第一讲 细胞培养的基本要求

1、第一讲第一讲 细胞培养的基本要求细胞培养的基本要求 一、体外培养的概念一、体外培养的概念 就是将就是将活体结构成分活体结构成分或或活的个体活的个体从体内或其寄生体从体内或其寄生体内取出，放在内取出，放在类似于体内生存环境类似于体内生存环境的的体外环境体外环境中，让中，让其生长和发育的方法。其生长和发育的方法。1 1、组织培养：指从生物体内取出活的组织（多指组织块）、组织培养：指从生物体内取出活的组织（多指组织块）在体外进行培养的方法。在体外进行培养的方法。 2 2、细胞培养：指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外、细胞培养：指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进行培养的方法。进行培养的方法。 3

2、 3、器官培养：指从生物体内取出的器官（一般是胚胎器、器官培养：指从生物体内取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。二、细胞培养的基本要求二、细胞培养的基本要求n由于体外培养的细胞没有抗感染能力，由于体外培养的细胞没有抗感染能力，n因此防污染是决定培养成功的首要条件。因此防污染是决定培养成功的首要条件。n一切操作需要一切操作需要保证无菌保证无菌和有条不紊。和有条不紊。一）一） 细胞工程实验室条件细胞工程实验室条件1 1、无菌操作无菌操作：要求工作环境和条件必须保证无微生：要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和

3、不受其它有害因素的影响。物污染和不受其它有害因素的影响。2 2、防止微生物污染和有害因素影响防止微生物污染和有害因素影响，要求工作环境，要求工作环境清洁、空气清新，干燥和无烟尘。清洁、空气清新，干燥和无烟尘。3 3、无菌操作区设在室内较少走动的内侧无菌操作区设在室内较少走动的内侧，常规操作，常规操作和封闭培养于一室，为和封闭培养于一室，为1010万级洁净环境的洁净室万级洁净环境的洁净室。而。而洗刷消毒工作设在洁净室外，避免物品污染洁净室内洗刷消毒工作设在洁净室外，避免物品污染洁净室内环境。细胞洁净室需要一个空调系统并对外界保持一环境。细胞洁净室需要一个空调系统并对外界保持一定的正压。定的正压。

4、n准备室准备室n无菌间无菌间n操作间操作间n培养室培养室n分分析室析室二）细二）细胞培养的基本条件胞培养的基本条件细胞保存条件 ：液氮罐无菌条件：净化工作室，高效过滤器，生物安全柜， 超净工作台，紫外灯，电热干燥箱， 滤器，高压灭菌器，抗生素细胞生长条件：纯水蒸馏器，纯水仪，培养板， 培养瓶，CO2培养箱， 培养基，血清细胞检测条件：倒置显微镜，酶标仪，微孔板震荡器， 高速离心机，移液器1、常用仪器设备超净工作台 超净工作台的工作原理超净工作台的工作原理是利是利用用鼓风机鼓风机驱动驱动空气遁空气遁过高效过高效滤器滤器除去空气中的除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空

5、气徐徐通过工化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台面，使工作台内构成作台内构成无菌环境。无菌环境。 普通冰箱（4，20 ） 低温冰箱（20 ） 超低温冰箱（80 ）冰箱 烘干和干热灭菌玻璃器皿烘干和干热灭菌玻璃器皿100度度以下时再打开箱门以下时再打开箱门 塑料制品、橡塑料制品、橡胶等不能在干胶等不能在干燥箱内消毒燥箱内消毒电热干燥箱消毒灭菌灭菌锅全自动高压蒸汽灭菌锅 环氧乙烷灭菌日本SANYO*MLS-3750， MLS-3780 高压灭菌锅 COCO2 2培养箱培养箱：37 37 ，5 5 COCO2 2 。 使用使用COCO2 2培养箱应注意的问题培养箱应注意的问题 ： 用螺旋口瓶培养细

6、胞时，需将用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。瓶盖微松，以保证通气。 保持培养箱内空气干净。定期保持培养箱内空气干净。定期消毒（消毒（90 ，14 h)。 箱内箱内灭菌蒸馏水灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏毫升蒸馏水槽中以保水槽中以保持箱内持箱内湿度，避免培养湿度，避免培养液蒸发。液蒸发。 细胞培养箱显微镜倒置显微镜倒置显微镜离心机n1000转/分液氮温度：液氮温度：196不断挥发，及时补充不断挥发，及时补充细胞冷冻储存器超低温冰箱超低温冰箱：86n程序降温方法是利用程序降温盒设定程序由室温程序降温方法是利用程序降温盒设定程序由室温降低至降低至-80，最后再放置到液氮槽中长期保存。，最后

7、再放置到液氮槽中长期保存。冻存管滤 器自动双重纯水蒸馏器自动双重纯水蒸馏器 纯水仪纯水仪酶标仪酶标仪 微孔板震荡器微孔板震荡器移液器移液器培培 养养 皿皿培 养 板培培 养养 瓶瓶其他其他三）三） 无菌技术培养用品清洗培养用品清洗灭灭菌菌方法方法玻玻璃器皿的清洗璃器皿的清洗 浸泡浸泡 新瓶使用前用自来水简单刷洗，后用稀盐酸浸泡新瓶使用前用自来水简单刷洗，后用稀盐酸浸泡过夜。使用过的器皿应立即浸入水中，避免干涸难洗过夜。使用过的器皿应立即浸入水中，避免干涸难洗 刷洗刷洗 软毛刷沾洗涤剂洗涤软毛刷沾洗涤剂洗涤 浸酸浸酸 关键一环。关键一环。时间不少于时间不少于6小小时时，一般过夜。清洁，一般过夜。

8、清洁液变绿应重新配制。液变绿应重新配制。 冲洗冲洗 洗涤装置与手工烘洗涤装置与手工烘干、包装、高压（干、包装、高压（15磅磅20分钟）分钟）或干热（或干热（160度度2小时）小时）1、培养用品清洗清洁液的配制 常规清洗方法常规清洗方法：水中浸泡水中浸泡-2%NaOH煮沸煮沸10-20分钟分钟-自来水冲洗自来水冲洗2-3次次-1%盐酸浸泡盐酸浸泡30min-自来水冲洗自来水冲洗-蒸馏水清洗蒸馏水清洗2-3次次-包装包装高压灭菌高压灭菌胶塞的清洗 新购置胶塞新购置胶塞 有大量滑石粉，用自来水洗净，再常规处理有大量滑石粉，用自来水洗净，再常规处理包包 装装 局部包装 包装材料：皱纹包装纸、硫酸纸、棉

9、布、皱纹包装纸、硫酸纸、棉布、 铝饭盒及金属消毒筒铝饭盒及金属消毒筒 全包装 小物小物品装饭盒，注意期限，标明物品名。品装饭盒，注意期限，标明物品名。吸管用脱脂棉将管接口端堵塞，装入消毒筒，吸管用脱脂棉将管接口端堵塞，装入消毒筒，筒底垫棉花筒底垫棉花1.1.消毒消毒2.2.灭菌灭菌3.3.防腐防腐4.4.无菌无菌杀死物体上杀死物体上病原微生物病原微生物的方法；并不一定能的方法；并不一定能杀死含芽胞的细菌或非病原微生物杀死含芽胞的细菌或非病原微生物杀死物体上杀死物体上所有微生物所有微生物的方法。的方法。防止或抑制微生物生长繁殖的方法。防止或抑制微生物生长繁殖的方法。不存在活的微生物不存在活的微生

10、物。5.5.无菌操作无菌操作 防防止微生物进入机体或局部环境的操作技术。止微生物进入机体或局部环境的操作技术。重要概念重要概念2、灭菌方法蛋白质含水量（蛋白质含水量（%） 50 25 凝固所需温度凝固所需温度 56 18 6 0 76 8090 145 160170 结论一：结论一：蛋白质在湿热中较易凝固变性蛋白质在湿热中较易凝固变性 。热型温度（度）时间（h) 干热 130140 4 湿热 105.3 3 布层内温度 20层 40层 100层灭菌效果 86 72 70.5 不完全 101 101 101 完全 结论二：湿热的穿透力比干热强。 操作人员的手部？操作人员的手部？ 实验室桌面、地面

11、等？实验室桌面、地面等？细胞培养室中下列物品该如何消毒？细胞培养室中下列物品该如何消毒？ 玻璃培养瓶，移液管，玻璃培养瓶，移液管， 试管等玻璃器皿？试管等玻璃器皿？ 超净工作台台面？超净工作台台面？ 金属手术器械？金属手术器械？ 不耐热的液体培养基和胰蛋白酶等不耐热的液体培养基和胰蛋白酶等 ？ 橡胶塞和塑料瓶盖等？橡胶塞和塑料瓶盖等？ 细胞培养室？细胞培养室？物 品湿 热干 热过 滤培养室工作台玻璃制品金属器械塑料制品橡胶制品培养用液布类棉类紫 外化学气体消毒剂电离辐射四）细胞培养的常用液体四）细胞培养的常用液体p水水p平衡盐溶液平衡盐溶液p消化液消化液p消化酶抑制剂消化酶抑制剂ppHpH调整

12、液调整液p抗生素液抗生素液p谷氨酰胺补充液谷氨酰胺补充液水：新鲜配置的三蒸水或去离子水p水水p平衡盐溶液平衡盐溶液p消化液消化液p消化酶抑制剂消化酶抑制剂ppHpH调整液调整液p抗生素液抗生素液p谷氨酰胺补充液谷氨酰胺补充液平衡盐溶液：无平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液的缓冲液PBS：NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO4.H2O1.56gKH2PO40.24g加水至加水至1000ml，调节，调节pH至至7.4原代培养时常常需要将组织块消原代培养时常常需要将组织块消化解离形成细胞悬液，传代培养化解离形成细胞悬液，传代培养时也需要将贴壁细胞从瓶壁上消时也需要将贴壁细胞从瓶壁上消化下

13、来，常用的化下来，常用的消化液有胰酶消化液有胰酶（TrypsinTrypsin）溶液和）溶液和EDTAEDTA溶液，溶液，有时也用胶原酶（有时也用胶原酶（collagenasecollagenase）溶液等。溶液等。p水水p平衡盐溶液平衡盐溶液p消化液消化液p消化酶抑制剂消化酶抑制剂ppHpH调整液调整液p抗生素液抗生素液p谷氨酰胺补充液谷氨酰胺补充液血清抑制胰蛋白酶血清抑制胰蛋白酶p水水p平衡盐溶液平衡盐溶液p消化液消化液p消化酶抑制剂消化酶抑制剂ppHpH调整液调整液p抗生素液抗生素液p谷氨酰胺补充液谷氨酰胺补充液培养基培养基n细胞的生长需要一定的营养环境，用于维持细胞细胞的生长需要一定的

14、营养环境，用于维持细胞生长的营养基质称为培养基，即指所有用于各种生长的营养基质称为培养基，即指所有用于各种目的的体外培养、保存细胞用的物质，就其本意目的的体外培养、保存细胞用的物质，就其本意上讲为人工模拟体内生长的营养环境，使细胞在上讲为人工模拟体内生长的营养环境，使细胞在此环境中有生长和繁殖的能力。它是提供细胞营此环境中有生长和繁殖的能力。它是提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。养和促进细胞生长增殖的物质基础。无毒、无污染无毒、无污染 n体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没有抵抗能力，因此培养基应达到有抵抗能力，因此培养基应达到无化学物质

15、污染、无化学物质污染、无微生物污染无微生物污染（如细菌、真菌、支原体、病毒（如细菌、真菌、支原体、病毒等）、无其他对细胞产生损伤作用的生物活性物等）、无其他对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染（如抗体、补体）。质污染（如抗体、补体）。n对于对于天然培养基天然培养基，污染主要来源于取材过程及生，污染主要来源于取材过程及生物材料本身。对于物材料本身。对于合成培养基合成培养基，污染主要来源于，污染主要来源于配制过程，配制所用的水，器皿应十分洁净，配配制过程，配制所用的水，器皿应十分洁净，配制后应严格过滤除菌。制后应严格过滤除菌。 天然培养基天然培养基 n天然培养基是指来自动物体液或利用组织分离天然培

16、养基是指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基提取的一类培养基，如血浆、血清、淋巴液、鸡，如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。组织培养技术建立早期，体外培养胚浸出液等。组织培养技术建立早期，体外培养细胞都是利用天然培养基。细胞都是利用天然培养基。n但是由于天然培养基制作过程复杂、批间差异但是由于天然培养基制作过程复杂、批间差异大，因此逐渐为合成培养基所替代。目前广泛使大，因此逐渐为合成培养基所替代。目前广泛使用的天然培养基是用的天然培养基是血清。血清。 血清血清(serum) p血清种类血清种类: :主要是牛血清，培养某些特殊细胞也用人血主要是牛血清，培养某些特殊细胞也用人血清、马血清等。

17、清、马血清等。 p牛血清分为小牛血清牛血清分为小牛血清 (calf serum (calf serum ，CS) CS) 、胎牛血清、胎牛血清 ( (fetal bovine serumfetal bovine serum，FBSFBS) ) 。胎牛血清应取自剖腹产。胎牛血清应取自剖腹产的胎牛；新生小牛血清取自出生的胎牛；新生小牛血清取自出生2424小时之内的新生牛；小时之内的新生牛；小牛血清取自出生小牛血清取自出生10-3010-30天的小牛。天的小牛。p胎牛血清：（进口血清）要求剖腹取胎制成。胎牛血清：（进口血清）要求剖腹取胎制成。 p国内厂家往往不能做到，经常把出生国内厂家往往不能做到，

18、经常把出生2 2天以内采血称为天以内采血称为胎牛血清。胎牛血清。血清的使用血清的使用p使用前处理：使用前处理：大部分血清在使用前必须灭活处理，大部分血清在使用前必须灭活处理，即即5656水浴锅处理水浴锅处理3030分钟。灭活的目的是灭活血分钟。灭活的目的是灭活血清中的补体和支原体。清中的补体和支原体。p血清经过灭活也会损失一些对细胞有利的成分，血清经过灭活也会损失一些对细胞有利的成分，如生长因子，因此也有人提出血清不经灭活直接如生长因子，因此也有人提出血清不经灭活直接用于培养，前提是确认血清中不含补体成分。用于培养，前提是确认血清中不含补体成分。GibcoGibco 血清血清合成培养基合成培养

19、基 n基本培养基包括四大类物质：无机盐、氨基酸、基本培养基包括四大类物质：无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物。维生素、碳水化合物。 MEMMEM细胞培养基系列；细胞培养基系列； DMEMDMEM细胞培养基系列细胞培养基系列RPMI-1640RPMI-1640细胞培养基系列；细胞培养基系列； 199199细胞培养基系列细胞培养基系列 水解乳蛋白细胞培养基；水解乳蛋白细胞培养基； 欧氏平衡盐欧氏平衡盐F-10F-10，F-12F-12细胞培养基系列；细胞培养基系列； 其它类型细胞培养基其它类型细胞培养基HycloneHyclone 培养基培养基n人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞人工合成培

20、养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。血清）。n血清中含有：血清中含有：多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）铁蛋白等）多种金属离子；多种金属离子；激素；激素；促贴附促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等各种各种生长因子生长因子转移蛋白转移蛋白不明成分不明成分n胰蛋白酶胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离使细胞分离n胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。会损伤细胞。n胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+Ca2+、Mg2+Mg2+的的PBSPBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.250.25。用。用滤器过滤除菌。滤器过滤除菌。n胰蛋白酶液消化时间：胰蛋白酶液消化时间：2-102-10分钟。分钟。n血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用，可以用血清血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用，可以用血清来终止胰蛋白酶的消化来终止胰蛋白酶的消化消化液：消化液：n在