脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2

1、器材准备器材准备浓汁标本浓汁标本1 1支，粪便标本支，粪便标本1 1支；碘酒棉球支；碘酒棉球1 1瓶，酒精棉球瓶，酒精棉球1 1瓶，眼科镊子瓶，眼科镊子2 2把；伊红美兰平板把；伊红美兰平板2 2个，营养琼脂平板个，营养琼脂平板5 5个。个。自然界中的微生物v已经发现的微生物大约13万5千多种，被认为非常危险的有600种，在人间传染的病原微生物380种。这些微生物存在于地球的各个角落，从寒冷的极地到炎热的赤道，从4.2千米地层深处到85千米高空（芽孢）,均有它们的踪迹 。v空气、水、土壤、人体的体表以及与外界相通的腔道，均有不同种类和数量的微生物存在。v存在于人体消化道的细菌细菌超过800种，

2、数量可达100万亿（1014），菌体重量11.5公斤。空气与人体体表细菌学检查空气的细菌学检查P38手指皮肤的细菌学检查P41空气的细菌学检查P38 空气是人类赖以生存的环境之一，也是重要的疾病传播媒介。空气中的病原菌主要来自病人的排泄物和分泌物。这些污物，因风吹，以及人类日常活动，以气溶胶的形式悬浮于空中，使空气受到污染。v实验方法：自然沉降法自然沉降法是根据空气中细菌气溶胶粒子，在地心引力的作用下，以垂直的自然方式沉降到培养基表面；培养以后，计数菌落形成单位（ colony forming unit ，CFU），了解空气的污染情况。v实验步骤：每组1个营养琼脂平板，选择采样地点（实验室、宿

3、舍、卫生间、饭堂或任选地点），将平板盖打开，盖朝下放置在平板旁，平板暴露于空气中15分钟，然后盖上盖子，作标记。37温箱培养24小时，观察结果。 CFU/m3 50000NAT86N(直径7cm平板）。 N：平板上的菌落数。 A：平板面积(平方厘米)。 T：采样时间(分钟)。空气的细菌学检查空气的细菌学检查 暴露法（暴露法（Exposure Method)Exposure Method)组号地点时间(min)菌落形成单位(CFU)1卫生间152食堂153门诊大厅154呼吸科病房155呼吸科ICU156外科病房157外科ICU158外科治疗室159婴儿室1510实验室15手指皮肤的细菌学检查P4

4、1 在日常生活中，手的接触范围广，使用频率高，受到污染的机会也最多。一只外观比较“干净 ”的手，可携带10万个细菌、200多种病毒。因此，经手传播的疾病很多，范围很广，包括肠道传染病、部分呼吸道传染病、皮肤传染病，以及一切可经手间接传播的疾病。v常住菌：常住菌：存在于皮肤表面、毛囊和皮脂腺。种类和数量比较恒定。附着在皮肤上比较牢固，用一般洗手方法，常不易去除。v暂住菌：暂住菌：存在于皮肤表面经常暴露的部位。暂住菌是外来的非正常菌群，种类和数量不定。引起人类致病的通常是暂住菌。v医务人员，经常要与病人接触，不管是直接接触，还是间接接触，都有传播病菌的可能。虽然病菌的直接来源是患者, 但是造成病菌

5、扩散的主要途径则是气溶胶和医务人员的手。因此，经常洗手和消毒是控制医院内交叉感染的主要方法。v实际上，预防感染措施中，最简单又十分有效的方法就是洗手。据测定，只用自来水洗手可使暂暂住菌住菌总数减少40%，用肥皂洗手可减少80%以上。v洗手？常规的洗手方法常规的洗手方法（甲和丙操作）v将手充分浸湿，涂抹肥皂或洗涤液。v反复搓揉双手，搓揉时间不应少于 30秒。v用流水冲洗干净，整个洗手过程不少于1分钟。能有效地去除手上的大多数暂住菌。医学微生物学教学实验室标准洗手方法标准洗手方法（乙和丁操作）v用流动的水冲洗，将手充分浸湿，涂抹肥皂、洗涤液。用流动的水冲洗，将手充分浸湿，涂抹肥皂、洗涤液。v分别搓

6、擦分别搓擦10101515次。次。v保持双手低于肘部，保持双手低于肘部，流水冲洗一分钟以上。流水冲洗一分钟以上。1.1.掌心对掌心搓擦掌心对掌心搓擦 2.2.手指交错掌心对手背搓擦手指交错掌心对手背搓擦 3.3.手指交错掌心对掌心搓擦手指交错掌心对掌心搓擦4.4.两手互握互搓指背两手互握互搓指背 5.5.拇指在掌中转动搓擦拇指在掌中转动搓擦 6.6.指尖在掌心中搓擦指尖在掌心中搓擦1 3 2 4 1 3 2 4 手指皮肤的手指皮肤的细菌学检查细菌学检查第1格为洗手前，第2格为洗手后，第3格为消毒后，第4格空白对照。 2人1个营养琼脂平板上:甲、丙常规洗手下:乙、丁标准洗手甲（丙）乙（丁）丙丁脓

7、汁和粪便标本中病原菌的检测(二)v细菌的分离与培养P7 目的要求：掌握分离、纯化微生物的基本操作技术。平板划线分离法平板划线分离法 Streak Plate MethodStreak Plate Methodv借助于划线，将混杂的多种多种细菌，在固体培养基表面分散成单个单个细菌，并固定在某一点上。培养以后细菌各自分裂繁殖，形成肉眼可见的细菌集团。在固体培养基表面或基内，由单个细菌在局部位置不断增值的稠密群体称为单菌落单菌落。在固体培养基表面，由多个菌落融合在一起形成的细菌堆积物,称为菌苔菌苔。平板分区划线分离方法步骤（平板分区划线分离方法步骤（5 5区）区）v接种环烧灼灭菌，以免污染标本。v取

8、标本在平板表面上方密集涂布510mm2。v烧掉接种环上多余的标本（火焰背面烤干烧灼）。v晃动平板，当看到平板表面象镜面有反光的时候，保持这个角度，划线时就能看清划线痕迹，以便控制划线。v接种环与平板呈3040度角，通过密集涂布部分3次，使接种环重新沾上少量标本(细菌)，然后在平板表面，以曲线的形式，作大幅度来回连续划线，边划边退，线段要划得长而密集，每区划线不少于30条。v转动平板，接种环通过第一区1次，同样的 方法划第二区。如此依次划完35区。v接种环烧灼灭菌，以免污染环境。v将平板倒置37培养1824h 。充分利用平板面积，不能划破琼脂。充分利用平板面积，不能划破琼脂。第四区平板划线分离小

9、组分工v甲脓汁标本营养琼脂平板(nutrient agar plate)v乙脓汁标本营养琼脂平板(nutrient agar plate）v丙粪便标本伊红美蓝平板(eosin methylene blue plate）v丁粪便标本伊红美蓝平板(EMB plate）杆1214cm环直径24mm柄10cm接种环接种环 inoculatinginoculating looploop杆1214cm柄10cm针46cm接种针接种针 straight wirestraight wire inoculating inoculating wirewire ,inoculating needleinoculat

10、ing needle接种环烧灼灭菌 Flame Loopv使用前，直接在酒精灯上烧灼灭菌，把环和金属丝烧红即可。v使用后，先在火焰背面把环上标本烤干，再烧灼灭菌，以免标本汽化，爆烈四溅，污染环境。v金属杆快速通过火焰23次，杀灭表面微生物。酒精灯无菌操作区外焰外焰:又称氧化焰又称氧化焰,火焰火焰呈淡紫色呈淡紫色,温度较高。温度较高。无菌操作区无菌操作区: :火焰周火焰周围围101020cm20cm范围内。范围内。环面水平水平离开液面：快速6ul,慢速2ul。环面垂直垂直离开液面：快速3ul,慢速1ul。接种环取液体标本的方法：接种环取液体标本的方法：环直径环直径3mm3mm无菌取材基本步骤无菌

11、取材基本步骤 在火焰旁边，左手斜持标本管下端，右手小指夹住试管棉塞外侧，缓慢拔出棉塞并夹持之（塞入管口内的棉塞不得接触到管外任何物体）管口迅速通过火焰3次取标本取标本管口通过火焰三次，塞入棉塞。接种环、平板的握持方法接种环、平板的握持方法正确正确correctcorrect错误错误incorrectincorrect平板划线示意图平板划线示意图涂布涂布spreadingspreading细菌大多分细菌大多分散成单个。散成单个。细菌前段很多，后细菌前段很多，后段太少，分离效果段太少，分离效果差。差。510mm2 30条线/区平板划线不少于150条线37培养24小时 生物安全警告v接种环接种平板一

12、次，可产生几十个微生物气溶胶颗粒。v气溶胶粒径100um沉降很快，50um在0.4s内扩散开，5um通过呼吸道直接到达肺泡。vPike博士对实验室感染统计分析结果发现，不明原因的感染高达82%，大多数是气溶胶在空气中扩散引起的。v实验时应坐着，在火焰周围1020厘米内操作，保持安静、有序，尽量少说话、少走动，以免感染病原菌。思考题v为何取链球菌作为空气的卫生指标之一?v为什么金黄色葡萄球菌是医院内感染常见的重要病原菌?v为什么接种环使用前后必须烧灼灭菌？忽略了有什么危害?v做细菌培养时，平板为什么要倒置?v培养细菌的常用方法有哪些?v从临床标本中分离病原菌，应注意哪些事项? 常用器材摆放顺序：电源插座常用器材摆放顺序：电源插座试管架试管架酒精灯酒精灯污物盘。污物盘。试管架上器材：靠近插座一侧第试管架上器材：靠近插座一侧第1 1列放置列放置接种针接种针, ,第第2 2列放置列放置接种环，另一侧中间两行放置油性笔和打火机接种环，另一侧中间两行放置油性笔和打火机。器材使用后，必须放回原处，依次摆整齐。器材使用后，必须放回原处，依次摆整齐。实验器材实