色谱-质谱联用技术

1、戴 琛生命科学实验中心生物化学与分子生物学系Tel: 84390590,mail: 色谱色谱- -质谱联用技术原理质谱联用技术原理LTQ Orbitrap LTQ Orbitrap 仪器仪器应用领域应用领域实验设计实验设计色谱法由俄国植物学家茨维特分离色谱法由俄国植物学家茨维特分离植物色素植物色素时采用。时采用。 将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，加入石油醚使将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，加入石油醚使自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带，因自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带，因得名为色谱法。以后

2、此法逐渐应用于得名为色谱法。以后此法逐渐应用于无色物质的分离无色物质的分离，“色谱色谱”二字虽二字虽已失去原来已失去原来含义，但仍被人们沿用至今。含义，但仍被人们沿用至今。定义：色谱是一种把混合物中定义：色谱是一种把混合物中多组分分离多组分分离的实验技术。的实验技术。即利用化合物的即利用化合物的物理化学性质物理化学性质建立的分离分析方法。建立的分离分析方法。实质：分离实质：分离目的：定性或定量分析目的：定性或定量分析填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相（固体或液体）填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相（固体或液体）称为称为固定相固定相；自上而下运动的一相（一般是气体或液体）称为自上而下运动的一

3、相（一般是气体或液体）称为流动相流动相； 装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢管）称为装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢管）称为色谱柱色谱柱。当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而滞留时间长短不同，从而按先后不同的次序按先后不同的次序从固从固定相中流出定相中流出。分配色谱分配色谱：利用在

4、流动相和固定相中分配系数的不同：利用在流动相和固定相中分配系数的不同分离；分离；吸附色谱吸附色谱：利用物理吸附性能的差异分离；：利用物理吸附性能的差异分离；离子交换色谱离子交换色谱：利用离子交换能力的差别分离；：利用离子交换能力的差别分离；空间排阻色谱空间排阻色谱：利用排阻作用力的不同分离：利用排阻作用力的不同分离在常用的色谱中，常是在常用的色谱中，常是几种分离机制共同作用几种分离机制共同作用的的结果。结果。注意注意在柱温条件下有一定蒸气压且稳定性好的样品在柱温条件下有一定蒸气压且稳定性好的样品都能测定，只要在都能测定，只要在 196 450 196 450 温度范围内有温度范围内有27 27

5、 1330 Pa1330 Pa蒸气压且不分解的物质蒸气压且不分解的物质原则上都能测定，原则上都能测定，不论它是气体、液体和固体。不论它是气体、液体和固体。 对于挥发性低和受热易分解的物质，若能对于挥发性低和受热易分解的物质，若能通过化学衍生方法使其转化为通过化学衍生方法使其转化为挥发性大、热稳定性挥发性大、热稳定性好的好的衍生物衍生物，同样可用气相色谱分离和分析。，同样可用气相色谱分离和分析。 GC GC 专长：同系物专长：同系物 GC GC 主要用于分离和定量主要用于分离和定量，可广泛应用在环，可广泛应用在环保、临床、药物、农药、食品、污染物等方面的测保、临床、药物、农药、食品、污染物等方面

6、的测定。定。液相色谱对不宜汽化的高分子，热稳定性差、对不宜汽化的高分子，热稳定性差、化学性质极为活泼或强腐蚀性物质不能化学性质极为活泼或强腐蚀性物质不能用用GC测定。应用范围受到限制，在所测定。应用范围受到限制，在所有的有机物分析中只有有的有机物分析中只有1520%能用能用GC进行分离分析。进行分离分析。对于对于极性和高分子量极性和高分子量化合物，液相色谱化合物，液相色谱（LC）则是其关键的分离技术。）则是其关键的分离技术。 1 1 样品中所含组分的最少个数样品中所含组分的最少个数2 2 保留值保留值-定性分析定性分析3 3 色谱峰面积（或峰高）色谱峰面积（或峰高）-定量分析定量分析4 4 色

7、谱峰的保留值和区域宽度色谱峰的保留值和区域宽度-评价色谱柱的分离效能评价色谱柱的分离效能5 5 根据相邻色谱峰之间的距离来选择合适的色谱分离条件根据相邻色谱峰之间的距离来选择合适的色谱分离条件保留时间反相色谱C18，C8，CN极性大的组分先出峰，极性小的组分后出峰。正相色谱NH2，硅胶柱，CN极性大的组分后出峰，极性小的组分先出峰。UVDAD荧光Q：UV检测器是不是通用检测器？UV：共轭体系FLD：1共轭双键体系 2刚性平面结构 3给电子取代基质谱基本知识什么是质谱？质谱分析法是通过对被测样品离子质谱分析法是通过对被测样品离子质荷比质荷比（m/zm/z）的测定来进行分析的一种方法。的测定来进行

8、分析的一种方法。 被分析的样品首先要被分析的样品首先要离子化离子化，然后利用不同离子，然后利用不同离子在在电场或磁场电场或磁场运动行为的不同，把离子按运动行为的不同，把离子按m/zm/z分开分开而得到质谱，并得到样品的而得到质谱，并得到样品的定性定量定性定量结果。结果。m/z15294357859911314271如何理解质谱的发展质谱的发展40年代年代同位素测定和无机元素分析同位素测定和无机元素分析50年代年代有机物分析有机物分析60年代年代气相色谱气相色谱-质谱联用质谱联用80年代年代新的质谱技术新的质谱技术接口技术（基质辅助激光解吸电离源，接口技术（基质辅助激光解吸电离源，电喷雾电离源，

9、大气压化学电离源）电喷雾电离源，大气压化学电离源）新质谱仪（液相色谱新质谱仪（液相色谱-质谱联用仪，质谱联用仪，傅里叶变换质谱仪等）傅里叶变换质谱仪等）目前质谱分析法已广泛地应用于化学、化工、材料、环境、药物、刑侦、目前质谱分析法已广泛地应用于化学、化工、材料、环境、药物、刑侦、生命科学、运动医学等各个领域。生命科学、运动医学等各个领域。 1911年年 世界第一台质谱装置（世界第一台质谱装置（J.J. Thomson） 70年代年代计算机技术引入计算机技术引入质谱特点 质谱不属波谱范围；质谱不属波谱范围； 质谱为通用型检测器；质谱为通用型检测器； 质谱是分子离子及碎片离子的质量与其相对强度的质

10、谱是分子离子及碎片离子的质量与其相对强度的谱谱, 谱图与分子结构有关；谱图与分子结构有关； 质谱法进样量少质谱法进样量少, 灵敏度高灵敏度高, 分析速度快；分析速度快； 质谱法可提供分子量质谱法可提供分子量, 确定确定分子式分子式。 质谱简化流程（GMSD）质谱仪的基本结构质谱仪的基本结构 质谱仪包括质谱仪包括进进样系统样系统、电离系统电离系统、质量分析系统和检质量分析系统和检测系统测系统。 计算机数据处理系统真空系统 加速区进样系统离子源质量分析器检测器 真空系统质谱仪的离子产生及经过系统必须处于质谱仪的离子产生及经过系统必须处于高真空状高真空状态态。若真空度过低，则会造成离子源灯丝损坏、。

11、若真空度过低，则会造成离子源灯丝损坏、本底增高、图谱复杂化、干扰离子源的调节、加本底增高、图谱复杂化、干扰离子源的调节、加速极放电等问题。速极放电等问题。一般质谱仪都采用一般质谱仪都采用机械泵机械泵预抽真空后，再用高效预抽真空后，再用高效率率扩散泵扩散泵连续地运行以保持真空。现代质谱仪采连续地运行以保持真空。现代质谱仪采用用分子泵分子泵可获得更高的真空度。可获得更高的真空度。二级真空系统！二级真空系统！真空系统为早期的维护反馈提供数字化控制双分子涡轮泵可快速抽真空和进行稳定操作进样系统进样系统目的是进样系统目的是高效重复地将样品引入到高效重复地将样品引入到离子源中并且不能造成真空度的降低。离子

12、源中并且不能造成真空度的降低。进样方式：进样方式：1 直接进样直接进样2 仪器联用的进样仪器联用的进样 （GC、LC、CE）为什么质谱要与色谱联用？LC 灵敏度：灵敏度：ug/mLmg/mLUV检测器缺乏通用性检测器缺乏通用性MS灵敏度：pg/mLng/mL高选择性，以m/z进行区分直接进样需要一定的纯度直接进样需要一定的纯度色谱的分离能力色谱的分离能力质谱的定性功能质谱的定性功能实现对复杂混合物更实现对复杂混合物更准确的定量和定性分准确的定量和定性分析。而且也简化了样析。而且也简化了样品的前处理过程，使品的前处理过程，使样品分析更简便。样品分析更简便。长期以来，LC与MS联用被认为是“不可能

13、的结合”传统的传统的HPLC系统中遇到的流量（系统中遇到的流量（0.52 mL/min的正、反相溶剂流速）和质谱仪要求的正、反相溶剂流速）和质谱仪要求的真空之间存在的难以协调性似乎太大了。的真空之间存在的难以协调性似乎太大了。将流量达将流量达2 mL/min的液体引进的液体引进MS的真空系统需要的真空系统需要使用一个合适的使用一个合适的接口接口Desolvate sample flow for introduction into mass spectrometer.（去溶剂）Baffle the first vacuum region of the MS from atmospheric pr

14、essure in the source. (真空过渡)Ionize the analyte or transport ion in solution to thegas phase. （离子化）Pump away neutrals and opposite charged ions which would otherwise interfere with the analysis of the desired polarity. （去除干扰）电子轰击电离源电子轰击电离源 electron impact ionization source, EI化学电离源化学电离源 chemical ioni

15、zation source, CI快原子轰击电离源快原子轰击电离源 fast atom bombardment source, FAB电喷雾电离源电喷雾电离源 electrospray ionization source, ESI大气压化学电离源大气压化学电离源 atmospheric pressure chemical ionization source, APCI基质辅助激光解析电离源基质辅助激光解析电离源 Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization, MALDIEI源源主要用于挥发性样品的电离（主要用于挥发性样品的电离（GC-MS）。）。 原理

16、：由原理：由GC或直接进样杆进入的样品，以气体形式或直接进样杆进入的样品，以气体形式进入离子源，由灯丝发出的电子与样品分子发生碰进入离子源，由灯丝发出的电子与样品分子发生碰撞使样品分子电离。撞使样品分子电离。 所有的标准质谱图都是在所有的标准质谱图都是在70 eV下做出的。有机物下做出的。有机物分子可能被打掉一个电子形成分子离子，也可能会分子可能被打掉一个电子形成分子离子，也可能会发生化学键的断裂形成碎片离子。发生化学键的断裂形成碎片离子。由分子离子可以确定化合物分子量，由碎片离由分子离子可以确定化合物分子量，由碎片离子可以得到化合物的结构信息。子可以得到化合物的结构信息。1）结构简单，稳定，

17、电离效率高，易于实现；2）质谱图再现性好，便于计算机检索及比较；3）离子碎片多，可提供较多的分子结构信息。4）当样品分子稳定性不高时，分子离子峰的强度低，甚至不存在分子离子峰。ESI电喷雾电离源 ESI喷嘴横截面ESIESI源结构ESI源特点离子在液相产生软电离模式, 可给出分子离子峰有益于热不稳定化合物的分析有益于中等到高等极性化合物分析有益于大分子（蛋白/多肽）带多电荷大气压化学电离源（APCI）APCI源结构APCIAPCI源特点离子在气态产生不利于热不稳定化合物的分析有益于低极性到中等极性化合物的分析适合小分子（steroids-类固醇, 甾体化合物）比ESI更能容忍缓冲盐软电离模式，

18、仅产生单电荷离子离子化技术应用覆盖基质辅助激光解析电离源基质辅助激光解析电离源 MALDIMALDI MALDI适用于适用于生物大分子生物大分子，如肽类，如肽类，核酸类化合物。可得到核酸类化合物。可得到准准分子离子峰，分子离子峰，碎片离子和多电荷离子较少碎片离子和多电荷离子较少. MALDI可使热敏感或不挥发的化合物由固相直接得到离子。可使热敏感或不挥发的化合物由固相直接得到离子。 待测物质的溶液与基质的溶液混合后蒸发，使分析物与基质成为待测物质的溶液与基质的溶液混合后蒸发，使分析物与基质成为晶体或半晶体晶体或半晶体，用一定波长的脉冲式激光进行照射时，基质分子能，用一定波长的脉冲式激光进行照射

19、时，基质分子能有效的有效的吸收激光的能量吸收激光的能量，使，使基质分子和样品分子进入气相基质分子和样品分子进入气相并得到电并得到电离。离。 质量分析器质量分析器是质谱仪的核心, 质量分析器的作用是将离子源产生的离子按m/z顺序进行分离并排列。 目前常用的质量分析器有：磁质量分析器（Magnetic Sector Analyzer） 四极杆质量分析器（quadrupole mass analyzer） 飞行时间质量分析器（time of flight, TOF ） 离子阱质量分析器（ion trap）41在一定的B、V下，不同m/z 的离子其R不同，由离子源产生的离子，经过分析器后可实现质量分离

20、。 离子进入分析器后，由于磁场的作用，其运动轨道发生偏转改作圆周离子进入分析器后，由于磁场的作用，其运动轨道发生偏转改作圆周运动。其运动轨道半径运动。其运动轨道半径R可由下式表示：可由下式表示： 上式中， m -离子质量 Z -离子电荷量 V -离子加速电压 B -磁感应强度传统的四极杆质量分析器是由四根笔直的棒状电极与轴线平行并等距离的置悬着构成，棒的理想表面为双曲面。在一定DC/VC作用下，只有m/z满足一定要求的离子才能通过四极杆到达检测器，其他离子被滤掉。+四极杆质量分析器示意图四极杆质量分析器具有重量轻、体积小、造价低廉等优点。用一个脉冲将离子源中的离子瞬间引出，经加速电压加速，它们

21、具有相同的动能进入漂移管，质荷比小的离子具有最快的速度因而首先到达检测器，质荷比大的离子则最后到达检测器。Ion SourceDrift RegionDetectorReflection特点： 1）检测离子的质荷比范围非常宽；2）灵敏度高，适合于作串联质谱的第二级；3）扫描速度快，适合研究极快过程。质谱仪常用的检测器有直接电检测器、电子倍增器、闪烁检测器和微通道板等。 电子倍增器运用质量分析器出来的离子轰击电子倍增管的阴极表面，使其发射出二次电子，再用二次电子依次轰击一系列电极，使二次电子获得不断倍增，最后由阳极接受电子流，使离子束信号得到放大。电子倍增器示意图质谱仪都配有完善的计算机系统，不仅能快速准确的采集数据和处理数据，而且能监控质谱仪各单元的工作状态，实现质谱仪的全自动操作，并能代替人工进行化合物的定性和定量分析软件：XcaliburPDMetabolite ID质荷比(m/z): 离子质量(以相对原子量单位计)与它所带电荷(以电子电量为单位计)的比值。峰(Peak