世界卫生组织人类精液及精子-宫颈粘液相互作用实验室检验手册第五版

本手册的出版由UNDP/UNFPA/WHO/世界银行人类生殖研究、发展和研究(UniversityofCalifornia,Davis,CA,USA)提供形态学显微照片以及对媒体文件的精子细胞；DrGaryNClarke(TheRoyalWomen´sHospital,Carlton,Australia),DrRoelofMenkveld(TygerbergAcademicHospitalandUniversityofStellenbosch,这个版本的手册是为纪念已故前WHO男性生育调控方法学工作组负责人AIartificialinsemination人工授精AIDartificialinseminationwithdonorsemen供精人工AIHartificialinseminationwithhusband’ssemen夫精人ALHamplitudeoflateralheaddisplacement头侧摆振幅ANOVAanalysisofvariance变量分析APAAPalkalinephosphatase:anti-alkalinephosphatasecomplex碱性磷酸酶:抗ARacrosome-reacted顶体反应ARTassistedreproductivetechnology辅助生殖ASAanti-spermantibody抗精子BCFbeat-crossfrequency(Hz)交打BWWBiggers,WhittenandWhittingham试液CASAcomputer-aidedspermanalysisCASMAcomputeraidedspermmorphometricassessment计算机辅助精子形态评估CBAVDcongenitalbilateralabsenceofthevasdeferens先天性双侧输精管缺失CDcytoplasmicdropleCD45clusterofdetermination45(pan-leukocytemarker)决定簇45(全白细胞标CD46clusterofdetermination46(acrosomalantigen)决定簇4DNAdeoxyribonucleicacid脱氧DPBSDulbecco’sphosphate-bufferedsalineDulbecco’s磷DVDdigitalversatiledisc数字externalqualityassurancexcessresidualcytoplagameteintrafallopiantransfer输hydrogenperoxide过氧化氢Hanks’balancedsaltsolutionHankshCGhumanchorionicgonadotrophin人绒毛膜促性腺HIVhumanimmunodefciencyvirus人免疫HOPhamsteroocytepenetration仓HOShypo-osmoticswelling低渗HPFhighpowerfield高倍HRPhorseradishperoxidase辣根过HSAhumanserumalbuminxivHTFhumantubalfuid人输IBTimmunobeadtest免ICSIintracytoplasmicsperminjection胞Igimmunoglobulin免IUIintrauterineinsemination宫腔内KRMKrebs-RingerMediumKrebs-Ringer培LLQlowerlimitofquantifcation定量下限LPFlowpowerfieldMADmeanangulardisplacement平MAImultipleanomaliesindex复合异MARmixedantiglobulinreaction混合抗球NAnumericalaperture数值孔径NPnon-progressive(motilityPBSphosphate-bufferedsaline磷酸缓PMSGpregnantmareserumgonadotrophin孕PNPGp-nitrophenolglucopyranoside对硝基苯酚吡PSAPisumsativumagglutinin碗RCFrelativecentrifugalforce相RIrefractiveindex屈光RNAribonucleicacid核糖ROSreactiveoxygenspecies活性氧rpmrevolutionsperminute每分钟转速SOPstandardoperatingprTBSTris-bufferedsTGGTyrode’sglucoseTZIteratozoospermiaindex畸VAPaveragepathvelocity平均轨道VSLstraight-line(rectilinear)velocity直线速率WHOWorldHealthOrganization世界卫WOBwobble(VAP/VCL)摆动该手册已改版三次，被译成多国语言。过去30年中，该手册作为全球范围内的些试验用于某些特定情况下或由实验人员选择研究试验（这些试验目前不作到对睾丸和附睾获得精子的制备。本手册中散在分布的方法学注释框有注解(方法学解释)、评论（结果解释）以及说明框精液分析章节包括涉及工作溶液的配制、操作流程、精子计数及对结果解释的详细描述，以使所有给出的方法学都非常完整，与手册中其它章节内容的扩展了精子制备部分的内容，增加了关于精子冷冻保存的新章节。与宫颈粘液分析相关的操作规程被分到可供选择的试验章节及附录中粘液特征的检查与先前的版本相比，第五版的附录内容减少。这部分内容仅限于特殊的或者精子数目的评估。对于一份精液标本的检查，精液的稀释度和评估精子数目所需观察的计数池区域的大小均有所改变，每次需计数200条精子。新版手册中强调了抽样误差的重要性及计数结果的确定性。编辑委员会认为每次排精的总数目比精子密度能更准确的评估睾丸功能，但这要求对精液量的测定无精子症的评估。这尽管表面看起来简单，但很多因素会影响无精子症的诊断，包括计数太少数目精子导致的明显误差，观察显微镜视野的数目，以及检验布满碎片精子沉淀物的困难度。本手册推荐改为检验固定后、未离心的标本，以及指出所用计数方法的灵敏度。然而，当需收集足够数目的精子用于治疗时，离心方法仍是必需的。另外，手册中也介绍了通过检验未固定标精子活力的评估。第五版与先前版本的主要不同在于对精子活力的分级。目前推荐精子活力被分为前向运动、非前向运动的不动精子（而不再分为a,b,精子形态的评估。一些实验室仅仅评估正常精子的比例，然而有些人认为形质控。此章第五版为重新编写。精液分析过程的健全对于精液分析严格质控精液样本。传统统计学方法为取双向参考区间的第2.5百分位作为阈值，低本手册所载的方法可作为指南以增进精液的综合分析和可比性。但并非为这些多变的非可控因素解释了众所周知的个体精液成分的变化(Bake1996;Carlsen等,2004;(以上数据提供由先灵葆雅和拜耳药业提供)精液分析包括以下几个步骤(在以后章节中详述):【在最初五分钟】将受精精液样本容器放置在温控台或水浴箱里(37℃)等待液化。在30到60分钟期间评估精液的液化情况和物理性状。如有需要则检测精液的pH值。准备湿片观察显微镜下精子的活动情况，计数时还需进行稀释。如活动精子较少，需评估精子活动率。制作精液涂片评估精子形态。对精液进行稀释后做精子密度评估。对精子进行计数。如有需要可进行抗免疫珠混合反应检测。如发现圆形细胞则可检测过氧化酶阳性细胞。【在当日稍后（如冷冻样本则可在次日）】些高度黏稠的样本减轻粘稠的方法同处理精液液化延精液主要是由精囊腺和前列腺的分泌物和占小部分的尿道球腺和附睾分泌注释1：低精液体积是生殖道梗阻或先天性双侧输精管缺如（CBAVD）(delaTaille等,1998;Weiske等,2000;Daudin等,2000;vonEckardstein等,2000)的特精液pH值主要反映出由精囊腺分泌的碱性液体和之间的平衡情况。应在精液液化30分钟后进行，无对于生育男性精液pH值的参考值尚未确定，现保松分类的精子数目（见框2.7和2.10，表准化，以保持精子在固定厚度约20µm条件下自由游动盖上22mm×22mm的盖玻片，形成近20µm厚度框2.4湿片的厚度：2.4.3节)或精子的凝集(见2.4.4节)。在一起，为非特异性聚集(图2.2),这种情况应如实记录。应其程度(1-4级))和吸附状态(A-E级)也应记录(Rose等，1976)(见图涉及部分聚集等级完全分离聚集精子数<10多数精子为游离状态中等聚集聚集精子数10~50有游离精子高度聚集聚集精子数>50部分精子游离所有精子均聚集一团，无游离精子1.轻度聚集指每个凝块中少于10条精子；A.头对头C.尾端对尾端D.混合型E.纠结型注释1:存在凝集并不能充分证实为不育的免疫性原因，但是能够说明有抗精子抗体的存在；还需进一步检查以明确诊断(见2.20节)。注释2:严重的精子凝集能够影响对精子活力和密度的评估。精液中常含有一定的非精子细胞成分，部分与临床关系密切。通常包括泌尿生殖道上皮细胞、前列腺细胞、生精细胞和白细胞，后两种统称为“圆细胞”(Johanisson等，2000)。这些细胞成分在染色后的涂片中(放大1000倍)难以区别(见2.12节，表13和14,以及2.19节)。可以通过过氧化物酶技术和全白细胞单克隆抗原技术来进行鉴别。非精子细胞成分计数用与精子相同的方法进行，或根据染片(见节)中生精细胞或白细胞与精子的比例来进行计算。(山东中医药大学第二附属医院生殖中心董乾江苏无锡妇幼保健院生殖中心王洪华)精子活力评估应在精液样本液化后尽快（最好在30分钟之内）进行，务必在射精后1个小时之内进行。防止时间过长，因脱水、pH值及温建议采用一个简单的精液运动分类方法，该方法根据精子运动功能的不同分进行细分，如将在37℃下精子运动速度大于25微米/秒的定义为A等，这种方℃。·在离盖玻片至少5μm的区域内观察精子的运动（盖玻片边缘的精子运动M987654321情况下)。011223456789框2.6:关于百分比的比例值和差值处理百分比要四舍五入成整数，若尾数是0.5则将其转换至离两者均数，如将32.5%写成32%,而将3.5%写成4%。这些四舍五入成的百分比全部加起来可能不等于100%。对照表2.1,若两个标本PR、NP、IM比例的差值刚好等于可接受的最大差新计数。(千万不要再做一份相同的标本，计算三个标本的平均值，或者选择数例1:某两份精液标本(每个标本的精子数均大于200)的精子能动性分析如下，运动活跃型精子分别占30%和50%;非运动活跃型精子分别占5%和15%;完全不动型精子分别占65%和35%。占比例最大的为完全不动型，它们的均值为50%。对照表2.1,在均值为50%的情况下，差值大于10%,认为仅是偶然发生事件。观察值大于10%(65%-35%),因此需重新制作两份标本进行评估。例2:某两份精液标本(每个标本的精子数均大于200)的精子能动性分析如下：运动活跃型精子分别占37%和28%;非运动活跃型精子分别占5%和6%;完全不动型精子分别占60%和66%，占比例最大的为完全不动型，它们的均值信区间积极运动精子（PR）比例的参考下限为32%（95%的可信度，31-342.6.1曙红（伊红苯胺黑法评估精子的到显微镜下观察。1.曙红Y:将0.67克曙红和0.9克氯化钠溶入到100毫升纯净水中，并轻微加热。2.曙红一苯胺黑：将10克苯胺黑加到配好的100毫升的曙红Y试剂中。3.将其加热至沸腾，然后冷却至室温。1.将精液样本拌匀。2.将1/5的精液与5μl伊红溶液混合，置于显微镜载玻片上，用移液管混匀，在载玻片上均匀展开。3.重新搅拌精液样本，然后重复步骤2制作另外相同一份。4.将两份样本的悬浮液分别涂抹在不同的载波片上(见2.13.2节),然后置正常参考下限活精子(细胞膜完整精子)比例的参考下限为58%(置信度为95%,置信2.6.2仅用曙红(伊红)染料评估精子活力试剂的制备2.曙红Y染剂，0.5%(w/v):将0.5g曙红Y(比色指数，45380)染料溶于100ml浓度为0.9%的NaCl溶液中。9.以表2.1或是图A7.2，附录7为标准（在仅考虑样本误差的前提下，均1.存活精子的头部染色为白色或淡粉色，死亡精子的头部染色为红色或深2.如果染色仅限于颈部区域，剩余的头部未染色，则可认为是“颈部细胞活精子（细胞膜完整精子）比例的参考下限为58%（置信度为95%，置信5.37℃下准确孵化5分钟或306.按上述步骤，再次混匀精液样本，再次吸取标本，混入膨胀液，孵化，1.通过细胞形状的改变来确认膨胀的精子，如显示为尾部卷缩(图2.6)。2.精子尾部有膨胀表现则可认定为存活精子；将所有尾部膨胀的精子均计为图2.6低渗膨胀状态下的人类精子的典型形态变化表现示意图(a)无变化(b)—(g)不同的尾部变化灰色区域提示为肿胀的尾部。正常参考下限HOS检验的参考值接近于曙红检验的参考值(Carreras等，1992)。活性精子(细胞膜完整精子)比例的参考下限为58%(置信度为95%,置信区间为55-63)。注释一次射精的精液中的精子细胞膜的完整性的总数目是有生物学意义的。细胞膜完整的精子数目可通过一次射精的总精子数乘以细胞膜完整精子的百分率Larsenetal,2000)。此推论已为生殖率与精子总数之间关系的诸多资料所证明。射精时精子的数量，是由鉴定精液得出的精子密度来统计。对于正常射精，当男性生殖道是通畅的且禁欲时间短，每次射精时的精子总数均与睾丸容积有关子总数是衡量睾丸成生精子的能力(MacLeod&Wang,1979)及男性生殖道通畅的指标。与受精和妊娠率相关的精液中精子浓度受精囊(Eliasson,1975)和前列腺分泌多少的影响，并非是睾丸功能的特异性指标。积获得。）：推荐使用100μm深血球细胞计数器为计数池，因Neubauer（牛鲍氏）血球度是有效的(Seaman等,1996;Mahmoud等,1997;BraNeubauer血球细胞计数器得到的结果将会不同。通过毛细管作用填充的浅计数池，由于流动精子不会均匀分布(Douglas-Hamilton等,2005a,2005b)。该误差能够被校正(Douglas-Hamilton等,2005a)，但校正并非是完全正确的(Björndahl&Barratt，2005)。这种可选择的计数池，其有效性须经计数池核查量纲来确定(见附录7,A7.8节)，将Neubauer改良的血细胞计数器法得出的结果加以比较，获号,0.44mm)，由0.1mm玻璃柱支撑，覆盖网格。每个计数区分成九个1mm×图2.7改良的Neubauer(纽鲍尔氏)血球细胞计数器蚀刻区略图如下所示：血球细胞计数器计数池的所有九个网格(左边面板);25个大方格中的中央网格(5号)(中间面板);显微镜下已充填的一个数精池的部分(右边面板),即中央网格的25个方格之一(中间面板的圆圈所示),其由三重线围出，包含16个小方格。2.7.3血球细胞计数器网格的使用·只对整个精子(包括头和尾)进行计数。边的不予计数(见图2.8,右边面板)。2.7.4计数器的维护·使用后，用水清洗血细胞计数器数精池和盖玻片，然后用相机(镜头)专三线的中间线确定了方格的边界(黑线，左边面板)。除头部在两条内线之间(白圈)的精子之外，方格中央的所有精子均计数，但头部在两条外线之间的需计数(黑圈)。头部大部分在中间线上的精子，如果该中线低于方格(白圈，2.7.5稀释后精液的固定2.如果急需，加0.25g台盼蓝(颜色所引23859)或5mL(>4mg/ml)饱和的结晶紫(颜色所引42555),以加亮精子头部。2.7.6计数足够数量精子的重要性为降低样本误差，精子的临界数量(大约200条重复计数时，总数400条以区间(CI)接近N±1.96×√N(或为N±2×√N左右)。如果计数100个精子，那么标准误差(SE)即为10(√100),其95%的置信区间(CI)是80-120(100±20)。如果计数200个精子，则SE为14(√200)其95%CI为172-288(200±28)。如果计数400个精子，则SE为20(√400),其95%CI为360-440(400±40)。条时为81.4-121条；一次计数10条时为4.80-18.4;一次计数1条时为表2.2参照精子计数总数的圆形样本误差(%)5123456789(广西南宁第二医院生殖中心刘峰)氏计数池的中央大方格（5号方格）容积是100nl，则其内的精子数目将是如2.4.2节中所述制作湿片并检测其中之一，估框2.9池深为20μm的湿片中每高倍视野的容积2表2.3精液所需稀释度、配制方法、使(μl）(μl）注4：如果1+19(1:20)稀释不合注释1：如果初始湿片制备中精子数目太低(每×400高倍视野<4：大约1×注释2：为准确评估低密度精子（每×400将盖玻片紧压支持柱以固定于计数池上，可通过观察两层玻璃之间的虹彩将第一次稀释的液体置于振荡器以最高的速度振荡10秒钟以充分混匀，立注2：使用血细胞计数板夹保持盖玻片位置不变将确保一个固定的池深每次至少重复计数200个精子以达到足够低的抽样误差（请参阅框2.7和）；注1：如果在4、5和6号大方格中计数少于200个精子，不要继续在1、2、和6号大方格(参阅2.7.2节)。这种情况下，可降低框2.10重复计数的比较二次计数时在7行内发现有245个精子，总计数是在1），），例4：1+4(1:5)稀释下，第一次计数时在4行内发现有），例5：1+4(1:5)稀释下，第一次计数时在8行内发现有数时在8行内发现有213个精子，总计数是16行内有437(2241+4(1:5)稀释下样本的精子浓度为C=(N/n)×（6.825个精子/nl或6.8×=27.3/4=6.8×106/ml。），初始湿片制备中如果每高倍视野的精子数目稀少(即400倍数下0～4个精子子密度为2×106/ml（考虑到与稀少精子相关的高样本误差）及注明是否看到活混匀精液样本（参阅框2.3）。如果样本粘稠度高，有序的逐个视野扫视整个盖玻片区域。从一个角落开侧，然后沿y轴移动一个视野并以整个视野宽度向回返方向间。确定数量，请参阅2.11.1节或2.11.2节。有序的逐个视野扫视整个盖玻片区域。从一个角落开侧，然后沿y轴移动一个视野并以整个视野宽度向回返方向使用×20的物镜和孔径为20mm的×10目镜时，本节描述采用非离心法计数稀少精子。以低倍稀释精液进行检测，或者加为了减少抽样误差，精子计数的数量必须达到一定的标准（最好重复计数框2.11改良纽鲍尔氏计数池全部9个大方格的计数精子达到200条改良纽鲍尔氏计数池全部9个大方格的容积5、每次重复计数至少200条精子，以获得足够低的抽样误差（见框2.7及6、对其中一个计数池逐个方格进行检测，直到计够200条精子和完整的一7、记录精子计数达到200条时的方格数量。另一计数池计数精子时也要检9、切换至另一计数池，重复计数与第一次相同的方格数（相同体积），即可接受性(两者均显示在95%的可信区间内，单纯抽样误差允许的两个数值的最当计数池的九个大方格都进行检测时，每µl精子密度计算为：精子总数除当计数池的九个大方格都进行检测时，每µl精子密度计算为：精子总数除/ml；这是在1:2样本稀释下对改良纽鲍尔氏计数池全部九个大方格计数时，抽例1：1+1（1:2）稀释下，第一次重超出了偶然概率所允许的差异值（42因此需要例2：1+1（1:2）稀释下，第一次重复计数时3个方格的精子数量为2第二次重复计数时3个方格的精子数量为200，6个方格的精子总数为410），例3：1+1（1:2）稀释下，第一次重复计数时全部9个方格的精子数量是），当计数池的九个大方格（1.8µl)都进行检测时，1+1（1:2）稀释下样本的精子例4：1+1（1:2）稀释下，第一次重复计数时全部9个方格的精子数量是因此精子密度<56000/ml；检测报告为“检测精液样本中可见1使用大容量、池深为100µm的计数板可增加精子密使用含有Hoechst33342双苯甲亚胺荧光素(1毫克/升)的固定剂(参见在初始的湿片制备中，1+1(1:2)稀释精液每高倍视野的精子数少于2条对精框2.12一次性大容量计数板的计数精子达到200条3、将计数板平放置于湿盒内（例如放在浸透水的过滤纸上并盖上皿）以免5、每次重复计数至少200条精子，以获得足够低的抽样误差（见框2.7及6、对其中一个计数池有序的逐个视野进行扫视，从一个角落开始沿x轴以这种z形方式继续扫视，当改变视野时要保持对计数板的检测，直到计数达7、记录精子计数达到200条时的视野数量。另一计数池计数精子时也要检9、切换至另一计数池，重复计数与第一次相同的视野数（相同体积），即可接受性(两者均显示在95%的可信区间内，单纯抽样误差允许的两个数值的最×250放大倍数下，单个视野的容积是80nl（见框×400放大倍数下，单个视野的容积是20nl（见框2.13）。1+1(1:2)稀释的精液，精子密度为C=（N/n）×（1/20）×2/nl，即C=（N/n）×当计数池的整个区域都进行检测时，将精子总数除以两个计数池的总体积框2.13池深为100µm的一次性大容量计数池每高倍视野的容积21+1（1:2）稀释下样本的精子密度为C=（N/n）×（2/v）/nl，如果v=20而第二次重复计数时整个计数池的精子数量为70，两个计数池的计数精子总量），下样本的精子密度为C=(N/50)×2/µl=(120/50)×2=4.8/µl,或4800/ml（就这因此精子密度<2000/ml。检测报告为“两次重复计数可见38条精子，因精子数S是该份精液的精子浓度(106/ml)，那么圆细胞浓度的计算公式是：C=S×(N/40时需报告计数细胞数目的抽样误差（见表2.2若计数的圆细胞数小于25，则例1：第一次重复计数时每200精子的视野内有21个圆细胞，而第二次重），例2：第一次重复计数时每200精子的视野内有24个圆细胞，而第二次重度是：C=S×(N/400)/ml，即C=70×106×（60/400）=10.5×106/ml（就这两个有效数板，采用2.8.3节介绍的计数精子细胞的方法计数。但是，对于精另外，这些非精子细胞的密度可以通过计数过氧化物酶阳性细胞来评估（见形细胞密度（106/mlS为精子密度（106/mlN为计数400个精子相同视野25个，就单报告观察的圆形细胞数量，并注释“圆形细胞数量太少，无法进行精确计数”圆形细胞密度为C=S×（N/400）=70×（60/400）=10.5×106/ml。由于细胞计其是从性交后子宫颈管内粘液中获得的精子（Fredricsson&Bjork,197;Menkveldetal.,1990以及从透明带表面收集到的精子（Menkveldetal.,1991;Liu&得妊娠间期（time-to-pregnancyTTP）以及体内、体外妊娠率）之间的关系为0～30%,很少超过25%(Menkveldetal.,2001)。因此，正常值下限很低。在关于体外受精(Coetzeeetal,1998)、宫腔内人工授精((a,b)在体外从透明带中回收的精子，用Shorr染色法染色。(c)性交后(a,b)由欧洲人类生殖和胚胎学协会授权，从Liu等(2003)处复制。2.13.2精液涂片的制备●尽管保留了大量残留胞浆，但是渗透压敏感性胞浆小体消失 3．在玻片的边缘加5～10µl精液，具体加多少取决于精子的密度。用另外果刮片用的玻片不是那种有白漆标记面的，那么每个边缘都可以用以刮）：度低时效果很好，但对于特别粘稠的精液，这种方法不理想（见图2.12和当精子密度低(<2×10/ml)、粘稠或杂质很多、或者需要做计算机辅助形当精子密度很低(<2×10/ml),需要浓缩精液标本：1.以600g离心10分钟。4.尽可能获得最高密度的精子，但也不要超过50×10/ml。5.以后按正常精液标本处理(见2.13.2高的标本可以参照液化不良的标本处理后进行涂片(见节)或者进行洗杂质和大量颗粒状物质(例如非常粘稠的标本)可以导致精子头部堆聚，这1.在室温下，将部分精液(0.2～0.5ml,取决于精子的密度)加入10ml生理盐水(0.9g氯化钠(NaCl)加入100ml纯水)。2.800g离心10分钟。）：80%乙醇中只需要10秒，而在空气中干燥后再浸入50%乙醇就需要更长时间渔霸士染色相比，Shorr染色后所得到的精子正常形态率相似（Meschedeet2．Shorr溶液：购买制成品或者按照以下步骤制备：将4gShorr粉溶解于由于缺乏客观性、理解上的差异以及外部质量控制评估的可操作性差（见7.13.2节评估精子形态有许多困难。这里推荐一种简单的正常/异常分类：用肉眼计数异常精子的异常部位。当评估精子正常形态率时需要采用下述标准头部在外形上必须是平滑的、弧度规则的、大体上为椭圆形。顶体部分必须没有大的空泡，小的空泡不超过2个，空泡的面积不能超过精子头中段必须是纤细的、规则的且长度与头部相同。中段头部的主轴相延续。胞浆残余体只有在过多时（也就是说超过精子头部畸形。注释3：用计算机系统（重复测量的变异系数为2～7%）分析7得出的头部大小数据为：长4.1µm，95%CI3.7～4.7；宽2.8µm，95%CI2.5~注释4：用同样的计算机系统分析74巴氏染色后的精子（在2.14.2节介绍的方长4µm，95%CI3.3～5.2；宽0.6µm，95%CI0.5～0.7。在学习区分各种类型精子（正常/临界精子头部和尾部，见1～12版以及它个空泡或者>20%头部区域为未染色的空泡顶体后区有空泡，顶体区主段畸形：短，多尾，断裂，光滑的发夹样弯曲，成角弯折，宽度不规特征为精子有大量不规则的、能被染色的细胞浆成份，为精子头部大小种现象。注释2：胞浆小滴是渗透压敏感性的，在正常空气干燥的过程中容易被破坏j）细D过多的胞浆残余体((陈国武)bacillibent双ifPPOKnotassessedpinheadpolymorphpyriform厚空泡多于两个空泡图解1中精子形态学评估123456789图解2图解2中精子形态学评估123456789图解310微米图解3中精子形态学评估123456789图解4图解4中精子形态学评估123456789图解5图解5中精子形态学评估123456789图解6图解6中精子形态学评估123456789图解7图解7中精子形态学评估头部外形其他头部评估颈部评估尾部主段评估整体精子分类评估10微米123456789图解8图解8中精子形态学评估图解9123456789图解9中精子形态学评估图解10123456789图解10中精子形态学评估图解1112345678910微米图解11中精子形态学评估图解12123456789图解12中精子形态学评估123456789图解1310微米123456789图解14中细胞评估123456789为防止观察区视野选择的偏颇，应系统选择涂片观察区视野对可评估精子8．确定可接受的误差，参见表2.1、图A7.2、附录7（反映两次计数百分需要应用多键计数器，其中一键表示正常精子，另一键表示缺陷精子，上2．缺陷精子百分比为各种类型缺陷精子数除例：用6键计数器计数评估200个精子，其中42个精子被精子，158个镜子被计数为缺陷精子。缺陷精子中，140个为头部缺陷，102个精子被计数为正常形态精子，164个精子被计数为缺陷精子。缺陷精子中，122查表可知两次计数样本误差为可接受范畴。第一次评估正常形态精子比例尾部缺陷精子比例为（30+22）/400=13%，带胞浆小滴精子比例为（44+36）有时部分精子会有一些特异性结构缺陷。比如：顶体未发育导致的小圆头如患者的精子全部表现为一种缺陷，那此患者通常表现为不育。这种情况巴氏染色精液涂片观察白细胞和精子细胞、精母细胞还是有显著差异的（见2.14.2节）。区分主要是以上几类细胞着色、细胞的大小和形状存在较大差异还有许多其它技术可以判定精液中白细胞群的数量。如比较流行的过氧化物酶染色鉴定多行核粒细胞特有的过氧化物酶，较适合初筛（Woff，1995；白细胞也可以通过费时并昂贵的免疫细胞化学方法来检测评估，这种方法一般经过氧化物酶染色后的精液才行白细胞计数，染色后可以比较容易的这种方法可以很好的分辨带分叶核的中性粒细胞和多核的精子细胞，多核精子细胞本身不含过氧化物酶（Johanlsson水和9.08gKH2PO4溶于1000ml纯水。混合两液，调pH值至6.0（大约12ml氧化物酶阳性细胞至少200个。阳性细胞(可能此计数方格过氧化物酶阳性细胞数不足200个)。10.查表得知可接受的样本误差率(见表2.5、图A7.1、附录7)。取样重做两张涂片重新评估(见框2.10)。13.计算每次射出精液过氧化物酶阳性细胞总过氧化物酶阳性粒细胞(标记为P,染为棕色),过氧化物酶阴性圆细胞(标评估每张计数池的9个计数方格后，过氧化物酶阳性细胞总数除以两张计数池的总容积（1.8µl乘以稀释比（10）也能得到精液中过氧化物酶阳性细胞如每张计数池中过氧化物酶阳性细胞数少于25个，密度＜277000/ml；应用改良纽鲍尔计数池，按1:10稀释后，评估所有9个计数方格的误差下限为表2.5查得样本误差超出随机误差（24故本次结果不可取，需重新涂片计数例2：1:10稀释后涂片，涂片1观察5个计数方格发现204个过氧化物酶阳性细胞，涂片2观察5个计数方格发现198个过氧化物酶阳性细胞。10个观例3：1:10稀释后涂片，涂片1观察9个计数方格发现144个过氧化物酶阳性细胞，涂片2观察9个计数方格发现162个过氧化物酶阳性细胞。18个观察计数方格过氧化物酶阳性细胞总数306个（144+162样本误差为18例4：1:10稀释后涂片，涂片1观察9个计数方格未发现过氧化物酶阳性细胞，涂片2观察9个计数方格发现少于25个过氧化物酶阳性细胞，密度＜277000/ml；报告时应注明“细胞数目过少，无法达到精确评估浓度细胞活性等(Tomlinson等,1993;Aitken和Baker,1995;Rossi和Aitken,1997)。可通过巴氏染色将精子和精原母细胞与白细胞区分开来(Johanissonetal.,内白细胞过氧化物酶、无白细胞特异性抗原(见3.2节)多核精子细胞与多核白细胞在形态上难以区分。但染色后精子细胞呈淡红色而PMN白细胞呈蓝色(Johanissonetal.,2000)。可依据发育中顶体的特异性染色(Coutureetal.,1976)、凝集素（见4.4.1节）和特异的抗体（注释2：仅有少量抗精子抗体的存在不能作为诊断精子自身免疫疾病（sperm集试验（MAR综述见Bronsonetal.,1984）免疫球试验（IBBronson洗涤后的精液。两种检测方法不一定能得到相同的结果（Scarsellietal.,1989而对于那些没有活动精子的标本，体有足够的相互作用时间。因为至少需要10分钟的反应时间才能观察到混力。此外，将精子与已知含有抗体的精浆共孵育也可得到用做对照的阳性精子4.将3.5μl含有包被有IgG的胶乳颗粒（小珠）的试剂分别加待测标本及对照5.将3.5μl含有包被有IgG抗血清试剂分别加待测标本及对照物中，并用加样不用10分钟时重复观察。观察。注释：当50%或更多的活动精子被小珠粘附时精子宫颈粘液穿透能力和IVF受这项检测比MAR费时，但IB中精子经过洗涤，除去了精浆中可能对检测在直接免疫珠试验（IB）中，共价连接有兔抗人免疫球蛋白IgG/IgA的小3.缓冲液II：加入5克CohnFractionVBSA至100ml杜氏（Dulbecco4.使用0.45-μm孔径的滤膜过滤上述-在每个检测中，必须同时含有ASAb-阳性的精子和ASAb-阴性的精子作为对照。上述精液必须来自已被之前的直接免疫珠试验证明含有/未含有抗精抗体8.只计数被一粒或多粒免疫珠结合的活动精子。参见节，忽略尾尖被如果待测体液是宫颈粘液，需准备浓度为10IU/ml的菠萝蛋白酶(EC2.将溶解的宫颈粘液、血清、精浆或睾丸液56性时，可用作阳性质控标本的来源。（阳性是指>50%的活动精子被粘附，的百分率更有意义；特别是当涉及研究人类生精功能损伤情况时(Jouannetetal.,评价一些病理或有毒有害环境对生育力影响时也十分有用(Augereta头部的1/3时）几个方面来评价精子是否存在缺陷。使用细胞计数器进行计数。计算在内。与本手册的其它评价体系不同(见2.15.1节和2.15.2节)，该指数所使用的形态评价标准应采用由David等（1975）提出，经Auger和Eustache43人类生殖与胚胎手册（EuropeanSocietyofHumanReproductionandEmbryology，ESHRE）以及北欧男科学会（NordicAssociationforAndrology，NAFA)(ESHRE/NAFA,2002)。与本手册之前的版尾部缺陷，44条有多余的胞浆小滴残留。在第2次计数时，36条正常，164条时，用总的畸形数(140+102+30+44+122+108+22+36=604畸形)除以异常精子数MAI15N2.Menkveldetal.,23.Jorgensenetal,2001,使用的是David形态分类法(Davidetal.,1975,由Auger已经释放了粒细胞的多形核白细胞和不含过氧化物酶的其它类型的白细胞如淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞不被为o-甲苯胺细胞过氧化试验检测出来。2.Tris-缓冲液（TBSpH8.2；见Appen甲基甲酰胺以及0.1ml1.0mol/l的左旋咪唑。使用前加入10mg快红（fast9.Harris’s苏木精染液（作于复染见Appendix4,sec1.分别在两张清洁的玻片上滴加5μl精子悬液并制成涂片(见Section2.13.2)并1.用×200或×400倍的明场显微镜检查整个染2.为了将误差控制在可接受的范围内，每次须至少计数200条精子。同时记红色是含有CD45的细胞(白细胞)如果在样本中含有的CD45-阳性细胞比精子少(如<400),则样本的误差将超过5%。此时，需要报告计数的细胞数的误差(见表2.2)。如果计数的CD45-阳性细胞数少于25,报告观察到的CD45-阳性细胞数并例1:在一次检测中，在200条精子中有20个CD45-阳性细胞；在二次检测中，在200条精子中有40个CD45-阳性细胞。则总数(20+40)是60,误差(40-20)是20。从表2.5中可以看到超过了随机误差(15),因此该结果不被接例2:在第一次检测中，每200条精子中有25个CD45-阳性细胞；在二次检测中，在200条精子中有35个CD45-阳性细胞。则总数(20+40)是60,误差是10×10/ml(保留两位有效数字)。由于计数到的细胞少于400个，则根据表跃精子的数目，评估精子存活数目（Sobrero&MacLeod，1962）和精子的活动框3.1石蜡油混合物的制备器提取。精子在阴道内两个小时就会失活。观察阴道中精子涂片的目的(参见2.4.2穿过宫颈粘液的精子数目的评估一般采取计数高倍镜视野下所见精子数目●排除其它明显的性交后宫颈因素，如果在性交后9-14小时内没有在宫颈粘液使用体外试验对精液-子宫颈粘液相互作用予以详细的评估。通常，当性交子能够活动和存活的最适pH值范围为7.0—8.5，这也是月经中期宫颈粘液pH3.水平地存放载玻片在30分钟在37°C在一个湿润的温箱(即在一个有盖的种物理特性，不含有精子的精液也会发生(Perloff和steinberger1963;Moghissi4.精子的移动距离可以达到至少500µm(即大约为10个精子长度)，即离开因为在平面的玻片上使得精液-宫颈粘液接触界面的大小和形状完全标准化是不可能的，故该试验的结果时常带有一些主观性。因此，精液-宫颈粘液互作毛细管测试最初是由Kremer设计的(1965),本法是在一毛细管内测量精子定在离储液囊5mm的位置。这种构造可以防止精液侵入毛细管和玻璃片之饱含水分的滤纸)防止精液和粘液变干。6.如节所述，观察毛细管应在放大×100的显微镜下。7.设备置于37℃孵化器，且在24个小时后为了观察前向运动的精子的表现，应该重复检查毛细管。在2个小时以后，评估迁移距离、穿透密度、迁移所导致的精子减少数目和前向运动精子的数目。1.迁移距离：测量所浸入精液储液槽的毛细管末端到管中最前面的精子之间2.穿透密度：在距浸入精液储液槽内的毛细管末端1cm和4.5cm的两个点处测定。由每低倍镜视野(×100LPF)下观察到的每个距离点的精子平均数决定。通过计数五个低倍镜视野而获得平均数。计数均值用穿透密度等级来表示，如表3.3所示。对于测试的分类，以1或4.5cm的距离下最高的精子穿入密度等级作为检验的结果。表3.3精子穿透密度排行次序穿透密度的分类排列顺序012345673.迁移减少：通过计算4.5cm处穿透密度较1cm处的减少量来获得。以不同等级序号表示。例1:在1cm处的穿透密度是51-100/LPF,而在4.5cm处是6-10/LPF。则迁移减少值是3(等级序号6减去3)(表3.3)例2:在1cm处的渗透密度是21-50/LPF,而在4.5cm处是51-100。则迁移值减少价值是零，因为其穿透密度没有减少，实际上是增加了(表3.3)。10--或或或2差和和和好所有不能分级的试验结果总结为现有多种反映附属性腺功能的生化指标，如前列腺分泌的柠檬酸、锌、γ-●前列腺的分泌功能。精液中的锌，柠檬酸(Möllering和gruber，1966)或酸性●附睾的分泌功能。L-左旋肉毒碱，甘油磷酸胆碱（GPC）和中性α-葡糖苷酶是临床常用的附睾标志物。在精浆中存在两种α-葡糖苷酶的异构体：其中主要来源于前列腺。在反映附睾功能失调方面，中性α-葡糖苷酶较左旋肉毒碱和甘这种方法需要使用一个精确度为4µmol/l的96孔板测定仪(Cooper等，1991)。当分光光度仪使用3ml或1ml的比色杯时，可以按比例调整精液和试剂的体积化合物2-（5-溴-2-吡啶偶氮）-5-（N-丙烷-N-磺基丙氨）-苯酚(5-Br-PAPS)3.标准曲线：按照步骤2所述，溶解101.将精液分析后的剩余精液以1000g离心10分钟，收集无精子的精浆于-20°C储存待分析。无精子精浆可以合并以其它样品为以后内部质量管理分析用4.向96孔读数板中加入步骤3中的双份稀释的精浆标本各3.结果需乘以稀释倍数61（5微升精浆以300微升水稀释以获得未稀释4.两组之间的差异应在10％以内，即（估值/估值的平均数间的差异）×5.乘以一次射精的精液体积，得到每次射出的精液中锌浓度（毫升进而每次射精中的锌的参考低值为2.4µmol/次（来自于库珀等，1991；和TG1.脱蛋白质的试剂1(63µmol/l的ZnSO4)：在100ml净化水中溶解1）：哚溶解其中，并加净化水至100ml。过滤器（0.45微米孔径）过滤后于4°C下4.果糖标准液（2.24mmol/L）：在1.将精液分析后的剩余精液以1000g离心10分钟，收集无精子的精浆于-20°C储存待分析。无精子精浆可以合并以其它样品为以后内部质量管理分析用4.脱去蛋白质：向稀释的样品55µl中加入加12.5μl浓度为63µmol/l的7.加0.5ml的浓(32%v/v)盐酸(HCl)到每个样品中，加盖自封口磨砂实验室3.结果应乘以每个样品的稀释倍数16（5微升精浆加入75微升的水和沉淀4.两组之间的差异应在10％以内，即（估值/估值的平均数间的差异）×5.乘以一次射精的精液体积，得到每次射出的精液中锌浓度（毫升进而精液中含有两种α-葡萄糖苷酶同工酶，其中一种萄葡糖苷酶可将合成的吡喃葡萄糖苷底物转化为在碳酸钠条件下呈现黄色精液中附睾分泌的中性α-葡萄糖苷酶的测量试剂盒是可以通过商业途径得到的。只推荐使用包括SDS和澳栗精胺的试剂盒来进行该项精液中的酶检验。6.用于空白对照的葡萄糖苷酶抑制剂（奥粟精胺，10mmol/L）：在10毫升的净化水中溶解18.9mg的澳栗精胺，稀释10倍，即加纯净水稀释成11.以1000g离心精液分析后的剩余样品10分钟，收集无精子的精浆于-20°C储存待分析。无精子精浆可以合并以其它样品为以后内部质量管理分析用4.向其中两份含质控样本中加入8µl浓度为1mm3.乘以修正系数（0.6194，见注）以获得未稀的精浆样本中的中性葡萄糖苷4.从每个待测样本中减去经奥粟精胺处理的精浆空白对照组（IU/l）的活性5.两组之间的差异应在10％以内，即（估值/估值的平均数间的差异）×6.乘以一次射精的精液体积（ml得到每次射出的精液中葡萄糖苷酶的总特别是使用DNA荧光染色和尾部检测计数法，已可进行精子密度的测定精率和受精时间有很好的相关性(Liue用CASA分析精子运动参数时，每个标本中至少性和密度。检测精子活动力，标本密度应控制在2×106/具有高密度(如高于50×106/ml)精子的2、用无精子的精浆稀释原精液样本至其密度低于50×1数池均应被充满并检测。必须检测几个有代表性的视野野（共12个视野）以得到可靠的结果。每个计数池至少应2、VSL=直线速度(µm/s)。根据精子3、VAP=平均路径速度(注：不同的CASA仪器用不同的数学运算方法计算多项运动参数。目前所有应用荧光DNA染色CASA可准确检测活动精子的密度以及活动力的百分比，但需谨慎应用该技术(Garrettetal,2003)。例如，如果使用一次性计数池，因为精子充满计数池时分布会不均匀，故评估不同位置的精子标本是重要的(Douglas-Hamiltonetal.,2005b)。应用血细胞计数板验证是必要的。密度在50×106/ml以上的需要稀释(见35.2.2小节)。方法知道精子是否完整(如头尾相粘)。3.5.4计算机辅助精子形态学评估图像分析在评价精子形态方面，可能带来量化、客观性和可重复性的重大进展。商业系统可用来量化精子头部和中段的形态，主段精子也有可能。然而，精子尾部缺陷对运动的影响可以更直接地通过应用CASA检测活动力和运动状态。CASA系统通常可以将精子头和中段分为正常或异常，并且给出精子头和中段、头部椭圆和规则性以及依赖染色检测的顶体区的平均值和标准差或中位数。术人员的手动评估。计算机辅助精子形态学评估（CASMA）结果的重现性和准的影响。如果精子密度低（<2×106/ml需要离心浓缩标本，如2.13.2分比及直线速度（VSL与大样本的低生育力夫妇的自然妊DNA致密性和完整性在确定人类精子功能活性方面的重要性。新出现的证据建议将精子DNA完整性及染色质组织与生育力联合起来考虑。Aitken&Krausz,2001;Virroe程的能力，如精子-卵子透明带结合试验，顶体反应试验以及与卵母细胞卵黄膜细胞质内存在高活性的细胞质酶，如肌酸磷酸激酶。(Raoetal.,1989;Gomezet 在人类射出的精液中，活性氧类物质是由精子(Aitken&Clarkson,1987;的。精浆中有抗氧化物清除剂和酶，某些男性的这些物质可能不足(Jonesetal.,能使精子更易受到氧化损害。生成高浓度的ROS可能引起过氧化损害和精子功此程序需要使用一个灵敏的照度计来检测存在化学发光探针，如鲁米诺或合物，从而能够敏感地检测到过氧化氢的产物。然而，也可以用其它探针（如lucigenin）来检测洗涤后的人精子产生的活性氧类物质（ROSAitkenetal.,formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine(FMLP)产生的化学发光信号对白细胞群是注释1：这些探针测定精子活力的精确性还是一个有争议的问题(Aitkenetal.,）：4．辣根过氧化物酶（HRP）(VI型，310IU/mg蛋白)：5mg(1550IU)溶于13．吸取400µl洗涤的精子悬液加入无酚红的KRM混悬，后加入一个一次性照通过添加FMLP、酵母多糖或PMA刺激精液白细胞产生的ROS，而PMA加入20μl调理的酵母多糖至上述标本，以刺激存在于精子悬液内每个白细胞产生化学发光信号。产生化学发光信号的大小直接与混入白细胞的水平成比例(见图4.1)。PMA诱导白细胞和精子产生ROS试验1.用DMSO以1:100的比例将PMA原液稀释成10μmol/l工作液。2.等待至FMLP或调理的酵母多糖的信号消退。3.加4μl的10μmol/lPMA于等量的精子悬液中(终浓度为100nmol/1),刺激精子产生化学发光信号(见图4.2)。图4.2细胞悬液产生活性氧能力与白细胞和精子亚群的关系(a)在存在白细胞污染的情况下，加如白细胞特异探针FMLP后，产生一个ROS峰。继之加入PMA,精子和白细胞群产生一个持久的强化学发光信(b)如果没有白细胞污染，FMLP反应则消失，而PMA引发一个显著的由精子产生的化学发光信号(也见于Krauszetal.,1992)。一种称作半卵透明带测定法的透明带结合试验(Burkmanetal.,1检测精子用一种标记物染色(如荧光素),而对照精子用另一种标记物染色(如应能通过从透明带表面去除的精子或人透明带分解的蛋白来评价(Liu&Baker,如钙离子载体可诱发顶体反应，但是结果不如由透明带诱发的顶体反应(Liu&Baker,1996)。顶体反应后的顶体状态可通过显微镜或流式细胞仪检测(Fenichel2．顶体反应(AR)：精子在赤道段仅有一个荧光带，或者在顶体区无荧光着色。2.每张载玻片检测200条精子，可获得较低的采样误差。顶体反应(AR)是精子与透明带结合之后，发生在细胞外的过程，它一定1.含3.5%(35g/l)人血清白蛋白(HAS)的Ham·sF-10培养液(见附录4,A4.44．应用Ham,sF-10-HAS2．为确保每次新配制的染料配制适当，必须用旧人精子与仓鼠卵母细胞融合的过程在功能上同与人卵母细胞融合的过程是继精子-透明带之间的相互作用后，引起顶体反应的细胞内信号是钙内流和胞浆碱化，两者均可由二价阳离子载体A23187人工诱发。另一种方法是使用次性吸头吸取已经预温并在CO2孵箱中平衡好的矿物油覆盖液滴，小心操作不5．计数精子密度（见2.7和2.8节）,用新鲜配制的BWW液将活动精子密框4.1仓鼠诱导排卵确保注射活体动物的流程都符合法律程序。准备好合适剂量的孕马血清射30单位PMSG给未成熟仓鼠或动情期第一天的成熟仓鼠。48-72小时后，经7．持住子宫最远端的位置，紧贴镊子下方从子宫末端切断5．室温下，用1%胰酶（10000IU框4.2玻璃吸管的制备胺蓝)或核酸(吖啶橙，色霉素)结合的染料，之后用组织行评估。新方法包括一些可以评估DNA断裂程度的试验，如TdT介导的dUTPDNA末端标记法(TUNEL(原位末端标记，ISEL),彗星实验以及精子染色质时也与精子形态、活力和活率相关。这些试验可为预测标准IVF的授精率提供本图片经SpringerScience+BusinessMedia授权，摘自Aitken等(1983)。显得非常重要。直接用培养基稀释精液后离心仍是IUI富集精子常用方法(Boomsmaetal.,2004)，但对于一些有一个或几个参数异常精液，密度梯度离心液标本，玻璃绒柱法可以取得与密度梯度离心法相同的效果(Rhemrevetal.,精液的参数决定应该选择何种精子制备方法(seeCanaleetal.,1994)。直接回收率低小于20%，而密度梯度离心回收率高大于20%。这两种方法获得的精分钟。根据精子的游动能力即能游出精浆游进培养基来少，但在需要活动精子量较少的IVF或ICSI技术中，这种所以在配制成精子处理培养基时必须需要调配到与女合应用上游法和密度梯度法进行精子制备能够保该进行RT-PCR检测，只有未被感染的切开活检（用或不用显微操作）和经皮穿刺活检都力下离心8分钟。离心后的逆行射精样本和正对于不能射精或者射精障碍的病人，可以通过对阴精子冷冻保存是男科实验室工作中的一个重要组子免受冷冻损伤，可以将人类精子冷藏在–79℃的干冰上(Polgeetal.,1949;Bunge&herman,1953;Bungeetal.,1954)。随着液氮广泛应用，人类精子冷冻贮冻存时间的延长而下降。冷冻保存超过28年的精子），供精生育力保护不孕症治疗材料程序。在棉花和羊毛之间有若干聚乙烯乙醇粉末塞子的试2．最常用的程序是按照每分钟1.5℃的速率从20℃降到–6部的液氮蒸气和空气的混合气体内篮子放置10-1加大精子的检测数量当然可以降低计量误差（见表2.2、方框2.5和2.7框7.1质量保证和质量控制术语真正的价值估计，往往源于数个实验室的平均结果（目标一个对指定值测试结果的偏差。这是在同一方向（系统误observationsagainsttheirm一个自然变异，影响这一进程的所有个人价值的来源正在一个时间序列图显示的一系列个人测量，包括中间线和控国际标准化组织一个设定国际化标准的机构，包括实验这与计算数字的平方根成反比。抽样误差SE）是在一定时间内测量值的控制图，它用于监控错误的可能性也越小。对IQC或者IQC材料进行监控的一种实用方法是使用质量控制图。这样就可以根据当地标准把IQC也成为实验室常规质控的一部分。），A7.7提供了如何评估质量控制涂片的形态方法。如果涂片准备和储存得当，可录影标本的磁带，CD或DVD，无论是从实验室还是EQ固定厚度，这是30分钟的稳定，也可使用（sofixed-depthchambers,whichareXBAR的图表的主要目的在于发现检测结果的误差，或者不同的变异全面增新样本材料应该和前期的10份样本一起建立新的Xbar质控范围员值23456789下表显示了4名技术人员对来前10个QC样品的精子密度测定值，以及每个样样品:12345678938平均差(Sbar)是:(3.27+3.70+...+3.74)/10=3.40。从见表7.1中可以得出，样本距离均值2个标准误）为:Xbar±A2,n×Sbar=39.7±(1.085×3.40)者36.0和43.3×106/ml。同样可以得出外控制线:Xbar±A3,n×Sbar=39.7±图中（7.1）就可对将来的QC样本值进行图表中(

)为连续测量的平均值，图表显示检测值、警戒限和处置限。别突破5%和0.2%,成为为未来样本的一个随机单独变量。这些限制由x2分布从表7.2来看，Sbar平均样本标准偏离是3.40×106/ml,从表7.1来看对于n为4的最低处置值是sa,n。失控(见7.8节)。某个百分比例p的标准差的估计值为p(100-p)/N(如果百分比在20%-80%之间变化),(朱晓斌)1.单点在3倍标准差范围外，这是个被普遍认可简单的规则，表明在过程中6.连续8个点都在中心线的同一侧，这条规则很具吸引力，因为其简单适用在操作中，从第一条到最后一条都是被普遍认可的，如果某QC样本值被判定为“不合格”,其敏感度警示能给出误差的不同类型(随机性或系统性),从而框7.50C图的基本控制原则框7.50C图的基本控制原则1.样本混匀不足(常见粘稠或凝集);2.技术员紧张(计数不稳定或记录错误);这些识别问题的过程，设计和测试1个假使用新鲜标本进行测定的QC程序类似于采用储存的样本，并允许技术员之图7.3人工和计算机辅助精液分析精液分析)/2结果均值的差异点图。均值(%)数据由HWGBaker提供2.计算均值和标准差的差异，由于同份标本被2位技术员分析，之间均值差异应为零，由零的任何显著性差异，需配对进行t-检验，发现这2位技术员间的偏差(系统差异)。3.针对两份标本每次检测结果绘图(Youden绘),比较几位技术员对浓度的测定，每次检测2个单独的标本，类似如图7.4。每个技术员(称为IQC)或每个实验室(称为EQC),每次两个标本测量值均绘制。横向虚线和垂直虚线是有经验技术员(IQC)或实验室(EQC)测定结果95%可信限。有效值均落在这些虚线交汇的范围内。标1显示随机误差即1份标本测定值在有效范围内而另1份不在，当系统误差即2份标本测定值都太高(右上角标2)或都太低(左下角标2)。1份标本测定值太高或另份测定值太高的随机误差(标3)。图7.4Youden绘精子密度评估图由多位技术员分析2份精子标本，对每次检测结果标绘，每个技术员(或实验室，EQC)的结果用不同符号和颜