第五章低压液相层析色谱技术ppt课件

1、慢慢中等中等快快Temporal course淋洗液淋洗液液相色谱法：以液体为流动相的色谱法称。液相色谱法：以液体为流动相的色谱法称。表表11.1 11.1 两种不同方式液相色谱的这样特征两种不同方式液相色谱的这样特征 国产常压液相色谱系统的组成国产常压液相色谱系统的组成层析柱层析柱恒流泵恒流泵核酸蛋白检测仪核酸蛋白检测仪自动分部搜集器自动分部搜集器记录仪记录仪 层析柱a自制简易层祈柱1玻璃管；2.橡皮塞；3尼龙网；b普通商品柱；c双底板层析柱1.洗脱液进出口；2.多孔底板；3柱床；4恒温水进口；5恒温水出口；6可调理的塞子 层析柱：填料的充填恒流泵：提供稳定的液流紫外检测仪：信号检测部分搜集

2、器：样品的分部搜集部分搜集器：样品的分部搜集记录仪：记录信号 BS100自动部分搜集器安装圈1反全阀；2换管臂；3滴管；4，5换管臂固定螺丝；6.竖杆；7.竖杆囤定螓丝；8报警板；9.试管；10搜集盘；11.时间选挥旋钮；12.时间选择固定螺钉；13自动开关；14、指示灯；15.电源开关；16换向开关逆、顺；17手动开关 层析系统衔接表示图 1密封橡皮塞；2恒压管，3，恒压瓶；4，层析流出液，5可调蜾旋夹；6.自动搜集器； 7.核酸一蛋白质检测仪2、GE AKTA systemsAKTA primeAKTA explorerAKTA FPLC3、Bio rad systems层析柱层析柱 层析

3、柱通常是玻璃的。总的层析柱通常是玻璃的。总的说来，长柱分辨好。说来，长柱分辨好。但大量物质的处置那么用粗但大量物质的处置那么用粗的柱比较适宜。的柱比较适宜。 溶胀：称取适量凝胶干粉，用约溶胀：称取适量凝胶干粉，用约1010倍蒸馏水浸倍蒸馏水浸泡泡2424小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上层小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上层悬浮物及蒸馏水。悬浮物及蒸馏水。 碱洗：用碱洗：用0.5 M NaOH 0.5 M NaOH 溶液浸泡半个小时，然后溶液浸泡半个小时，然后用蒸馏水洗至中性。用蒸馏水洗至中性。 酸洗：用酸洗：用0.5 M HCl 0.5 M HCl 溶液浸泡半个小时，然后溶液浸泡半个小时，然

4、后用蒸馏水洗至中性。用蒸馏水洗至中性。 平衡：用起始缓冲液浸泡凝胶，直至凝胶液平衡：用起始缓冲液浸泡凝胶，直至凝胶液pHpH与起始缓冲液一样。与起始缓冲液一样。 在用溶剂平衡时，先使资料沉淀，用倾泻法除去在用溶剂平衡时，先使资料沉淀，用倾泻法除去悬浮的细颗粒，否那么由于细颗粒的堵塞，溶剂悬浮的细颗粒，否那么由于细颗粒的堵塞，溶剂的流速将显著降低。的流速将显著降低。 二、装柱二、装柱 装柱是最关键的一步。装柱是最关键的一步。重力沉降法装柱重力沉降法装柱陆续不断地添加糊状物，使其构成的胶粒床面陆续不断地添加糊状物，使其构成的胶粒床面上有胶粒延续均匀地沉降，直至装柱物完全沉上有胶粒延续均匀地沉降，直

5、至装柱物完全沉降至适当的柱床体积为止。降至适当的柱床体积为止。 柱的外表一直要坚持着一层溶剂柱的外表一直要坚持着一层溶剂( (普通普通l l3cm3cm柱高柱高) )柱的任何一部分绝对不能柱的任何一部分绝对不能“流干。流干。 层析柱正式运用前，必需平衡至所需的层析柱正式运用前，必需平衡至所需的pHpH和离子强度，普和离子强度，普通用起始缓冲液在恒定压力下走柱，其洗脱体积相当于通用起始缓冲液在恒定压力下走柱，其洗脱体积相当于3-53-5倍床体积，使交换剂充分平衡，柱床稳定。装好的柱必需倍床体积，使交换剂充分平衡，柱床稳定。装好的柱必需均匀，无纹路，不含气泡，柱顶交换剂堆积外表非常平坦。均匀，无纹

6、路，不含气泡，柱顶交换剂堆积外表非常平坦。 检查柱能否均匀，可用蓝色葡聚糖检查柱能否均匀，可用蓝色葡聚糖20002000，在恒压下走柱，在恒压下走柱，如色带均匀下降，阐明柱是均匀的，可以运用，否那么应如色带均匀下降，阐明柱是均匀的，可以运用，否那么应重新装柱重新装柱 四、加样量和加样体积四、加样量和加样体积 加样量的多少和加样体积大小是影响分别效果的关键要加样量的多少和加样体积大小是影响分别效果的关键要素，加样量越少和加样体积越小，那么分别效果越好。素，加样量越少和加样体积越小，那么分别效果越好。它主要取决于层析目的它主要取决于层析目的( (分析性柱层析或制备性柱层析分析性柱层析或制备性柱层析

7、) )，也与样品中种类多少，相对浓度及亲和力有关。也与样品中种类多少，相对浓度及亲和力有关。对于分析性柱层析，加样量普通不超越床体积对于分析性柱层析，加样量普通不超越床体积0.5-10.5-1，制备性柱层析加样量不超越制备性柱层析加样量不超越1-31-3。 离子交换剂的加样量远远大于分子筛。离子交换剂的加样量远远大于分子筛。假设要求高分辨率时，如分析性柱层析和精制要求高纯假设要求高分辨率时，如分析性柱层析和精制要求高纯度产品时，那么样品的体积尽能够小。度产品时，那么样品的体积尽能够小。 2 2加样方法加样方法 有有3 3种方法可将样品加到已制备好的柱顶：种方法可将样品加到已制备好的柱顶：1.

8、1.简单的方法是放除柱床外表以上的溶液，然后小心简单的方法是放除柱床外表以上的溶液，然后小心地用移液管加样；地用移液管加样；坚持柱上端胶面平整、柱内无气泡和胶床不干裂非常坚持柱上端胶面平整、柱内无气泡和胶床不干裂非常重要。重要。为此，除加样时留意不破坏胶面平整外，在整个层析为此，除加样时留意不破坏胶面平整外，在整个层析过程中，应在胶面上端保管适宜体积的洗脱液过程中，应在胶面上端保管适宜体积的洗脱液( (约约1-2 1-2 cmcm柱高柱高) )，防止洗脱液滴入柱内时，破坏胶面的平整或，防止洗脱液滴入柱内时，破坏胶面的平整或能够呵斥胶床干裂。能够呵斥胶床干裂。2. 2.不需求让柱流干至床外表，不

9、需求让柱流干至床外表，而是参与而是参与1 1浓度的蔗糖来添浓度的蔗糖来添加样品的密度；加样品的密度；3. 3. 用一个毛细管和一个注射用一个毛细管和一个注射器或蠕动泵把样品直接传送器或蠕动泵把样品直接传送到柱外表到柱外表( (如一些商品柱附有如一些商品柱附有专门加样安装专门加样安装) )。 洗脱洗脱 用适当的洗脱液把各组分依次从柱上洗脱下来。用适当的洗脱液把各组分依次从柱上洗脱下来。运用洗脱法溶剂与柱的相互作用比溶质与柱的相互作运用洗脱法溶剂与柱的相互作用比溶质与柱的相互作用弱，溶剂越过结合的分子，逐渐地将它们从柱上冲用弱，溶剂越过结合的分子，逐渐地将它们从柱上冲洗下来。洗下来。在冲洗过程中各

10、组分由于吸附力不同而逐渐分别。在冲洗过程中各组分由于吸附力不同而逐渐分别。六、流速及控制六、流速及控制 洗脱液流速也往往影响层析的分辨率洗脱液流速也往往影响层析的分辨率在整个分别过程中，洗脱液经过柱时坚持稳定的在整个分别过程中，洗脱液经过柱时坚持稳定的流速是非常重要的。流速是非常重要的。与流速有关的要素与流速有关的要素 所用介质的构造、粗细及数量；所用介质的构造、粗细及数量；层析柱大小，介质填装的松紧层析柱大小，介质填装的松紧; ;洗脱液的粘度、操作压等洗脱液的粘度、操作压等. . 必需根据详细条件反复实验以必需根据详细条件反复实验以确定一个适宜的流速。确定一个适宜的流速。太高的流速使洗脱峰加

11、宽，继太高的流速使洗脱峰加宽，继而降低了分辨率；而降低了分辨率；过高时，有时会使流速先快后过高时，有时会使流速先快后慢甚至发生阻塞。慢甚至发生阻塞。流速可以经过调理流速可以经过调理“操作压操作压来控制，来控制，“操作压相当于在操作压相当于在柱上部的贮液瓶中溶剂的程度柱上部的贮液瓶中溶剂的程度和柱出水口位置的程度之差。和柱出水口位置的程度之差。获得稳定流速的另一方法是利用蠕动泵把洗脱获得稳定流速的另一方法是利用蠕动泵把洗脱液泵入或泵出柱，并坚持稳定流速。液泵入或泵出柱，并坚持稳定流速。 七、分部搜集七、分部搜集 洗脱液必需分成小部分搜集，每一部分相当于洗脱液必需分成小部分搜集，每一部分相当于25

12、25的床体积。的床体积。这些部分普通被搜集在试管中，使得在柱上曾经分这些部分普通被搜集在试管中，使得在柱上曾经分别的化合物依然处于分别的形状。别的化合物依然处于分别的形状。每管搜集的体积愈小，愈容易得到纯的组分。每管搜集的体积愈小，愈容易得到纯的组分。已有各种商品的自动部分搜集器已有各种商品的自动部分搜集器(fraction collector) (fraction collector) 。它们设计成当一个。它们设计成当一个管中搜集了一定量的洗脱液后一个新管中搜集了一定量的洗脱液后一个新的搜集管自动地接替了它的位置。的搜集管自动地接替了它的位置。预先确定的体积转移到每一个管中，预先确定的体积转

13、移到每一个管中，或用电子控制的方法使预定的滴数滴或用电子控制的方法使预定的滴数滴入每一管。在一个固定的时间内，让入每一管。在一个固定的时间内，让洗脱液进入每个管。洗脱液进入每个管。八、检测和合并搜集八、检测和合并搜集 洗脱液按一定的体积分别搜集于试管中，为了测定搜集的洗脱液按一定的体积分别搜集于试管中，为了测定搜集的各部分中各种成分的分布须用一些能特异地检测被分别化各部分中各种成分的分布须用一些能特异地检测被分别化合物的方法来进展分析，普通可用直接或间接方法，合物的方法来进展分析，普通可用直接或间接方法， 直接法直接法: : 分光光度法、光折射法、荧光法和放免法等。分光光度法、光折射法、荧光法

14、和放免法等。 间接法间接法: : 化学显色法、等电聚焦法、电泳法、薄层层析法化学显色法、等电聚焦法、电泳法、薄层层析法和生物活性测定法等。和生物活性测定法等。假设某一化合物具有特征性物理特性，对可见光或紫假设某一化合物具有特征性物理特性，对可见光或紫外光有吸收，如蛋白质在外光有吸收，如蛋白质在280nm280nm，核酸在，核酸在260nm260nm处有最处有最大的吸收。可用核酸白质检测仪。大的吸收。可用核酸白质检测仪。洗脱液的合并方法对目的物质量和产量有较大的影响。洗脱液的合并方法对目的物质量和产量有较大的影响。欲得高纯度的化合物，普通根据洗脱峰位置搜集合并欲得高纯度的化合物，普通根据洗脱峰位

15、置搜集合并较窄的部分；较窄的部分；欲得产量较多目的物，那么合并较宽部分。欲得产量较多目的物，那么合并较宽部分。九、洗脱峰的纯度鉴定九、洗脱峰的纯度鉴定 由于检测系统的分辨率有限所以一个对称的洗由于检测系统的分辨率有限所以一个对称的洗脱峰并不一定代表一个纯真的组分。脱峰并不一定代表一个纯真的组分。假设洗脱峰峰形不对称，或出现假设洗脱峰峰形不对称，或出现“肩肩(shoulder)(shoulder)，那么表示混有杂质。，那么表示混有杂质。对在一个特定的柱层析分对在一个特定的柱层析分别条件下显示出的每个峰别条件下显示出的每个峰要用几个纯度规范要用几个纯度规范( (普通普通2- 2-3 3个高分辨率方

16、法个高分辨率方法) )来检验，来检验，才干确定它的均一性。才干确定它的均一性。例如，可采用例如，可采用SDSSDS电泳法、电泳法、等电聚焦法、高效液相层等电聚焦法、高效液相层析法和测定析法和测定N N末端氨基酸末端氨基酸残基方法等。残基方法等。十、脱盐和浓缩十、脱盐和浓缩 洗脱峰在纯度鉴定的根底上，将同一组分合并。洗脱峰在纯度鉴定的根底上，将同一组分合并。假设欲得到某一产品，有必要依次经过减压薄膜浓缩法或假设欲得到某一产品，有必要依次经过减压薄膜浓缩法或超滤超滤( (去盐、去水去盐、去水) )，透析去盐，透析去盐再用冰冻枯燥或有机溶剂沉淀等方法处置，得到干粉或沉再用冰冻枯燥或有机溶剂沉淀等方法

17、处置，得到干粉或沉淀。淀。科研、消费中要得到高纯度组分，往往要经过几次柱科研、消费中要得到高纯度组分，往往要经过几次柱层析层析每次柱层析后，某一峰的洗脱液可依次用透析法除盐每次柱层析后，某一峰的洗脱液可依次用透析法除盐超滤或减压薄膜浓缩法将样品浓缩到一定体积后，再超滤或减压薄膜浓缩法将样品浓缩到一定体积后，再上第二次柱。上第二次柱。 十一、凝胶的再生及保管十一、凝胶的再生及保管1 1、再生、再生( (普通无需做再生处置普通无需做再生处置) )用过的凝胶经用过的凝胶经0.5M0.5M的的NaOH(NaOH(含含0.5M0.5M的的NaCI)NaCI)混混合液浸泡合液浸泡当污染严重时用当污染严重时用0.5MHCl0.5MHCl做短暂处置做短暂处置2 2、防霉、防霉 0.02% 0.02%叠氮钠或叠氮钠或0.002%0.002%