第二章微生物药物生物合成与调控第一节03(发酵工艺学夏焕章第三版)

1、第二章第二章 微生物药物生物合成与调微生物药物生物合成与调控控 2 2 学习目标v熟悉微生物次级代谢产物的特点和次级代谢产物生物合成的控制。v掌握微生物次级代谢产物的生物合成过程及其调节机制。v了解微生物药物的生物合成及其调节机制的指导意义。 3 3 前言v各种代谢反应和代谢途径错综复杂： 代谢网络（metabolic network） 多代谢作用（pleometabolism） 代谢栅栏（metabolic grid）v生物合成既涉及初级代谢又涉及次级代谢v微生物药物（这里指微生物次级代谢产物）的合成是在微生物体内酶催化下将小分子物质逐步合成分子量较大产物的生化反应过程。 4 4 v生物合成

2、过程中，严格地受到微生物细胞内存在的代谢调节，以及外界环境条件的调节。v人们利用已知或可能存在的生物合成途径及其代谢调控理论，已成功地解决了微生物药物生产过程中菌种产量、发酵工艺、产品质量等关键问题。v微生物药物的生物合成及其调控理论在微生物药物的生产中起着非常重要的指导作用。 5 5 学习内容第一节 微生物代谢调节（3学时）第二节 次级代谢与次级代谢产物（1学时）第三节 次级代谢产物的生物合成（2学时）第四节 次级代谢产物生物合成的调节与控制（2学时） 6 6 第一节 微生物代谢调节v 微生物体内存在着严密、精确、灵敏的代谢调节体系。v 这种自我调节作用使细胞经济有效地利用营养物质与能量，合

3、理地进行各种代谢活动，以适应微生物自身的正常生长繁殖和外界环境的变化，达到微生物代谢活动和外界环境高度统一。v 微生物代谢调节机制复杂，具有多系统、多层次特点，但主要通过控制酶来实现，即酶合成的调节（诱导和阻遏）和酶活性的调节（激活或抑制）。v 研究微生物代谢调节的实际意义在于打破微生物原有的代谢调控系统，过量积累目标产物，提高生产效率。 7 7 本节学习内容一、代谢调节的部位二、酶活性调节三、酶合成调节四、代谢调控 8 8 三、酶合成调节 酶合成调节是指通过控制酶的合成量来调节代谢速度的调节方式。 酶合成调节特点：缓慢、节约原料和能源 基因表达水平上调节 9 9 （一）诱导或阻遏 1. 酶合

4、成的诱导 组成酶（structural enzyme）：合成与环境无关，随菌体形成而合成，是细胞固有的酶，在菌体内的含量相对稳定。如与糖酵解途径（EMP）有关的酶。 诱导酶（inducible enzyme）: 是依赖于某种底物或底物的结构类似物的存在而合成的酶。如 -半乳糖苷酶和半乳糖苷透过酶等。 10 10 图2-15 培养基中加入乳糖诱导-半乳糖苷酶的合成相对数量细胞数量总蛋白质加入乳糖时间-半乳糖苷酶 环境物质促使微生物细胞合成酶蛋白的现象称为酶的诱导。 能够诱导某种酶合成的化合物称为酶的诱导剂（ inducer ）。 诱导剂种类和浓度影响诱导能力。 诱导剂通常是底物或底物的结构类似物

5、，及非底物高效诱导物。 11 11 酶正常底物非底物高效诱导剂-半乳糖苷酶乳糖异丙基-D-硫代半乳糖苷青霉素酶苄基青霉素2,6-二甲氧基苯基青霉素丁烯二酸顺反异构酶顺丁烯二酸丙二酸脂肪族酰胺酶乙酰胺N-甲基乙酰胺甘露糖链霉素酶甘露糖-甲基甘露糖苷异丙基-D-硫代半乳糖苷 （isopropyl- beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）表2-2 某些诱导酶的正常底物和非底物高效诱导物 12 12 协同诱导 是指加入一种诱导剂后，微生物能同时或几乎同时合成几种酶，它主要存在于较短的代谢途径中，合成这些酶的基因由同一操纵子所控制。是指第一种酶的底物会诱导第一种酶的合成，第

6、一种酶的产物又可诱导第二种酶的合成，以此类推合成一系列的酶，它常见于较长的用来降解好几个底物的降解途径。顺序诱导 13 13 图2-16 酶a、酶b和酶c的诱导酶的比活力生长底物加入（A） 协同诱导（B）顺序诱导时间a时间bcabc生长底物加入 14 14 乳糖加入到 E.coli 培养基中，下面三种酶被同时诱导。 举例-半乳糖苷酶 -半乳糖苷透过酶 半乳糖苷转乙酰酶 15 15 2. 酶合成的阻遏微生物在代谢过程中，当胞内某种代谢产物积累到一定程度时，就会阻止代谢途径中包括关键酶在内的一系列酶的合成，从而控制代谢的进行，减少末端产物生成，这种现象称为酶合成的阻遏。种类：分解代谢产物阻遏（ca

7、tabolite repression）末端代谢产物阻遏（end product repression） 16 16 分解代谢产物阻遏（catabolite repression） 在酶合成的阻遏中，如果代谢产物是某种化合物分解的中间产物，这种阻遏称为分解代谢产物阻遏。在酶合成的阻遏中，如果代谢产物是某种合成途径的终产物，这种阻遏称为末端代谢产物阻遏。末端代谢产物阻遏通常称为反馈阻遏（feedback repression）。末端代谢产物阻遏（end product repression） 17 17 （二）酶的诱导和阻遏的调节方式 1. 简单终产物阻遏单个终产物的生物合成途径中，当终产物过量

8、时，途径中所有的酶均被阻遏，当终产物浓度受限制时均被解阻遏，此即为简单终产物阻遏。图2-17 简单终产物阻遏的模式ABCD 18 18 2. 可被阻遏的酶的产物的诱导作用 单个终产物的生物合成途径中，终产物的阻遏只施加在途径的第一个酶上，由这个酶催化的反应的产物（B）的高浓度，促使其下游的酶的诱导合成。图2-18 可被阻遏的酶的产物的诱导模式ABCD 19 19 3. 多个单功能酶的简单终产物阻遏同工酶阻遏 多个终产物的生物合成途径中，共同途径的第一步反应受两个同工酶的催化，这两个同工酶分别受一个分支的终产物的阻遏。图2-19 同工酶阻遏的模式图ABCGDFE 20 20 4. 多功能酶的多价

9、阻遏多功能酶是指多肽链上有两个或两个以上具有催化活力的酶。多个终产物的生物合成途径中，第一个、第二个酶是多功能酶肽链上的两个酶，C是它前面的途径的产物，又是它后面途径的起始物。只有当途径的产物C和E均过量时，形成第一个产物的酶才被阻遏，见图2-20。ABCDE图2-20 多功能酶的多价阻遏模式图 21 21 图2-21 大肠埃希菌中的多功能酶的多价阻遏AK1ThrHD1Ile举例 在大肠埃希菌的天冬氨酸族氨基酸合成代谢途径中，AK（天冬氨酸激酶）有3个同工酶（AK 、AK 、AK），HD（高丝氨酸脱氢酶）有2个同工酶（HD 、HD ）。由AK 和HD 构成的多功能酶受Thr 和 Ile 的反馈

10、阻遏；由AK 和HD 构成的多功能酶受Met的反馈阻遏。 22 22 5. 催化两条不同合成途径的共用酶系的阻遏 多个终产物的生物合成途径中，催化两条不同合成途径的共用酶系的阻遏必须是两条途径的终产物均过量时才发生。图2-22 催化两条不同合成途径的共用酶系的阻遏模式图A或EC或GD或H 23 23 ThrIle或Val酮丁酸 -举例 在大肠埃希菌中，Ile合成途径中的5个酶有4个同样都催化Val合成中的对应反应步骤，所以这两种氨基酸均是阻遏这个酶系所需要的，此外，因为Val合成的直接前体-酮异戊酸是Leu合成途径的起始底物，因此Leu也是阻遏以上酶系所需要的。图2-23 大肠埃希菌中相同的酶

11、系从不同起始物合成Ile和Val 24 24 6. 分解代谢产物阻遏（catabolite repression） 分解代谢途径中，比较容易被一种微生物降解的化合物或其分解代谢物对较难被这种微生物降解的化合物的降解途径的阻遏。如葡萄糖的存在和降解阻遏了降解乳糖的酶系的合成。图2-24 分解代谢产物阻遏示意SBCDS或S的分解代谢物 25 25 7. 起始底物的诱导作用 分解代谢途径中，起始底物诱导其自身被分解的途径的酶系统。如枯草芽孢杆菌中的组氨酸诱导其自身被分解代谢生成谷氨酸的途径的一系列酶。图2-25 分解代谢中起始底物的诱导作用ABCDHisGlu 26 26 8. 降解代谢途径的中间产

12、物所引起的诱导作用 分解代谢途径中，起始底物必须首先被转化成诱导物（B）后，才能由该诱导物诱导合成降解途径的酶。图2-26 降解代谢途径的中间产物所引起的诱导作用ABCD 27 27 9. 汇流降解代谢途径中的诱导 分解代谢途径中，经两条可诱导途径生成一个共同的中间产物（F），这个中间产物进而诱导一条对两个初始底物而言是共用的降解途径。ABEFHJDGIC图2-27 汇流降解代谢途径中的诱导模式图 28 28 10. 多功能途径的诱导 分解代谢途径中，两个化合物（A或F，C或H）中的每个均诱导一些反应，从而构成一条能降解这两个化合物（A和F）的途径。图2-28 多功能途径的诱导（模式图）A或F

13、C或HD或IE或J 29 29 （三）酶合成调节的分子机制 1. 诱导作用的分子机制 诱导作用的分子机制可用操纵子学说来解释，见图2-29。操纵子由调节基因R、启动基因P、操纵基因O和结构基因S组成，结构基因的转录和翻译受调节基因、启动基因和操作基因的控制。 30 30 启动基因P调节基因R结构基因S操纵基因O操纵子：调节基因编码阻遏蛋白（阻遏物），一种调节蛋白，是变构蛋白。阻遏蛋白既有与操纵基因结合的位点，又有与调节剂（诱导物）结合的位点。阻遏蛋白与操纵基因结合后，阻挡RNA聚合酶对结构基因的转录（图2-29）。阻遏蛋白与诱导物结合后，其构象发生改变，不能与操纵基因结合，致使RNA聚合酶结合

14、于启动基因上，并进行转录和翻译，表达所需要的酶（图2-29）。 31 31 诱导物诱导物与阻遏蛋白结合后，使它不能与操纵基因结合。有诱导物：RNA聚合酶RNA聚合酶被阻挡，结构基因无法转录成mRNA。结构基因Sx y z无诱导物：启动基因P操纵子调节基因RmRNA阻遏蛋白操纵基因O图2-29 酶诱导的操纵子学说x y z 32 32 酶诱导的操纵子模型讨论如果调节基因发生突变： 导致阻遏蛋白结构发生改变，失去同操纵基因结合的能力，去阻遏作用，进行转录。如果操纵基因发生突变： 导致操纵基因不能与阻遏蛋白结合，造成结构基因不受控制地转录。上述两种突变的结果： 即使没有诱导物存在RNA聚合酶也能转录

15、，将这种突变称为组成型突变。 33 33 2. 分解代谢产物阻遏的分子机制 Monod提出的乳糖操纵子模型解释分解代谢产物阻遏的分子机制 （图2-30）。 乳糖操纵子的启动基因内有与RNA聚合酶结合位点，还有一个与 CRP-cAMP复合物的结合位点。 CRP由CRP基因编码，是cAMP受体蛋白。当CRP与cAMP结合后，就会 被活化， CRP-cAMP复合物又会激活启动基因，并使RNA聚合酶与启动 基因结合。 34 34 在只含有乳糖的培养环境中，乳糖操纵子的“开关”开启，三种与乳糖 代谢有关的酶能被顺利合成。 乳糖与葡萄糖同时存在时，分解葡萄糖的酶类（组成酶）能迅速地将葡 萄糖降解成某种中间

16、产物（X），X即会阻止ATP环化形成cAMP，同时 又会促进cAMP分解成AMP，从而降低了cAMP的浓度，继而阻遏了与 乳糖降解有关的诱导酶合成。分解代谢产物阻遏的实质是由于细胞内缺少了环腺苷酸（cAMP） 35 35 激活葡萄糖5-AMP 分解代谢产物“X” ATP腺苷酸环化酶 磷酸二酯酶抑制CRPmRNACRP-cAMP复合物-cAMPRNA聚合酶SPCRP基因O图2-30 分解代谢产物阻遏的分子水平机制cAMP 36 36 如果CRP基因发生缺失或突变： 没有正常的CRP产生，不能形成CRP- cAMP复合物，则对葡萄糖分解代谢阻遏的酶系不能起解阻遏作用。分解代谢产物阻遏的分子机制的讨

17、论如果启动基因发生突变： 使其与RNA多聚酶的亲和力增大，这样的突变株可能解除了分解代谢物阻遏。 37 37 3. 末端代谢产物阻遏的分子机制 末端代谢产物阻遏的机制也可以用操纵子学说解释，见图2-31 。 R基因生成的阻遏蛋白是无活性的，但辅阻遏物（一般为生物合成途径 的末端产物）可激活它；活化的阻遏蛋白能与操纵基因结合，从而阻止 RNA聚合酶对结构 基因的转录。 辅阻遏物也可能是末端产物的衍生物。 38 38 辅阻遏物RNA聚合酶辅阻遏物与阻遏蛋白结合成阻遏物，从而阻碍转录的进行。结构基因S有辅阻遏物（末端产物）：P调节基因RmRNA阻遏蛋白O无辅阻遏物时，阻遏蛋白不起作用，RNA聚合酶沿DNA分子链移动，把结构基因转录到mRNA上。无辅阻遏物（末端产物）：图2-31 末端代谢产物阻遏在分子水平上的作用机制 39 39 如果调节基因发生突变： 改变的阻遏蛋白不能与终产物结合，去阻遏。末端代谢产物阻遏的分子机制的讨论如果操纵基因发生突变： 操纵基因的阻塞无法实现，解除反馈阻遏。上述突变株均可以解除反馈阻遏，过量合成该途径的酶和末端代谢产物。这样的突变株在工业生产上是极其有用的。 40 40 7. 以链霉素为例阐述次级代谢产物生物合成的基本过程，并指出如何提高链