设计碱性磷酸酶的提取、分离纯化方案

1、 设计碱性磷酸酶的提取、分离纯化方案及采用每种技术的原因， 在分离纯化过程中怎样检测纯度？ PPTPPT制作：颜佩妮制作：颜佩妮PPTPPT演讲：朱泉剑演讲：朱泉剑资料收集：吴倩艳、宋琴琴资料收集：吴倩艳、宋琴琴 目录 碱性磷酸酶的概念 碱性磷酸酶的提取、分离、纯化 碱性磷酸酶的纯化程度鉴定碱性磷酸酶的纯化程度鉴定 碱性磷酸酶提取、分离纯化时采用的各种技术碱性磷酸酶提取、分离纯化时采用的各种技术的原因的原因碱性磷酸酶的概念碱性磷酸酶的概念 碱性磷酸酶碱性磷酸酶是动物和微生物界普遍是动物和微生物界普遍存在的一种含锌酶，它在存在的一种含锌酶，它在物质代谢物质代谢中中起着重要的作用。碱性磷酸酶能催化

2、起着重要的作用。碱性磷酸酶能催化几乎所有的磷酸单酯进行水解，产生几乎所有的磷酸单酯进行水解，产生无机磷和相应的醇、酚或精，但却不无机磷和相应的醇、酚或精，但却不能水解磷酸能水解磷酸H酿类酿类 碱性磷酸酶碱性磷酸酶广泛分布于人体各广泛分布于人体各内内脏器官中，其中以肝脏为最多其次为脏器官中，其中以肝脏为最多其次为肾脏，骨骼、肠、和胎盘等组织。在肾脏，骨骼、肠、和胎盘等组织。在碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。 实实验验原原理理1. 动物肝脏中含有丰富的碱性磷酸酶（动物肝脏中含有丰富的碱性磷酸酶（AKP）

3、。）。2. 在正丁醇中脂类不溶而蛋白质溶解，可以借此在正丁醇中脂类不溶而蛋白质溶解，可以借此除除去与酶结合的脂类（酶也是蛋白质）。去与酶结合的脂类（酶也是蛋白质）。3. 有机溶剂分步沉淀法有机溶剂分步沉淀法纯化纯化有机沉淀法 实验采用有机溶剂分步沉淀法,从兔肝中提取碱性磷酸酶. AKP溶于30%乙醇或33%丙酮。但在60%的乙醇或50%丙酮中则形成沉淀。通过离心可以使AKP和其他蛋白分离，从而得到纯化。 反复进行纯化的操作，可以获得较高纯度的AKP。常用的有机溶剂 乙醇:沉析作用强，挥发性适中，无毒常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析. 丙酮:沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广

4、. 正丁醇:能去除与pro结合的脂类物质，使pro溶解 在溶液中.称取新鲜兔肝（可使用猪肝）称取新鲜兔肝（可使用猪肝）2g。分离纯化分离纯化 AKP步骤步骤将将1g1g新鲜兔肝置于新鲜兔肝置于7070冰箱进行预先冷冻处理后取冰箱进行预先冷冻处理后取出，置于玻璃匀浆器内。加入出，置于玻璃匀浆器内。加入0.01mol/L0.01mol/L醋酸镁、醋酸镁、0.01mol/L0.01mol/L醋酸钠混合溶液醋酸钠混合溶液3mL3mL，充分研磨至糊状。，充分研磨至糊状。 将匀浆液倒入刻度离心将匀浆液倒入刻度离心管中，管中，使用使用4ml上述混上述混合缓冲液冲洗研磨器具，合缓冲液冲洗研磨器具，将冲洗液一并

5、转入离心将冲洗液一并转入离心管。离心管一定要置于管。离心管一定要置于冰块保护下冰块保护下，以后各个，以后各个步骤也要注意步骤也要注意保持低温保持低温。 加加1mL正丁醇于匀浆原液中，用玻棒充分搅匀，正丁醇于匀浆原液中，用玻棒充分搅匀，然后放置冰浴中然后放置冰浴中20min。用滤纸过滤，滤液置于另。用滤纸过滤，滤液置于另一支刻度离心管中。一支刻度离心管中。过滤，滤液也要冰块保护过滤，滤液也要冰块保护 滤液中加入等体积的冷丙酮，立即混匀后离心2000r/min5min，弃去上清液。在沉淀中加入0.5mol/L醋酸镁2mL用玻棒充分搅拌使其溶解，记录溶液体积。 立即混匀后使用台式低速离心机离心立即混

6、匀后使用台式低速离心机离心5min(2000 r/min)，弃上清液，弃上清液。向沉淀中加入向沉淀中加入4.0mL05mol/L 醋酸镁溶液，醋酸镁溶液，充分搅拌使其溶解，同时记录悬液体积向上清充分搅拌使其溶解，同时记录悬液体积向上清液中加入液中加入95冷乙醇冷乙醇，使乙醇终浓度达，使乙醇终浓度达60，混匀后立即离心混匀后立即离心5min(2500r/min)，弃上清。，弃上清。向沉淀中加入向沉淀中加入40m1 0.0lmol/L 醋酸镁一醋酸镁一0.01mol/L 酸酸钠溶液，充分搅拌，使其溶解。酸酸钠溶液，充分搅拌，使其溶解。向上余悬液中逐滴加入向上余悬液中逐滴加入冷丙酮冷丙酮，使丙酮终浓

7、度，使丙酮终浓度达达33，混匀后离心，混匀后离心5min(2000r/min)，弃去，弃去沉淀沉淀AKP纯化程度鉴定 纯化程度用酶的比活性反应。 酶比活性是指单位浓度的酶蛋白样品中的酶活性。碱性磷酸酶的活性测定磷酸笨二钠法 在pH10环境中，AKP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸氢二钠，苯酚与4-氨基安替比林反应生成色素原，该色素原经铁氰化钾氧化生成红色醌亚衍生物。 测定红色衍生物的吸光度就可以计算酶活性的大小。AKP的蛋白含量测定BCA法则 蛋白质+Cu 2 利用分光光度计测吸光度 设计标准曲线计算蛋白质含量碱性碱性CuBCA试剂试剂紫色化合物紫色化合物 1、AKP比活性： AKP比活性（U

8、/mg）= 2、纯化倍数 纯化倍数 = 每每ml制剂中制剂中AKP活性单位数（活性单位数（U）每每ml制剂中蛋白质含量（制剂中蛋白质含量（mg）溶液溶液A制剂制剂AKP比活性（比活性（U/mg）每一制剂每一制剂AKP比活性（比活性（U/mg）碱性磷酸酶提取、分离纯化时采用的各种技术的原因 通过低温预冷处理有机溶剂分级提取兔肝碱性磷酸酶，结合SDS PAGE法检测纯化结果。对酶的比活力测定中蛋白定量经过对Bradford法和Folin Lowry法进行比较发现Folin Lowry法在本样品体系中灵敏度高、抗干扰能力强，适合采用此法进行蛋白含量测定。 盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。由于硫酸铵在水中溶解度很大（20，每升可溶760克），并且对许多酶没有很大的影响，因此它是最常用的盐。福林-酚试剂显色法用来测定蛋白质浓度。离子交换层析法的原理 阳离子交换膜可以看作是一种高分子电解质,他的高分子母体是不