BCA法测蛋白浓

1、1实验二实验二 BCABCA法测定蛋白质浓度法测定蛋白质浓度(BCA protein concentration determination )2内容内容 注意事项注意事项 前前 言言 实验目的实验目的 实验原理实验原理 思思 考考 实验步骤实验步骤3前前 言言前言前言一、蛋白质的理化性质一、蛋白质的理化性质？ （一）、蛋白质的胶体性质（一）、蛋白质的胶体性质 （二）、蛋白质的两性电离和等电点（二）、蛋白质的两性电离和等电点 （三）、蛋白质的变性、沉淀和凝聚（三）、蛋白质的变性、沉淀和凝聚 （四）、蛋白质的紫外吸收（四）、蛋白质的紫外吸收 （五）、蛋白质的呈色反应（五）、蛋白质的呈色反应 4（

2、一）、蛋白质的胶体性质（一）、蛋白质的胶体性质前言前言 蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1 1万至万至100100万之巨，其分子的直径可达万之巨，其分子的直径可达1 1100nm100nm，为胶粒范围之，为胶粒范围之内。内。 蛋白质胶体稳定的因素：颗粒表面电荷、水化膜蛋白质胶体稳定的因素：颗粒表面电荷、水化膜5（二）、蛋白质的两性电离和等电点（二）、蛋白质的两性电离和等电点蛋白质的两性电离蛋白质的两性电离 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液侧链中某些基团，在一定的溶

3、液pHpH条件下都可解离成带负电条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。荷或正电荷的基团。蛋白质的等电点蛋白质的等电点( isoelectric point, pI) ( isoelectric point, pI) 当蛋白质溶液处于某一当蛋白质溶液处于某一pHpH时，蛋白质解离成正、负离子时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pHpH称为蛋白质的等电点。称为蛋白质的等电点。前言前言6（三）、蛋白质的变性、沉淀和凝聚（三）、蛋白质的变性、沉淀和凝聚* * 蛋白质的变性蛋白质的变性(denaturation)

4、(denaturation) 在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其其理化性质改变和生物活性的丧失。理化性质改变和生物活性的丧失。* * 蛋白质沉淀（蛋白质沉淀（precipitationprecipitation） 在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变性的蛋白质易于沉缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但

5、并不变性。淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。 * * 蛋白质的凝固作用蛋白质的凝固作用(protein coagulation) (protein coagulation) 蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此此凝块不易再溶于强酸和强碱中。凝块不易再溶于强酸和强碱中。前言前言7 由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm280nm波波长处有特征性吸收峰。蛋白质的长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋与其浓度呈正比关系，因此可

6、作蛋白质定量测定。白质定量测定。前言前言（四）、蛋白质的紫外吸收（四）、蛋白质的紫外吸收8（五）、蛋白质的呈色反应（五）、蛋白质的呈色反应前言前言 蛋白质分子中的肽键及氨基酸残基的各种特殊基团，在蛋白质分子中的肽键及氨基酸残基的各种特殊基团，在一定条件下可以和某些化学试剂呈现一定的颜色反应，颜色一定条件下可以和某些化学试剂呈现一定的颜色反应，颜色的深浅与其浓度成正比。的深浅与其浓度成正比。 茚三酮反应茚三酮反应(ninhydrin reaction) (ninhydrin reaction) 双缩脲反应双缩脲反应(biuret reaction)(biuret reaction) 3.Foli

7、n- 3.Folin-酚试剂反应酚试剂反应 9前言前言二、蛋白质的测定方法二、蛋白质的测定方法？（一）紫外线吸收法（一）紫外线吸收法（二）双缩脲法（二）双缩脲法（三）（三）Folin-Folin-酚试剂法酚试剂法（四（四) )考马斯亮蓝结合法考马斯亮蓝结合法（五）改良微量凯式定氮法（五）改良微量凯式定氮法（六）（六）BCABCA法法10前言前言( (一）紫外吸收法一）紫外吸收法 由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在收高峰在280 nm280 nm波

8、长处。在此波长范围内，蛋白质溶波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值液的光吸收值(OD280)(OD280)与其含量呈正比关系，可用作与其含量呈正比关系，可用作定量测定。定量测定。 优点优点：是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类：是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。不干扰测定。 缺点缺点：准确度较差，嘌呤、嘧啶、核酸等容易干：准确度较差，嘌呤、嘧啶、核酸等容易干扰测定。扰测定。11前言前言 （二）（二）双缩脲法双缩脲法H2N-CO-NH2 + NH2-CO-NH2 H2N-CO-NH-CO-NH2 H2N-CO-NH2 + NH2-CO-NH2 H2N-CO-NH-CO-NH

9、2 NH3 NH3 双缩脲双缩脲 双缩脲反应：双缩脲在碱性条件下与铜离子结合生成双缩脲反应：双缩脲在碱性条件下与铜离子结合生成紫红色化合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比。紫红色化合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比。 优点：优点：操作简便、迅速、受蛋白质性质影响较小。操作简便、迅速、受蛋白质性质影响较小。 缺点：缺点：灵敏度较差，本法测定蛋白质范围灵敏度较差，本法测定蛋白质范围1-20mg1-20mg； 特异性不高特异性不高12前言前言 蛋白质含有两个以上的肽键蛋白质含有两个以上的肽键( (COCONHNH) )，因此有，因此有双缩脲反应，在碱性溶液中，能与双缩脲反应，在碱性溶液中，能与Cu2+Cu

10、2+形成络合物。形成络合物。FolinFolin酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进FolinFolin试试剂剂( (磷钼酸磷钼酸磷钨酸试剂磷钨酸试剂) )，蛋白质，蛋白质铜络合物能还原铜络合物能还原磷钼酸磷钼酸磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。蓝色强度与蛋白质的量成正比例。 优点：优点：是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法灵敏是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法灵敏10102020倍，较双缩脲法灵敏倍，较双缩脲法灵敏100100倍。倍。 缺点：缺点：其不足之处是此反应受多种因素干扰。其不足

11、之处是此反应受多种因素干扰。 （三）（三）Folin-Folin-酚试剂法酚试剂法13 考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250G-250染料在酸性条件下能与蛋白质结合，染料在酸性条件下能与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰值从使染料的最大吸收峰值从465nm465nm变成变成595nm595nm，溶液的颜色，溶液的颜色由棕红色变为蓝色，在由棕红色变为蓝色，在595nm595nm测定的吸光度值与蛋白质浓测定的吸光度值与蛋白质浓度成正比，故可用于蛋白质定量测定。度成正比，故可用于蛋白质定量测定。 优点：优点：简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高（比简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高（比LowryLowry法法灵敏灵

12、敏4 4倍）。倍）。 缺点：缺点：用于不同蛋白质测定时有较大的偏差；大量去用于不同蛋白质测定时有较大的偏差；大量去垢垢剂会使显色反应受到干扰；标准曲线有轻微的非线性；剂会使显色反应受到干扰；标准曲线有轻微的非线性；比色比色杯染色严重，影响重复性。杯染色严重，影响重复性。前言前言 （四（四) )考马斯亮蓝结合法考马斯亮蓝结合法14 蛋白质是机体内主要的含氮物质，而且氮元素的含量相蛋白质是机体内主要的含氮物质，而且氮元素的含量相当恒定，一般为当恒定，一般为16%16%，其他非蛋白质的含氮化合物所占得氮，其他非蛋白质的含氮化合物所占得氮量甚微。因此，测定生物样品的含氮量，即可推算蛋白质含量甚微。因此

13、，测定生物样品的含氮量，即可推算蛋白质含量。量。 优点：优点：准确度高，可测定不同形态样品。准确度高，可测定不同形态样品。 缺点：缺点：灵敏度低，适用于灵敏度低，适用于0.20.21.0mg1.0mg氮，误差为氮，误差为2 2费费时。时。前言前言 （五）改良微量凯式定氮（五）改良微量凯式定氮法法15（六）（六）BCABCA法法 碱性条件下，蛋白将碱性条件下，蛋白将Cu2+Cu2+还原为还原为Cu+,Cu+Cu+,Cu+与与BCABCA试剂形成试剂形成紫颜色的络合物，测定其在紫颜色的络合物，测定其在562nm562nm处的吸收值，并与标准曲处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。线

14、对比，即可计算待测蛋白的浓度。 优点：优点：操作简便、快速、灵敏度高，准确，试剂稳定性操作简便、快速、灵敏度高，准确，试剂稳定性好，经济实用，抗干扰能力强。好，经济实用，抗干扰能力强。前言前言 16 BCABCA蛋白质检测流程：蛋白质检测流程：前言前言17前言前言18前言前言19 1.1.学习学习掌握掌握BCABCA法测定蛋白质浓度的法测定蛋白质浓度的原理。原理。 2.2.掌握掌握721721型分光光度计的使用。型分光光度计的使用。 3.3.了解蛋白质测定的多种方法，并比较其优缺点。了解蛋白质测定的多种方法，并比较其优缺点。 实验目的实验目的实验目的实验目的20实验原理实验原理 BCA(bic

15、inchoninic acid,BCA(bicinchoninic acid,二辛可酸）碱性条件下，二辛可酸）碱性条件下，蛋白将蛋白将Cu+Cu+还原为还原为Cu+Cu+，Cu+Cu+与与BCABCA试剂形成紫颜色试剂形成紫颜色的络合物，测定其在的络合物，测定其在562nm562nm处的吸收值，并与标准处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。 BCABCA分子式：分子式：实验原理实验原理21 原理图原理图：实验原理实验原理22实验步骤实验步骤实验步骤（一）实验材料（一）实验材料1 1、器材、器材 721721型分光光度计、恒温水浴箱、移液管、试管

16、型分光光度计、恒温水浴箱、移液管、试管2 2、试剂、试剂 (1)(1)试剂试剂A:A:含含1%BCA1%BCA二钠盐、二钠盐、2%2%无水碳酸钠、无水碳酸钠、0.16%0.16%酒石酸酒石酸钠、钠、0.4%0.4%氢氧化钠、氢氧化钠、0.95%0.95%碳酸氢钠，将上述液体混合后碳酸氢钠，将上述液体混合后调调pHpH至至11.2511.25。（2 2）试剂）试剂B B：4%4%硫酸铜。硫酸铜。（3 3）BCABCA工作液：试剂工作液：试剂A100mL+A100mL+试剂试剂B2LB2L，混合。，混合。（4 4）蛋白质标准液：准确称取）蛋白质标准液：准确称取150mg150mg牛血清白蛋白，溶于

17、牛血清白蛋白，溶于100mL100mL蒸馏水中，即为蒸馏水中，即为1.5mg/mL1.5mg/mL的蛋白质标准液。的蛋白质标准液。 (5)(5)待测样品。待测样品。23实验步骤实验步骤（二）操作（二）操作241 1、将上述各管混匀后于、将上述各管混匀后于3737C C保温保温3030分钟，用分钟，用562nm562nm波长比色测定吸光度值。波长比色测定吸光度值。2 2、以蛋白质含量为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。、以蛋白质含量为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。3 3、用测定管光吸收值在标准曲线上查找相应的蛋白质含量，再计算出待测血清中、用测定管光吸收值在标准曲线上查找相应的蛋白质

18、含量，再计算出待测血清中蛋白质浓度（蛋白质浓度（g/L)g/L)。实验步骤实验步骤25注意事项注意事项1 1、紫外分光光度计的正确使用。、紫外分光光度计的正确使用。 2 2、试剂的准确量取，按操作表的顺序依次添加试剂。、试剂的准确量取，按操作表的顺序依次添加试剂。3 3、待测样品浓度在、待测样品浓度在505020002000微克毫升浓度范围内有较好的线性关系。微克毫升浓度范围内有较好的线性关系。 4 4、注意安全，保护好仪器。、注意安全，保护好仪器。注意事项注意事项261 1、试比较、试比较BCABCA法与双缩脲、法与双缩脲、LowryLowry法的异同。法的异同。2 2、BCABCA法常用于

19、科研，其有哪些特点。法常用于科研，其有哪些特点。思考思考27 1 1）预热仪器。）预热仪器。 2 2）选定波长。）选定波长。 3 3）固定灵敏度档。一般测量固定在）固定灵敏度档。一般测量固定在“1 1”档。档。 4 4）调节）调节“0 0”点。点。 5 5）调节）调节T=100T=100。 6 6）测定。）测定。 7 7）关机。）关机。紫外分光光度计的使用紫外分光光度计的使用28 下次实验：血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳下次实验：血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 预习要点：预习要点： 1 1、复习蛋白质两性解离。、复习蛋白质两性解离。 2 2、预习电泳的基本原理。、预习电泳的基本原理。 3 3、结合几种

20、蛋白质的等电点，为什么将点样端、结合几种蛋白质的等电点，为什么将点样端置置于阴极？于阴极？ 4 4、为什么跑在最前面是清蛋白？而跑在最后面、为什么跑在最前面是清蛋白？而跑在最后面是是r-r-球蛋白？球蛋白？ 5 5、如何辨认各条带？、如何辨认各条带？ 6 6、请简要写出操作流程图。、请简要写出操作流程图。 7 7、请写出计算公式。、请写出计算公式。2930内容内容 注意事项注意事项 前前 言言 实验目的实验目的 实验原理实验原理 思思 考考 实验步骤实验步骤31（三）、蛋白质的变性、沉淀和凝聚（三）、蛋白质的变性、沉淀和凝聚* * 蛋白质的变性蛋白质的变性(denaturation)(dena

21、turation) 在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其其理化性质改变和生物活性的丧失。理化性质改变和生物活性的丧失。* * 蛋白质沉淀（蛋白质沉淀（precipitationprecipitation） 在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变性的蛋白质易于沉缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。

22、淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。 * * 蛋白质的凝固作用蛋白质的凝固作用(protein coagulation) (protein coagulation) 蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此此凝块不易再溶于强酸和强碱中。凝块不易再溶于强酸和强碱中。前言前言32 考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250G-250染料在酸性条件下能与蛋白质结合，染料在酸性条件下能与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰值从使染料的最大吸收峰值从465nm465nm变成变成595nm595nm，溶液的颜色，溶液的颜色由棕红色变为蓝色，在由棕红色变为蓝色，在595nm595nm测定的吸光度值与蛋白质浓测定的吸光度值与蛋白质浓度成正比，故可用于蛋白质定量测定。度成正比，故可用于蛋白质定量测定。 优点：优点：简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高（比简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高（比LowryLowry法法灵敏灵敏4 4倍）。倍