试验三、转氨酶活力测定

1、实验三、实验三、 氨基移换反应氨基移换反应血液中转氨酶活力的测定血液中转氨酶活力的测定 指在转氨酶催化下指在转氨酶催化下将将 - -氨基酸的氨基转给氨基酸的氨基转给另一个另一个 - -酮酸，生成相酮酸，生成相应的应的 - -酮酸和一种新的酮酸和一种新的 - -氨基酸的过程氨基酸的过程, ,也称氨也称氨基移换作用。基移换作用。 转氨作用转氨作用一实验原理一实验原理血清中的谷血清中的谷- -丙转氨酶，在丙转氨酶，在3737、pH7.4pH7.4的条件下，可的条件下，可催化丙氨酸与催化丙氨酸与- -酮戊二酸反应生成谷氨酸和丙酮酸酮戊二酸反应生成谷氨酸和丙酮酸 丙酮酸可与丙酮酸可与2,42,4二硝基苯

2、肼发生加成反应，生成丙酮酸二硝基苯肼发生加成反应，生成丙酮酸- -2,4-2,4-二硝基苯腙，该产物在碱性环境中可转化成红棕色二硝基苯腙，该产物在碱性环境中可转化成红棕色的苯腙硝醌化合物，其颜色的深浅与丙酮酸的生成量，的苯腙硝醌化合物，其颜色的深浅与丙酮酸的生成量，亦即与谷丙转氨酶活性的高低成正比。通过标准曲线可亦即与谷丙转氨酶活性的高低成正比。通过标准曲线可以查出丙酮酸的生成量。以查出丙酮酸的生成量。* * 仪器仪器1. 51. 515cm15cm试管、刻度吸量管。试管、刻度吸量管。2. 2. 恒温水浴、离心机、恒温水浴、离心机、721721型分光光度计。型分光光度计。* * 试剂试剂1.0

3、.1mol/L pH7.41.0.1mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液0.1mol/L0.1mol/L磷酸氢二钠溶液磷酸氢二钠溶液0.1mol/L0.1mol/L磷酸二氢钾溶液磷酸二氢钾溶液 0.1mol/L pH7.4 0.1mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液。的磷酸盐缓冲液。 （两者以（两者以4 4：1 1体积比混合）体积比混合）三、仪器与试剂三、仪器与试剂 2. 2. 标准丙酮酸（含丙酮酸标准丙酮酸（含丙酮酸2.0mol/mL2.0mol/mL） 3. 3.谷谷- -丙转氨酶底物溶液丙转氨酶底物溶液( (含含- -酮戊二酸酮戊二酸2 mol/ml2 mol/ml及及DL-D

4、L-丙氨酸丙氨酸200 mol/ml) 200 mol/ml) 4. 2.44. 2.4二硝基苯肼溶液二硝基苯肼溶液 (0.02%,1mol/L HCl(0.02%,1mol/L HCl溶液溶液) )5. 0.4mol/L NaOH5. 0.4mol/L NaOH溶液溶液 。四、实验操作四、实验操作 1 1、标准曲线制作、标准曲线制作：1 1）、取）、取6 6支试管，分别标上支试管，分别标上0 0，1 1，2 2，3 3，4 4，5 5编号。编号。先将试管置于先将试管置于3737恒温水浴中保温恒温水浴中保温5 5分钟以平衡内外分钟以平衡内外温度。然后按下表所列的次序添加各试剂。温度。然后按下表

5、所列的次序添加各试剂。 2 2）、向各管内加入）、向各管内加入0.50.5毫升毫升2,4-2,4-二硝基苯肼溶液，二硝基苯肼溶液，3737保温保温1515分钟，接着分别向各管内加入分钟，接着分别向各管内加入0.4M0.4M氢氢氧化钠溶液氧化钠溶液5 5毫升。再毫升。再3737保温保温1515分钟，以分钟，以0 0号管号管作空白对照，测定作空白对照，测定520 nm520 nm的光吸收值。用丙酮酸的光吸收值。用丙酮酸的微摩尔数为横坐标，光吸收值为纵坐标，画出的微摩尔数为横坐标，光吸收值为纵坐标，画出标准曲线。标准曲线。 2、血清样品谷丙转氨酶活性的测定、血清样品谷丙转氨酶活性的测定1 1）、取）

6、、取3 3支试管，分别标上空白、样品支试管，分别标上空白、样品1 1、样品、样品2 2。向各。向各管内加入管内加入0.5 mL0.5 mL谷丙转氨酶底物、谷丙转氨酶底物、0.1 mL0.1 mL磷酸缓冲溶液磷酸缓冲溶液并摇匀，并摇匀，3737水浴保温水浴保温5 5分钟。分钟。2 2）、向样品管中分别加入）、向样品管中分别加入0.1 mL0.1 mL血清，血清，3737保温保温3030分钟。分钟。3 3）、向空白与样品管中分别加入）、向空白与样品管中分别加入0.5 mL 20.5 mL 2，4 4二硝基二硝基苯肼，摇匀，水浴保温苯肼，摇匀，水浴保温1515分钟。分钟。4 4）、向空白管中加入）、

7、向空白管中加入0.1 mL0.1 mL血清，摇匀。血清，摇匀。5 5）、向所以）、向所以3 3支试管中都加入支试管中都加入5.0 mL 0.4 M NaOH5.0 mL 0.4 M NaOH溶液，溶液，摇匀并水浴保温摇匀并水浴保温1515分钟后在分钟后在520 nm520 nm进行比色测定。进行比色测定。保温保温30分钟分钟五、实验结果五、实验结果 1、用测定吸光值在标准曲线上查出丙酮酸的生成量、用测定吸光值在标准曲线上查出丙酮酸的生成量2、计算：、计算： 丙酮酸物质的量（丙酮酸物质的量（mol） 谷丙转氨酶活性单位谷丙转氨酶活性单位/100mL= 1000 时间（时间（min）国际单位：在最

8、适温度下，国际单位：在最适温度下，1 1分钟内转化分钟内转化1 1mol底物的底物的酶量称为酶量称为1个酶单位（个酶单位（U）。）。Katal单位：在一定条件下，单位：在一定条件下，1 1秒钟内转化秒钟内转化1mol1mol底物所底物所需要的酶量。需要的酶量。 1 U16.67 nKat 1 Kat 6 107 U六、酶活力单位的定义六、酶活力单位的定义 1. 1. 在测定谷丙转氨酶活力时，应事先将底物、血清在在测定谷丙转氨酶活力时，应事先将底物、血清在3737水水浴中保温，然后在血清管中加入底物，准确记时。浴中保温，然后在血清管中加入底物，准确记时。2. 2.转氨酶只能作用于转氨酶只能作用于-L-L-氨基酸，对氨基酸，对D-D-氨基酸无作用。实验氨基酸无作用。实验室多用室多用-DL-DL-氨基酸。氨基酸。 3. 3. 进行样品测定时，加入进行样品测定时，加入2,4-2,4-二硝基苯肼溶液后要摇匀并保二硝基苯肼溶液后要摇匀并保温温1515分钟。分钟。4. 4. 血清样品的测定需在显色后血清样品的测定需