获得需要的目的基因常用的方法：（1 1）分离法：分离法：直接从生物体中提取总直接从生物体中提取总DNADNA，构建基，构建基因组因组DNADNA文库，从中文库，从中调用调用目的基因；目的基因；（2 2）反转录法：反转录法：以以mR

15、NAmRNA为模板，为模板，反转录反转录合成互补合成互补的的DNADNA片段，建立片段，建立cDNAcDNA文库或文库或RT-PCRRT-PCR；（3 3）化学合成法化学合成法（4 4）聚合酶链式反应聚合酶链式反应（PCRPCR）：特异性地扩增所需）：特异性地扩增所需要的目的基因片段。要的目的基因片段。如何获得需要的目的基因（外源基因）如何获得需要的目的基因（外源基因）二、工具酶二、工具酶 限制性内切酶限制性内切酶 连接酶连接酶 核酸聚合酶核酸聚合酶 逆转录酶逆转录酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 甲基化酶甲基化酶 重组酶重组酶1.限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 是一类能识别和切割双链是一类能识别和

16、切割双链DNADNA分子中分子中特定特定碱基顺序碱基顺序的核酸水解酶。的核酸水解酶。 按照限制性核酸内切酶对辅助因子的需求与按照限制性核酸内切酶对辅助因子的需求与否，以及切割否，以及切割DNA链的特点，将已发现的限链的特点，将已发现的限制性内切酶分为制性内切酶分为3种类型：种类型：、型。型。型限制性内切酶实际应用价值最大，是基型限制性内切酶实际应用价值最大，是基因工程中剪切因工程中剪切DNA分子的常用工具酶，被誉分子的常用工具酶，被誉为为分子生物学家的手术刀分子生物学家的手术刀。（1）型限制性内切酶的作用特点：型限制性内切酶的作用特点： 1.1. 有严格的识别、切割的有严格的识别、切割的DNA

17、DNA序列，并以序列，并以内切的方式水解双链内切的方式水解双链DNADNA分子中的磷酸二酯分子中的磷酸二酯键，产生的键，产生的DNADNA片段片段55端为端为P P，33端为端为OHOH。 2. 2. 识别序列一般为识别序列一般为4 46 6个碱基对，并以个碱基对，并以切割序列的正中作为轴心，成切割序列的正中作为轴心，成180180反向重反向重复复(inverted repeat)(inverted repeat)。这种结构也称为。这种结构也称为回回文结构文结构(palindrom)(palindrom)。 5 GGATCC 3 3 CCTAGG 5限制性核酸内切酶作用后产生两种末端：限制性核

18、酸内切酶作用后产生两种末端：BamH IGCCTAGGATCCG+GTCCAGGACCTG+GTCGACCAGCTGGGATCCCCTAGGHinc平末端平末端(blunt end)粘性末端粘性末端(sticky end)5 5突出粘性末端突出粘性末端 与与 3 3端突出粘性末端端突出粘性末端命名原则命名原则:Hind 属属Haemophilus influenzae d菌株菌株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d菌菌株的第株的第3种酶种酶 第一个字母是细菌属名的第一个字母第一个字母是细菌属名的第一个字母，要大写；，要大写； 第第2、3个字母是细菌种名的前两个字母个字母是细菌种名的前两个字母，要小写；，

19、要小写； 上述字母都是用上述字母都是用斜体斜体。 接着是细菌菌株的第一个字母接着是细菌菌株的第一个字母，用正体字母书写；，用正体字母书写； 如果同一菌株有不同的内切酶时，按发现次序分别如果同一菌株有不同的内切酶时，按发现次序分别 用罗马数字用罗马数字、表示。表示。种种菌株菌株序序A.A.同裂酶同裂酶(isoschizomer)(isoschizomer)： 又称又称异源同工酶异源同工酶，即从不同原核生物中分，即从不同原核生物中分离出来的不同的离出来的不同的型酶型酶有相同的识别序列有相同的识别序列特点，但切割位点可以相同，也可以不同。特点，但切割位点可以相同，也可以不同。 例如：例如： SamI

20、SamI CCCGGGCCCGGG和和 XmaIXmaI CCCGGGCCCGGG （2）三类特殊性质的）三类特殊性质的型限制性内切酶型限制性内切酶HpaHpa MspMsp 5 5CCGGCCGG33B. 同尾酶（同尾酶（isocaudarner) 不同来源的酶，其识别和切割序列有一定的相不同来源的酶，其识别和切割序列有一定的相关性，作用后能产生关性，作用后能产生相同的粘性末端相同的粘性末端 。5 5G G G A T CG A T C C C3 33 3C C C T A GC T A G G G5 55 5A A G A T CG A T C T T3 33 3T T C T A GC

21、T A G A A5 5BamH IBag II5 5G G G A T CG A T C C C3 33 3C C C T A GC T A G G G5 55 5A A G A T CG A T C T T3 33 3T T C T A GC T A G A A5 5 C.C.可变酶：可变酶： 此种酶所识别此种酶所识别DNADNA序列中的一个或几个序列中的一个或几个碱基碱基是可变的是可变的，并且识别序列往往超过，并且识别序列往往超过6 6个碱基对。个碱基对。 例如：例如：Bstp I Bstp I 识别序列为：识别序列为： 55G G T G G T N N A C CA C C3 3 5

22、 5C C A C C A N N T G GT G G33 其中其中N N为一可变碱基。为一可变碱基。 BgIBgI：5GCCNNNN5GCCNNNNNGGC3 NGGC3 3CGGN 3CGGNNNNNCCG5NNNNCCG5(3)限制性内切酶的应用限制性内切酶的应用 限制性内切酶除作为剪切限制性内切酶除作为剪切DNADNA的工具广的工具广泛应用于分子生物学研究的各个领域内。泛应用于分子生物学研究的各个领域内。 a.a.绘制基因的物理图谱及基因同源性比绘制基因的物理图谱及基因同源性比较。较。 b.b.测定基因的核苷酸序列、基因组测定基因的核苷酸序列、基因组DNADNA分析。分析。n c.c

23、.基因突变与遗传性疾病的诊断等。基因突变与遗传性疾病的诊断等。n d.d.改造及重组质粒。改造及重组质粒。n e.e.克隆及亚克隆的建立。克隆及亚克隆的建立。2 2、DNADNA连接酶：连接酶： （1 1）概念：）概念：催化双链催化双链DNADNA中相邻碱基的中相邻碱基的55磷磷酸和酸和33羟基间磷酸二酯羟基间磷酸二酯键形成的酶，称为键形成的酶，称为DNADNA连连接酶接酶(DNA ligase)(DNA ligase)。DNADNA连接酶主要有两种：连接酶主要有两种： T4T4噬菌体噬菌体DNADNA连接酶连接酶 大肠杆菌大肠杆菌DNADNA连接酶连接酶 （2 2）连接酶用途：）连接酶用途：

24、 连接带连接带匹配粘端匹配粘端的的DNADNA分子。分子。 使使平端平端的双链的双链DNADNA分子互相连接分子互相连接或与合成接头相连或与合成接头相连接。接。. . 黏性末端连接黏性末端连接GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCGGCCTAGGATCCGD DN NA A连连接接酶酶GCCTAGGATCCG黏性末端连接方式：黏性末端连接方式： (1)(1)同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接 (2)(2)不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶15CGATCC GGCCTAG目的

25、基因用目的基因用 Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG载体载体DNA用用Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重组体重组体GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG目的基因自连目的基因自连载体基因自连载体基因自连同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接不同限制酶切位点的连接不同限制酶切位点的连接GAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEco R切割位点切割位点GCTTAAATCTA

26、GAATTCGGATCTABg l切割位点切割位点AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGEcoR+ Bg l双酶切双酶切Eco R+ Bg l双酶切双酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体定向克隆定向克隆. . 平头末端连接平头末端连接 限制性内切酶作用产生的平端（限制性内切酶作用产生的平端（Hpa I, Hpa I, SmaISmaI） 黏端经特殊酶处理变为平端黏端经特殊酶处理变为平端 T4 DNA连接酶催化平端连接连接酶催化平端连接目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切

27、酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连在末端转移酶在末端转移酶(terminal transferase)的作的作用下，在用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、片段末端加上同聚物序列、制造出黏性末端，再进行黏端连接。制造出黏性末端，再进行黏端连接。（1 1）附加同聚物（）附加同聚物（同聚物加尾连接同聚物加尾连接）. .修饰末端连接修饰末端连接5 3 3 5 载体载体DNA5 3 3 5 目的基因目的基因限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶 5 3 3 5 5 3 T(T)nT T(T)nT 3 5 5 3 3 5 5 3 A(A)nA A(

28、A)nA 3 5 -核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端转移酶末端转移酶+ dATP末端转移酶末端转移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体由平端加上新的含有由平端加上新的含有限制性酶切位点限制性酶切位点的的接头，再用限制酶切除产生黏性末端，接头，再用限制酶切除产生黏性末端，而进行黏端连接而进行黏端连接。 （2 2）附加人工接头）附加人工接头人工接头及其应用人工接头及其应用Eco REco REco R反转录酶反转录酶按照按照RNA分子中的减基序列，根据减基互补原则合分子中的减基序列，根据减基互补原则合成成DNA链链

29、重组重组DNA实验中常见的主要工具酶实验中常见的主要工具酶三、载体三、载体 (vector)1. 1. 定义定义 所谓载体是指能在连接酶作用下和外源所谓载体是指能在连接酶作用下和外源DNADNA片段或基因连接，并运送片段或基因连接，并运送DNADNA分子进入受分子进入受体细胞，具有自我复制能力的体细胞，具有自我复制能力的DNADNA分子分子。克隆载体克隆载体(cloning vector)(cloning vector)：为使插入的外源为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体。序列被扩增而特意设计的载体。表达载体表达载体(expression vector)(expression vec

30、tor)：为使插入的为使插入的外源外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体。的载体。（1 1）按功能分类：）按功能分类：整合载体（整合载体（integrated vectorintegrated vector）: :为把一个为把一个基因插入到染色体中而特意设计的载体。基因插入到染色体中而特意设计的载体。2 2、载体分类、载体分类（2 2）进入受体细胞类型分类：）进入受体细胞类型分类：u 穿梭载体（穿梭载体（Shuttle vector）：是能够在）：是能够在两类不两类不同宿主中同宿主中复制、增殖和选择的载体。如有些载复制、增殖和选择的载体。如有些载体既能

31、在原核细胞中复制又能在真核细胞中复体既能在原核细胞中复制又能在真核细胞中复制，或能在制，或能在 E. coli 中复制又能在革兰氏阳性细中复制又能在革兰氏阳性细菌中复制。菌中复制。u 原核载体原核载体u 真核载体真核载体（3 3）按载体来源分类：）按载体来源分类：u 噬菌体载体（入噬菌体、噬菌体载体（入噬菌体、 M13噬菌体）噬菌体）u 质粒载体质粒载体u 柯斯质粒柯斯质粒（Cosmid）u 细菌人工染色体细菌人工染色体（Bacterial Artificial Chromosome，BAC）u P1源的细菌人工染色体源的细菌人工染色体（P1-derived Artificial Chromo

32、some，PAC）u 酵母人工染色体酵母人工染色体（ Yeast Artificial Chromosome YAC）u 病毒载体病毒载体u 哺乳动物人工染色体哺乳动物人工染色体（Mammal Artificial Chromosome ，MAC）u 人类人工染色体人类人工染色体（Human Artificial Chromosome ，HAC）u 植物人工染色体植物人工染色体（Plant Artificial Chromosome ，PAC）常见载体的种类和特征常见载体的种类和特征载体类型载体类型受体细胞受体细胞结构结构插入片断插入片断举例举例 质粒质粒E. coli环状环状 9 kbpUC

33、18/19 , T-载体载体等等 噬菌体噬菌体E. coli线状线状9 24 kb gt系列系列丝状噬菌体丝状噬菌体E. coli环状环状10 kbM13mp系列系列柯斯质粒柯斯质粒E. coli环状环状35- 45 kbpJB8, pWE15/16BACE. coli环状环状300 kbPel oBAC系列系列PACE. coli环状环状100 - 2000 kbPCYPAC1YAC酵母细胞酵母细胞线性染色体线性染色体100 - 2000 kbMAC哺乳类细哺乳类细胞胞线性染色体线性染色体 1000 kb病毒载体病毒载体动物细胞动物细胞环状环状SV40 载体，昆虫载体，昆虫杆状病毒载体杆状病

34、毒载体穿梭载体穿梭载体动物细胞动物细胞和细菌和细菌环状环状pSVK3质粒，质粒，PBV,Ti质粒质粒3. 3. 载体的特点载体的特点 载体是运送目的基因片段进入宿主细胞的载体是运送目的基因片段进入宿主细胞的工具工具（1 1）能够）能够自我复制自我复制，并带动插入的外源基因一起复制；，并带动插入的外源基因一起复制；（2) 2) 具有合适的限制性酶切位点，具有合适的限制性酶切位点，多克隆位点（多克隆位点（MCSMCS）；）；（3 3）含有两个以上的合适的）含有两个以上的合适的筛选标记筛选标记；（4 4）细胞内）细胞内拷贝数拷贝数要多；要多；（5 5）载体的分子量要小，具有一定的）载体的分子量要小，

35、具有一定的承载外源承载外源DNADNA能力；能力；（6 6）细胞内）细胞内稳定性高稳定性高3.3.目前最常用的载体目前最常用的载体 质粒载体质粒载体 病毒病毒DNADNA载体载体 黏粒载体黏粒载体 噬菌粒载体噬菌粒载体 人工染色体人工染色体. .质粒载体质粒载体 （1 1）质粒）质粒(plasmid)(plasmid) 是是细菌细胞中自然存在于染色体外细菌细胞中自然存在于染色体外的遗传单位，的遗传单位，是一种是一种双链环状的双链环状的DNADNA分子分子，大小在，大小在1 1200kb200kb之间。之间。质粒自身含有复制起始点，与相应的顺式调控元件质粒自身含有复制起始点，与相应的顺式调控元件

36、组成一个复制子组成一个复制子(replicon)(replicon)，能利用细菌的酶系统，能利用细菌的酶系统进行独立的复制及转录。进行独立的复制及转录。 （2 2）DNADNA克隆常用载体特征图谱克隆常用载体特征图谱MCS（3 3）选择标记基因）选择标记基因 氨苄青霉素抗性基因氨苄青霉素抗性基因 (ampicillin resistance(ampicillin resistance，AmpAmpr r) ) 四环素抗性基因四环素抗性基因 (tetracycline resistance(tetracycline resistance，tettetr r) ) 大肠杆菌大肠杆菌LacZLacZ

37、基因基因p pB BR R3 32 22 2B Ba am mH HI IS Sa al lI IH Hi in nd dI II II IP Ps st tI IS Sc ca aI IA Am mp pr ro or ri i( (4 4. .3 36 6 k kb b) )载体载体pBR322pBR322的结构图的结构图重组DNAAmprTcs提取DNA 电泳AmprAmprAmprAmprTcrTcrTcAmprTcsTcs转化 无菌落阳性菌落筛选重组子2)DNA重组无DNA插入有DNA插入外源DNA1)限制酶切含Amp固体培养基含Amp+Tet固体培养基pUCpUC质粒载体系列质粒载

38、体系列LacZLacZ基因蓝白斑试验（基因蓝白斑试验（X-galX-gal，IPTGIPTG）半乳糖苷酶半乳糖苷酶LacZLacZ基因（编码半乳糖苷酶）基因（编码半乳糖苷酶）X-gal蓝色吲哚产物蓝色吲哚产物IPTGIPTG诱导诱导. .噬菌体载体噬菌体载体COSCOSCOSCOS注意：注意：噬菌载体作为载体，其重组噬菌体噬菌载体作为载体，其重组噬菌体DNADNA大大小只能：小只能： 38kb 52kb。噬菌体具有的一种位点特异的切割体系噬菌体具有的一种位点特异的切割体系(site-specific (site-specific cutting system), cutting system)

39、, 能识别两个相距适宜的能识别两个相距适宜的coscos位点位点(38-(38-45kb)45kb)，将多连体分子切割成，将多连体分子切割成单位长度的片段，并将它们单位长度的片段，并将它们包装到包装到噬菌体头部中去。噬菌体头部中去。体外包装：体外包装：噬菌载体噬菌载体 + + 尾部蛋白尾部蛋白 + + 头部蛋白头部蛋白 噬菌体载体主要用于噬菌体载体主要用于cDNA文库构建，也经常文库构建，也经常用于外源目的基因的克隆。用于外源目的基因的克隆。电穿孔法原理电穿孔法原理+Electrode 1Electrode 2+No VoltageMedium (conductivity = )Membran

40、e+Electrode 1Electrode 2+ Voltage -Medium (conductivity = )MembraneVoltage AcrossMembrane=charge/capacitanceplusminus 基本原理是利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌基本原理是利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔，形成细胞膜上进行电穿孔，形成可逆的瞬间通道可逆的瞬间通道，从，从而促进外源而促进外源DNADNA的有效吸收。的有效吸收。 +_五、克隆基因的表达五、克隆基因的表达 将外源目的基因克隆到将外源目的基因克隆到表达载体表达载体上，导上，导入受体细胞，并表达外源蛋白的过程

41、称为入受体细胞，并表达外源蛋白的过程称为外源基因的表达。外源基因的表达。 外源基因的表达涉及目的基因的克隆、外源基因的表达涉及目的基因的克隆、复制、转录、翻译、蛋白质产物的加工及复制、转录、翻译、蛋白质产物的加工及分离纯化等过程分离纯化等过程原核表达系统就是将克隆的外源基因原核表达系统就是将克隆的外源基因导入原核细胞，使其在细胞内快速、高效导入原核细胞，使其在细胞内快速、高效地表达基因产物。地表达基因产物。 主要宿主细胞有：主要宿主细胞有：大肠杆菌大肠杆菌、芽孢杆芽孢杆菌菌及及链霉菌链霉菌系统等系统等 （一）外源基因在原核细胞中的表达（一）外源基因在原核细胞中的表达大肠杆菌（大肠杆菌（E.co

42、li）表达体系）表达体系表达载体组成：表达载体组成： 选择标志选择标志 强启动子强启动子 多克隆位点多克隆位点 翻译调控序列翻译调控序列MCS不宜表达真核基因组不宜表达真核基因组DNA不能加工表达的真核蛋白质不能加工表达的真核蛋白质表达的蛋白质常形成不溶性表达的蛋白质常形成不溶性包涵体包涵体 (inclusion body) 很难表达大量可溶性蛋白很难表达大量可溶性蛋白E.coli表达体系的不足表达体系的不足1 1融合型表达蛋白融合型表达蛋白 所谓融合型表达是指将外源目的基因与所谓融合型表达是指将外源目的基因与宿主结构基因相拼接构建成融合基因进行宿主结构基因相拼接构建成融合基因进行表达这样产生

43、的蛋白质的表达这样产生的蛋白质的N N末端为宿主基末端为宿主基因序列因序列（可以是原核（可以是原核DNA或其它或其它DNA序列）序列）编码，编码，C末端由末端由外源目的基因编码外源目的基因编码。 2 2非融合型表达蛋白非融合型表达蛋白 是指外源目的基因不与宿主基因融合，是指外源目的基因不与宿主基因融合，直接从起始密码直接从起始密码AUG开始在原核调控元件开始在原核调控元件控制之下表达外源基因蛋白质。控制之下表达外源基因蛋白质。 非融合型表达的蛋白质具有类似天然蛋非融合型表达的蛋白质具有类似天然蛋白质的结构，其生物学功能也更接近于体内白质的结构，其生物学功能也更接近于体内的天然蛋白质。但其缺点是

44、容易被细菌蛋白的天然蛋白质。但其缺点是容易被细菌蛋白酶降解。酶降解。3 3分泌型表达蛋白分泌型表达蛋白 分泌型表达是利用具有信号肽编码序列分泌型表达是利用具有信号肽编码序列的的分泌型表达载体分泌型表达载体，将表达的蛋白质由细胞，将表达的蛋白质由细胞质跨膜分泌到细胞基质或细胞周质中。质跨膜分泌到细胞基质或细胞周质中。A. 载体含有载体含有: 原核克隆载体的复制子原核克隆载体的复制子 抗性筛选基因抗性筛选基因 多克隆位点序列多克隆位点序列（二）外源基因在真核中表达（二）外源基因在真核中表达真核表达载体大多是真核表达载体大多是穿梭载体穿梭载体。B.表达基因表达基因: 真核细胞的启动子、增强子、剪接信

45、真核细胞的启动子、增强子、剪接信号、转录终止信号号、转录终止信号PolyA化信号遗传选择化信号遗传选择标记等组件。标记等组件。C. 真核表达体系真核表达体系(宿主细胞宿主细胞)：酵母、昆虫、高等动物细胞酵母、昆虫、高等动物细胞真核表达体系优点：真核表达体系优点：可表达克隆的可表达克隆的cDNAcDNA及真核基因组及真核基因组DNADNA，可，可适当修饰适当修饰, ,表达的蛋白质表达产物分区域积表达的蛋白质表达产物分区域积累。累。 真核细胞具有翻译后加工系统，可进真核细胞具有翻译后加工系统，可进行行糖基化、磷酸化、乙酰化等修饰糖基化、磷酸化、乙酰化等修饰，使表，使表达蛋白形成正确的达蛋白形成正确

46、的天然构象天然构象，具有完整的，具有完整的生物学活性生物学活性。 某些真核细胞可将外源基因表达产物某些真核细胞可将外源基因表达产物直接分泌至细胞培养基中，简化了分离纯直接分泌至细胞培养基中，简化了分离纯化的操作。化的操作。真核表达体系真核表达体系缺点：缺点：操作技术难操作技术难 费时费时成本高成本高表达载体表达载体pFASTBACI 的物理图谱的物理图谱第第 二节二节 DNADNA基本操作技术基本操作技术一一. . 核酸凝胶电泳技术核酸凝胶电泳技术1. 1. 利用琼脂糖进行核酸电泳的原理：利用琼脂糖进行核酸电泳的原理：切胶回收切胶回收2. 2. 琼脂糖电泳分离琼脂糖电泳分离DNADNA的范围的

47、范围 琼脂糖可以形成各种形状、大小的孔隙度。琼琼脂糖可以形成各种形状、大小的孔隙度。琼脂糖凝胶分离脂糖凝胶分离DNADNA片度大小范围较广片度大小范围较广, ,不同浓度琼不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从脂糖凝胶可分离长度从200bp200bp至至50kb50kb的的DNADNA片段。片段。 琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。场下电泳。EB (Ethidium Bromide)EB (Ethidium Bromide)：它能够插入它能够插入DNADNA分子中的碱基对之间而与分子中的碱基对之间而与DNADNA结合。由结合。由于于EBEB分子的插

48、入，在紫外光的照射下，凝分子的插入，在紫外光的照射下，凝胶电泳中的胶电泳中的DNADNA条带呈现出橙色荧光，易于条带呈现出橙色荧光，易于检测。可以检测检测。可以检测10ng10ng的的DNADNA。注意：注意：EBEB是一种诱变剂并有中度毒性，是一种诱变剂并有中度毒性，操作时一定要注意安全操作，必须戴塑料操作时一定要注意安全操作，必须戴塑料或乳胶手套或乳胶手套!Agarose blockPositive electrodeDNA loaded inwells in the agaroseBlack backgroundTo make loading wells easierCombBuffer

49、DNADNA分子量标准分子量标准MarkerMarker 普通的琼脂糖凝胶电泳，很难分离大于普通的琼脂糖凝胶电泳，很难分离大于50kb的的DNA分子，而要进行超大分子研究，分子，而要进行超大分子研究，要用到脉冲电场凝胶电泳（要用到脉冲电场凝胶电泳（PFGE）。）。二二. PCR. PCR技术技术PCRPCR技术简史技术简史 PCRPCR的原理的原理 PCRPCR的反应体系和方法的反应体系和方法 PCRPCR的类型和应用的类型和应用( (一一) PCR) PCR技术简史技术简史ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋

50、酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶RNA引物RNA引物ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNA聚合酶DNA聚合酶 19711971年，年，KhoranaKhorana提出：经过提出：

51、经过DNADNA变性，与合适引物杂交，用变性，与合适引物杂交，用DNADNA聚合酶延伸引物，并不断重复该聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆过程便可克隆tRNAtRNA基因。基因。 但由于测序和引物合成的困难，但由于测序和引物合成的困难，以及以及7070年代基因工程技术的发明年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，使克隆基因成为可能，所以，K h o r a n aK h o r a n a 的 设 想 被 人 们 遗 忘的 设 想 被 人 们 遗 忘了了 19831983年年,Mullis,Mullis发明了发明了PCRPCR技术技术, ,使使KhoranaKhorana的设想得

52、到实现。的设想得到实现。 19881988年年SaikiSaiki等将耐热等将耐热DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqTaq）引）引入了入了PCRPCR技术技术 19891989年美国年美国ScienceScience杂志列杂志列PCR PCR 为十余为十余项重大科学发明之首项重大科学发明之首, ,比喻比喻19891989年为年为PCRPCR爆爆炸年炸年,Mullis,Mullis荣获荣获19931993年度诺贝尔化学奖。年度诺贝尔化学奖。Kary B. Mullis（1944）生物样品生物样品DNA片段PCR技术引物引物引物引物XXTaq DNA聚合酶（thermus aquaticus)()

53、40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20 实时荧光定量实时荧光定量PCR仪仪梯度梯度PCR仪仪普通普通PCR仪仪二、PCR的基本原理标准的标准的PCRPCR反应体系反应体系4 4种种dNTPdNTP混合物混合物 各各200umol/L200umol/L引物引物 各各1010100pmol100pmol模板模板DNA DNA 0.10.12ug2ugTaq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 2.5u2.5uMgMg2+ 2+ 1.5mmol/L1.5mmol/L模板DNA95PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点55引物1引物2DNA引物PCR的基本

54、原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点第1轮结束95第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72TaqTaqTaqTaq55PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第2轮结束PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增Cycle# of DNA copies1224416101,0241532,768201,048,5762533,554,432301,073,741,824Theor

55、etical DNA Amplification经典经典PCR循环参数（循环参数（500bp以内）以内）30次1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNADNA双螺旋双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍 Polymerase Chain Reaction (PCR):ATTTGATCGCTTTGACGCATCACACAGATTAGGCACCTGCTGAATAATAAACTAGCGAAACTGCGTAGTGTGTCTAATCCGTGGACGACTTATTTAAACTAGCGA

56、AACTCACCTGCTGAATAAGCGTAGTGTGTCTAATCCGTGGACGACTTATTATTTGATCGCTTTGACGCATCACACAGATTAGGACTGACTGMg+Mg+Mg+Mg+DENATURATIONPRIMER ANNEALINGPOLYMERASE RECOGNITIONMAGNESIUM COFACTOREXTENSIONTHE STRAND IS DUPLICATEDPCR反应的特点灵敏度高灵敏度高1.1.皮克皮克(pg=10(pg=10-12-12) )量级扩增到微克量级扩增到微克(ug=10(ug=10-6-6) )水平水平2.2.能从能从100100

57、万个细胞中检出一个靶细胞万个细胞中检出一个靶细胞3.3.病毒检测的灵敏度可达病毒检测的灵敏度可达3 3个个RFURFU4.4.细菌检测的最小检出率为细菌检测的最小检出率为3 3个细菌个细菌简便、快速简便、快速1.1.一次性加好反应液，一次性加好反应液，2 24 4 小时完成扩增小时完成扩增2.2.扩增产物一般用电泳分析扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低u血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提等组织的粗提DNADNA引物设计：引物设计：（1)序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。（2）引物长度以15-40 bp为

58、宜。（3）碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%。（4）引物内部避免形成二级结构。（5）两引物间避免有互补序列。（6）引物3端为关键碱基；5端无严格限制。3限制性内切酶的识别序列限制性内切酶的识别序列启动子序列启动子序列定点突变定点突变探针标记探针标记1.PCR1.PCR反应成份反应成份二、PCR反应体系和方法（2）引物浓度 0.1-0.5 0.1-0.5 mol/Lmol/L 浓度过高易导致模板与引物错配浓度过高易导致模板与引物错配, ,反应特异性下降反应特异性下降。（3）Taq DNA聚合酶 0.5-2.5 U/50 0.5-2.5 U/50 l l 酶量增加使反应特异性下降酶量增加使反

59、应特异性下降; ;酶量过少影响反应酶量过少影响反应产量。产量。（4）dNTP dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度浓度取决于扩增片段的长度 四种四种dNTPdNTP浓度应相等浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量降低反应产量 dNTPdNTP可与可与MgMg2+2+结合，使游离的结合，使游离的MgMg2+2+浓度下降，影浓度下降，影响响DNADNA聚合酶的活性。聚合酶的活性。（5 5） MgMg2+2+ MgMg2+2+是是DNADNA聚合酶的激活剂。聚合酶的激活剂。 0.5mmol/L-2.5mmol/L0.5mmol/L

60、-2.5mmol/L反应体系。反应体系。MgMg2+2+浓度过低会使浓度过低会使TaqTaq酶活性丧失、酶活性丧失、PCRPCR产量下降；产量下降；MgMg2+2+过高影响反应特异性。过高影响反应特异性。 2.2.循环参数循环参数(1)(1)变性变性 使双链使双链DNADNA解链为单链解链为单链 9595o oC 20-30C 20-30秒秒(2) (2) 退火退火 温度由引物长度和温度由引物长度和GCGC含量决定。含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结增加温度能减少引物与模板的非特异性结合合; ;降低温度可增加反应的灵敏性。降低温度可增加反应的灵敏性。三、PCR的类型和应用 研究研