细胞培养的基本技术

1、细胞培养的基本技术 申艳娜：申艳娜：办公室：医学检验学院病原生物学教研室办公室：医学检验学院病原生物学教研室E-mail: 2主要内容n 基本操作技术和要求基本操作技术和要求n 原代培养原代培养n 传代培养和细胞系的维持传代培养和细胞系的维持n 培养细胞生长性状的观察培养细胞生长性状的观察n 细胞冻存与细胞复苏细胞冻存与细胞复苏n 微生物污染的检测与排除微生物污染的检测与排除3一、基本操作技术和要求一、基本操作技术和要求n 1.培养前准备培养前准备实验前要制定好实验计划和操作程序；计算好有关数据；准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。5无菌操作n

2、 2.培养室和超净台的消毒培养室和超净台的消毒无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面次(拖布要专用)，紫外线照射消毒3050min，超净工作台台面每次实验前要用75酒精擦洗。然后紫外线消毒30min。6无菌操作n 培养室和超净台的消毒消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。7无菌操作n 3.3.洗手和着装洗手和着装进入无菌培养室原则上需彻底洗手并按外科手术要求着装；无菌服、帽子和口罩每次实验后，均需清洗、消毒；操作前要用75酒精或0.2新洁尔灭消毒手和前臂。8无菌操作n 4

3、.4.无菌培养操作无菌培养操作火焰消毒n 在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。9n 无菌培养操作操作时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。10无菌操作n无菌培养操作工作台面上的用品要放置有序、布局合理，一般酒精灯位于中间，右手使用的在右侧，左手使用的在左侧。移液管、尖吸管不应交叉使用，防止交叉污染。培养细胞的取材n取材的基本要求：1.尽快培养2.严格无菌操作3.减少对细胞的机械损伤4.去除坏死组织，避免组织块干燥

4、5.培养液营养丰富6.易培养的组织成功率高7.详细记录取材的基本器材和用品1.眼科组织弯剪、弯镊、手术刀2.小瓶装无血清培养基、Hanks液3.小烧杯4.培养皿各部位组织的取材n皮肤和黏膜n内脏和实体瘤n血细胞n骨髓、羊水、胸水、腹水内细胞n鼠胚组织n鸡胚组织组织材料的分离n细胞悬液的分离方法：血液、羊水、胸水、腹水等细胞悬液离心分离，5001000r/min，510min组织材料的分离n组织块的分离方法1.机械分散法2.剪切分离法3.消化分离法机械分散法n纤维成分很少的组织，如脑组织、部分胚胎组织以及一些肿瘤组织。方法： 1.剪刀剪切，吸管反复吹打分散组织细胞。 2.组织放在注射器内通过针头

5、压出。 3.注射器针芯挤压通过不锈钢筛网（50目、200目、400目）剪切分离法n组织块移植培养时，将组织剪成或切成小块（1cm3）用眼科剪反复剪切组织至糊状，吸取培养液反复吹打，低速离心去上清，再分离培养。消化分离法胰蛋白酶消化法n用于消化细胞间质较少的软组织，如胚胎、上皮、肝、肾等，同时也用于培养的细胞。npH 、温度、浓度、组织块大小和硬度。n0.10.5%，常用0.25%npH= 8n5mm3胚胎类软组织， 0.25%胰蛋白酶，37，20-30min即可。n钙、镁离子及血清对胰蛋白酶有抑制作用。n分次消化nEDTA较胰蛋白酶缓和，从组织环境中吸取钙、镁离子，破坏组织的完整性。n0.02

6、%，用不含钙、镁离子的BSS配置。n不能被血清中和，用洗涤、离心方法去除。n胰蛋白酶与EDTA联合使用提高效果，1:1或1:2消化分离法胶原酶法n胶原酶（collagenase）是从溶组织梭状细胞芽孢杆菌提取制备的。对细胞间质有消化作用而对上皮细胞影响不大。n分为、型及肝细胞专用胶原酶型。n胶原酶型肝、骨、甲状腺、心脏、唾液腺n胶原酶型广泛n不分型的复合胶原酶肿瘤细胞n常用量200U/mL（1mg/ml）或0.03%0.3%。n37震荡，肿瘤组织或致密结缔组织4-48h，易消化组织1545min。二、原代培养n也叫初代培养，是从供体取得细胞后在体外进行的首次培养。n生物学特性最接近和反映体内生

7、长特性，适合做药物测试、细胞分化等试验研究。n原代培养的组织由多种细胞成分组成，细胞间存在很大差异，生物学特征不稳定，需对细胞传代后做对比性试验研究。组织块培养法n适用于组织量少的原代培养，如牙髓细胞培养。n取材修剪冲洗n剪切成1mm3小块n移入培养瓶（可预先涂布薄层血清或鼠尾胶原）n分布组织小块间距5mm （50ml培养瓶放2030块组织块）n翻转培养瓶并加适量培养液，37静止2-4hn翻正培养瓶进行培养（动作轻巧，液体缓慢覆盖培养块）n原代细胞生长（3-5天换液去除漂浮组织块和血细胞）消化培养法 组织消化分散法器官培养26三、传代培养和细胞系的维持n原代培养：也称初代培养从供体取得组织细胞

8、后在体外进行的首次培养，是建立细胞系的第一步。n传代培养细胞培养过程中，细胞增殖而数量增加，单层培养细胞相互汇合，覆盖整个培养瓶，需进行分离培养。细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的过程称传代。进行一次分离再培养称之为传一代。27细胞传代方法n 1.贴壁细胞的消化法传代：采用酶消化法传代。步骤：（1）吸除瓶内旧培养液（2）加入消化液（胰蛋白酶或与EDTA混合液）（3）37或室温以上消化2-5 min（显微镜下观察胞质回缩、细胞间隙变大终止消化）（4）吸走消化液，加入含血清的培养液（5）用吸管反复吹打形成细胞悬液（6）计数，接种在新的培养瓶内。细胞传代培养消化法n2.悬浮细胞的消化法传代：

9、采用直接传代或离心收集细胞后传代。（1）直接传代：使悬浮细胞沉淀在瓶底，将上清吸掉1/22/3，用吸管吹打形成细胞悬液在传代。（2）离心传代：收集到离心管中8001000r/min，5min，去上清，加新培养液吹打称细胞悬液，传代接种。n3.部分贴壁细胞：直接吹打或消化传代n原代培养物经首次传代成功后即为细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系组成。如果不能继续传代或传代数有限，称为有限细胞系（finite cell line）；如果具有无限生存能力，则称为连续细胞系（continuous cell line）。细胞系31细胞系的维持：“换液、传代、冻存”1.细胞系档案要记录好2.在维持传代

10、时要注意保持规律性3.多种细胞系传代避免交叉污染4.要有充足的冻存储备培养细胞的纯化n1.自然纯化：利用某一种类细胞的增殖优势，去除其他细胞，达到细胞纯化的目的。n成纤维细胞具有增殖优势。n恶性肿瘤可以通过此方法。2.人工纯化：利用人为手段造成对某一细胞生长有利的环境条件，抑制其他细胞生长，从而达到纯化细胞的目的。n酶消化法：成纤维细胞易消化n机械刮除法：分区或分片生长n反复贴壁法：贴壁速度不同，成纤维细胞先贴壁n克隆法：单个细胞分别克隆生长n培养基限定法：条件培养基或限定性培养基筛选n流式细胞仪分离法n免疫磁珠分离法培养细胞生长性状的观察培养细胞生长性状的观察n1.1.常规观察常规观察n2.

11、2.活细胞的观察活细胞的观察n3.3.细胞生长状况的观察细胞生长状况的观察35常规观察常规观察n 细胞经原代培养后及传代或换液后均需细胞经原代培养后及传代或换液后均需进行连续的、动态性观察。进行连续的、动态性观察。n 每日或隔日观察一次，并做好相关记录。每日或隔日观察一次，并做好相关记录。活细胞形态活细胞形态数量数量移动情况移动情况36常规观察常规观察1.1.培养液培养液2.2.细胞生长概况细胞生长概况3.3.细胞形态变化细胞形态变化4.4.微生物污染微生物污染37常规观察常规观察培养液培养液n 颜色颜色和和透明度透明度的变化的变化n 正常培养液的颜色正常培养液的颜色新鲜培养基，桃红色，新鲜培

12、养基，桃红色，pHpH为为7.2-7.47.2-7.4产生代谢产物，浅黄色，偏酸产生代谢产物，浅黄色，偏酸n 培养液很快变黄原因培养液很快变黄原因 细菌污染细菌污染 培养瓶洗刷不彻底培养瓶洗刷不彻底 接种细胞密度过大接种细胞密度过大38常规观察常规观察细胞生长增殖细胞生长增殖n潜伏期或适应期：细胞系潜伏期或适应期：细胞系24h24h以内；原以内；原代培养几天代培养几天- -几周。几周。n对数生长期：长满对数生长期：长满80%80%及时传代；培养及时传代；培养液变黄。液变黄。n平台期平台期: :细胞粗糙，细胞内颗粒状堆积细胞粗糙，细胞内颗粒状堆积物，细胞脱落。物，细胞脱落。39常规观察常规观察细

13、胞形态变化细胞形态变化生长状态良好的细胞生长状态良好的细胞透明度大透明度大折光性强折光性强轮廓不清轮廓不清有时可见到细胞分裂相有时可见到细胞分裂相40成纤维型细胞形态成纤维型细胞形态41上皮型细胞形态42常规观察常规观察微生物污染微生物污染n微生物污染一般发生在传代、微生物污染一般发生在传代、换液和加药后。在进行上述换液和加药后。在进行上述操作后操作后24244848小时要密切注小时要密切注意是否有污染发生。意是否有污染发生。43常规观察常规观察微生物污染微生物污染细菌污染：培养液浑浊、可见细菌；细菌污染：培养液浑浊、可见细菌；霉菌、真菌污染：培养液浑浊、可见菌丝；霉菌、真菌污染：培养液浑浊、

14、可见菌丝；支原体污染：培养液不浑浊，细胞生长变支原体污染：培养液不浑浊，细胞生长变缓慢、胞质内颗粒增多，有中毒表现。缓慢、胞质内颗粒增多，有中毒表现。44主要内容主要内容n 培养细胞的常规观察培养细胞的常规观察n 活细胞的观察活细胞的观察n 细胞生长状况的观察细胞生长状况的观察45活细胞的观察活细胞的观察n 相差显微镜观察相差显微镜观察46主要内容n 培养细胞的常规观察培养细胞的常规观察n 活细胞的观察活细胞的观察n 细胞生长状况的观察细胞生长状况的观察细胞计数n培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数

15、相同。n 血细胞计数板：手工计数细胞n 电子细胞计数仪：自动计数细胞计数：n1、准备计数板：用无水乙醇或95%乙醇清洁计数板及盖片，擦拭干净，将盖玻片盖在计数板上。 n2、制备单细胞悬液：保证细胞密度大于104个/ml。n3、加样：将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。不要溢出盖玻片也不能溢入两侧的玻璃槽内，不要有气泡。 n4、计数：在显微镜下，用10物镜观察计数板四角大方格中的细胞数，压线细胞只计左侧和上方的。n5、计算： 公式：细胞数/ml(4大格细胞总数/ 4)104 n注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计 算，若细胞团占10%以上，说明分散

16、不好，需重新制备细胞悬液。50细胞生长状况的观察细胞生长状况的观察n 细胞生长曲线细胞生长曲线n细胞生长曲线：以培养时间为横坐标，细胞数为纵坐标，连接成的曲线。标准的细胞生长曲线近似”S”形：滞留期、对数生长期、平台期（生长抑制）。n细胞对数生长期：在生长曲线上细胞数量增加1倍时间为细胞倍增时间，此区间即细胞对数生长期，细胞传代、试验等多应在此期间进行。52细胞生长状况的观察细胞生长状况的观察细胞分裂指数：是计算分裂细胞占全部细胞中细胞分裂指数：是计算分裂细胞占全部细胞中比列的方法，用以表示比列的方法，用以表示细胞增殖的旺盛程度。细胞增殖的旺盛程度。细胞贴壁率：适用于观察贴壁细胞，主要反映细胞

17、贴壁率：适用于观察贴壁细胞，主要反映细胞的细胞的生存能力生存能力和部分底物材料的生物相容性。和部分底物材料的生物相容性。细胞生长状况的观察细胞周期0Count 200 400 600 8001000DNA contentn研究细胞动力学、细胞的研究细胞动力学、细胞的DAN合成代谢和合成代谢和有丝分裂。每一个增值过程都要经过一个有丝分裂。每一个增值过程都要经过一个周期来进行，包括：周期来进行，包括：n有丝分裂期（有丝分裂期（M期）期）n分裂间期（生长期）：生长前期（分裂间期（生长期）：生长前期（G1)、DNA合成期（合成期（S）、生长后期（）、生长后期（G2）54细胞生长状况的观察细胞生长状况的

18、观察n 细胞周期细胞周期细胞周期和细胞群体倍增时间不同细胞周期和细胞群体倍增时间不同n倍增时间倍增时间是指在对数生长期细胞数量增加一倍所是指在对数生长期细胞数量增加一倍所需的时间。需的时间。n细胞周期细胞周期是指一个细胞的分裂生长周期时间，一是指一个细胞的分裂生长周期时间，一般情况下短于细胞倍增时间。般情况下短于细胞倍增时间。55细胞生长状况的观察细胞生长状况的观察n 细胞周期细胞周期流式细胞仪测定法流式细胞仪测定法56主要内容n 无菌操作无菌操作n 传代培养和细胞系的维持传代培养和细胞系的维持n 培养细胞生长性状的观察培养细胞生长性状的观察n 细胞冻存与细胞复苏细胞冻存与细胞复苏n 微生物污

19、染的检测与排除微生物污染的检测与排除57细胞冻存与细胞复苏n 概述概述细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化，最大限度减少污染，减少细胞生物学特性变化，最大限度的保存细胞活力。的保存细胞活力。58细胞冻存与复苏原则：慢冻快融细胞冻存与复苏原则：慢冻快融 当细胞直接降到零度以下，可引起：细胞当细胞直接降到零度以下，可引起：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶，会造成细胞膜、细胞器的

20、损伤胞内形成冰晶，会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。和破裂。n冻存细胞时要缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不冻存细胞时要缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶。致产生大的冰晶。n复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。晶的重结晶。59低温保护剂的应用低温保护剂的应用采用甘油或二甲基亚砜（采用甘油或二甲基亚砜（DMSODMSO）做保护剂。）做保护剂。常用常用DMSODMSO，一种渗透性保护剂，易穿透细胞，提高，一种渗透性保护剂，易穿透细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点。延缓冻结过程，胞膜对水的通透性，降低冰点。延

21、缓冻结过程，能使细胞内水分渗出细胞外，在胞外形成冰晶，能使细胞内水分渗出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。60细胞冻存方法细胞冻存方法1.1.预先配制冻存液：含预先配制冻存液：含20%20%血清培养基，血清培养基，10%DMSO10%DMSO，DMSODMSO液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞。液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞。2.2.取对数生长期细胞（冻存前一天换液），经胰酶消化取对数生长期细胞（冻存前一天换液），经胰酶消化后，加入适量冻存液，用吸管吹打制成细胞悬液（后，加入适量冻存液，用吸管吹打制成

22、细胞悬液（5-105-10）10106 6 个个/ml)/ml)。3.3.加入加入1-1.5ml1-1.5ml冻存细胞液于冻存管中，密封后标记冷冻冻存细胞液于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。细胞名称和冷冻日期。程序降温仪程序降温仪标准程序为：降温速率标准程序为：降温速率-1-2/min；当温度达；当温度达-25以下以下时，可增至时，可增至-5-10/min；到；到-100时，则可迅速浸入液氮中。时，则可迅速浸入液氮中。细胞冻存盒：内部充满细胞冻存盒：内部充满异丙醇，放入异丙醇，放入-70冰冰箱中，箱中，-1/min的降的降温速率冻存细胞。温速率冻存细胞。62细胞冻存一般程序细胞冻存

23、一般程序1.1.先将冻存管放入先将冻存管放入44冰箱，约冰箱，约10min10min。2.2.接着置于接着置于-20-20冰箱，约冰箱，约303060min60min。3.3.置于置于-80-80超低温冰箱中放置超低温冰箱中放置1216h1216h。4.4.置于液氮罐中长期保存。置于液氮罐中长期保存。63细胞冻存简易程序 将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降降1 122的速度，在的速度，在30-40min30-40min内降至液内

24、降至液氮表面，停氮表面，停30min30min后，直接投入液氮中。后，直接投入液氮中。液氮罐65 1. 1.取生长状态好的细胞消化制成细胞悬液取生长状态好的细胞消化制成细胞悬液2.2.离心洗涤离心洗涤3.3.加含加含10%DMSO10%DMSO的冻存液的冻存液4.4.加入冻存管加入冻存管5.5.程序降温程序降温6.-706.-70放置放置2-3h2-3h7.7.移入液氮中移入液氮中8.8.记录记录细胞冻存步骤：细胞冻存步骤：细胞复苏步骤：细胞复苏步骤：1.1.从液氮中取出冷冻管，立即放入从液氮中取出冷冻管，立即放入3737水浴水浴中，使其融化（中，使其融化（1 1分钟左右）分钟左右）2.2.消

25、毒冻存管开封后将细胞移入离心管加消毒冻存管开封后将细胞移入离心管加1010倍培养液离心洗涤倍培养液离心洗涤3.3.计数，接种培养瓶培养，次日换液计数，接种培养瓶培养，次日换液68培养细胞的运输培养细胞的运输n冷冻储存运输：干冰冷冻储存运输：干冰/ /液氮液氮n充液法充液法 选择生长良好的细胞，弃去旧培养基，补充新培养选择生长良好的细胞，弃去旧培养基，补充新培养液至培养瓶颈部，保留微量空气，瓶口用封口膜封口，液至培养瓶颈部，保留微量空气，瓶口用封口膜封口，运输。运输。 若运输时间较短（数小时），可将细胞附着面朝上，若运输时间较短（数小时），可将细胞附着面朝上，或将培养液倒尽，贴身运输。或将培养液

26、倒尽，贴身运输。69主要内容主要内容n 无菌操作无菌操作n 传代培养和细胞系的维持传代培养和细胞系的维持n 培养细胞生长性状的观察培养细胞生长性状的观察n 细胞冻存与细胞复苏细胞冻存与细胞复苏n 微生物污染的检测与排除微生物污染的检测与排除培养细胞的污染n不仅指微生物，而且包括所有混入培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物。n 包括微生物、细胞和化学物质。71微生物污染的检测微生物污染的检测n微生物污染的种类可分成细菌、真菌、病毒和支原体。微生物污染的种类可分成细菌、真菌、病毒和支原体。n无菌操作技术不当、无菌操作技术不当、 操作室环境不佳操作室环境不佳 、 污染之血清污染之血清和

27、污染之细胞等是主要的污染源和污染之细胞等是主要的污染源 。n严格之无菌操作技术严格之无菌操作技术 、清洁的环境、清洁的环境 、与品质良好之、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。 72细菌和真菌的污染和检测细菌和真菌的污染和检测肉眼直接观察法肉眼直接观察法培养检查法培养检查法显微镜观察法显微镜观察法真菌污染真菌污染培养液中形成白色或浅黄色漂浮物培养液中形成白色或浅黄色漂浮物肉眼可见，短期内培养液不混浊肉眼可见，短期内培养液不混浊镜下可见在细胞之间有综合交错穿行的丝状、管状及镜下可见在细胞之间有综合交错穿行的丝状、管状及树枝状菌丝，并悬浮

28、漂荡在培养液中，也可通过染色树枝状菌丝，并悬浮漂荡在培养液中，也可通过染色加以判断加以判断。73细胞被霉菌污染的镜检图细胞被白色念球菌污染的镜检图细胞被真菌污染的镜检图细胞污染的电镜照片细菌污染细菌污染多为大肠杆菌、白色葡萄球菌、假单胞菌等污染多为大肠杆菌、白色葡萄球菌、假单胞菌等污染污染后，培养基颜色短期变黄，出现浑浊污染后，培养基颜色短期变黄，出现浑浊镜下可见大量圆球状颗粒漂浮物，细胞生长停止并有中镜下可见大量圆球状颗粒漂浮物，细胞生长停止并有中毒表现毒表现可通过革兰染色和肉汤接种加以鉴定可通过革兰染色和肉汤接种加以鉴定多发生在接种的多发生在接种的48h48h以内以内7677支原体的污染和

29、检测支原体的污染和检测支原体高污染率的原因：支原体高污染率的原因：n支原体最小直径支原体最小直径0.20.2 m m，无细胞壁，约有，无细胞壁，约有1%1%可透可透过滤菌器过滤菌器(0.22-0.45 (0.22-0.45 m) m)；n 支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化微镜可观察到的特征变化 ；n过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式，研究人过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式，研究人员忽略污染问题。员忽略污染问题。7878 支原体的污染和检测支原体的污染和检测支原体的检测支原体的检测n相差显微镜观察法相差显微镜观察法n荧光染色

30、法荧光染色法n电镜检查电镜检查nDNADNA分子杂交检查或支原体培养分子杂交检查或支原体培养79病毒的污染和检测病毒的污染和检测细胞的直接观察细胞的直接观察动物接种检查动物接种检查电子显微镜观察电子显微镜观察免疫学检查免疫学检查PCRPCR技术技术8282微生物污染的防治微生物污染的防治抗生素抗生素加温处理加温处理动物体内接种动物体内接种巨噬细胞吞噬法巨噬细胞吞噬法n1. 什么是原代培养？简述原代培养方法的分类及主要操什么是原代培养？简述原代培养方法的分类及主要操作步骤。作步骤。 n2. 何谓传代培养？简述贴壁细胞的传代操作步骤。何谓传代培养？简述贴壁细胞的传代操作步骤。n4. 什么是冷冻保存

31、？影响细胞冷冻保存效果的因素有哪什么是冷冻保存？影响细胞冷冻保存效果的因素有哪些？些？n5. 冻存的细胞一般如何复苏？冻存的细胞一般如何复苏？n6. DMSO使用时应注意哪些事项？使用时应注意哪些事项？ n7.运送细胞的比较简便的方法是哪一种，简述其过程。运送细胞的比较简便的方法是哪一种，简述其过程。 n8. 简述细胞污染的概念及种类简述细胞污染的概念及种类.n9. 细胞培养中常见有哪些微生物污染，有何主要特征？细胞培养中常见有哪些微生物污染，有何主要特征？ n10. 细胞计数的操作要领及计算公式是什么？细胞计数的操作要领及计算公式是什么？正常组织细胞的培正常组织细胞的培养养 正常组织细胞的培

32、养正常组织细胞的培养 n表皮细胞表皮细胞在人和动物体内，表皮细胞生长在胶原基质膜在人和动物体内，表皮细胞生长在胶原基质膜上，并从基质膜获取生长分化所需要的物质，上，并从基质膜获取生长分化所需要的物质，因此体外培养培养需要使用某些基质、培养液因此体外培养培养需要使用某些基质、培养液及包括滋养层在内的一些添加物。及包括滋养层在内的一些添加物。几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例无菌切取皮肤标本，用无菌切取皮肤标本，用DBSSDBSS冲洗冲洗3 35 5遍。遍。将标本的上皮层面朝下放入干燥的培养皿中，加将标本的上皮层面朝下放入干燥的培养皿中，加数滴数滴PBSPBS使之湿润，用弯剪尽可能除净皮下脂

33、肪使之湿润，用弯剪尽可能除净皮下脂肪和结缔组织，将标本切成大约和结缔组织，将标本切成大约1cmX2cm1cmX2cm的小块。的小块。用无用无Ca2+Ca2+、Mg2Mg2+ +的的PBS PBS 冲洗标本至少冲洗标本至少3 3次，将标次，将标本放入胰蛋白酶溶液中或中性分散酶本放入胰蛋白酶溶液中或中性分散酶IIII中，中，44放置放置15-48h15-48h，或，或37 1-3h37 1-3h。几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例表皮层和真皮层分离时表皮层和真皮层分离时,表皮层为棕色，真皮层表皮层为棕色，真皮层为白色，观察到表皮与真皮分离时将其移入到为

34、白色，观察到表皮与真皮分离时将其移入到另一另一10cm塑料平皿，真皮向下，用塑料平皿，真皮向下，用5ml血清完血清完全培养液冲洗，用弯镊轻轻将表皮剥脱，放入全培养液冲洗，用弯镊轻轻将表皮剥脱，放入含含20ml培养液的培养液的50ml离心管中，反复吹打，离心管中，反复吹打，过过100目尼龙筛，使角化上皮细胞分离。目尼龙筛，使角化上皮细胞分离。n滋养层细胞制备滋养层细胞制备在已形成单层的在已形成单层的3T33T3细胞培养瓶中加入丝裂霉细胞培养瓶中加入丝裂霉素，使素，使3T33T3细胞不在分裂增殖，即可作为表皮细胞不在分裂增殖，即可作为表皮细胞的黏附滋养细胞。细胞的黏附滋养细胞。n黏壁剂包被黏壁剂包

35、被用用0.01%0.01%的胶原蛋白铺于培养瓶的底部，过夜，的胶原蛋白铺于培养瓶的底部，过夜，弃上清，弃上清，4040烘干，制成胶原蛋白黏附膜，紫烘干，制成胶原蛋白黏附膜，紫外线照射外线照射2h2h消毒备用。消毒备用。几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例90几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例n 脐静脉血管内皮细胞脐静脉血管内皮细胞取健康产妇分娩正常新生儿后取健康产妇分娩正常新生儿后6 6小时以内的脐小时以内的脐带，立即浸泡在含青霉素、链霉素的带，立即浸泡在含青霉素、链霉素的D-HanksD-Hanks液中，洗去外部血污。在超静工作台上剪去液中，洗去外部血污。在超静工作台上剪去有钳子夹

36、痕、扭曲、凝血块、穿孔段后分离有钳子夹痕、扭曲、凝血块、穿孔段后分离出出10-1510-15厘米一段。厘米一段。91几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例n 脐静脉血管内皮细胞脐静脉血管内皮细胞用注射器吸取用注射器吸取 HanksHanks液，充分清洗脐静脉，液，充分清洗脐静脉，用血管钳夹紧脐带一端，从另一端向脐静脉用血管钳夹紧脐带一端，从另一端向脐静脉管腔内缓慢注入管腔内缓慢注入0.10.1I I型胶原酶型胶原酶8-10ml8-10ml，静，静脉充盈后，用另一只血管钳夹住防胶原酶返脉充盈后，用另一只血管钳夹住防胶原酶返流。置入流。置入3737培养箱内消化培养箱内消化1010分钟。分钟。n以

37、以1 15X105X105 5个细胞的密度接种在适量个细胞的密度接种在适量DMEMDMEM或或FADFAD培培养液中，养液中，3737培养培养1-31-3天，细胞贴壁后，冲洗未贴天，细胞贴壁后，冲洗未贴壁细胞。壁细胞。n传代培养：传代培养：0.05%-0.1%0.05%-0.1%的的EDTAEDTA孵育孵育10-30min10-30min，细，细胞变圆后，在用胞变圆后，在用0.1%0.1%的胰蛋白酶和的胰蛋白酶和0.05%EDTA0.05%EDTA消化，消化，吸管吹打是细胞完全脱壁。吸管吹打是细胞完全脱壁。几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例93几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例n

38、脐静脉血管内皮细胞脐静脉血管内皮细胞松开一端血管钳，将含有内皮细胞的消化液松开一端血管钳，将含有内皮细胞的消化液收集到离心管中，然后注入含收集到离心管中，然后注入含1010胎牛血清胎牛血清的的RPMI1640RPMI1640培基终止消化并冲洗血管，以便培基终止消化并冲洗血管，以便获取更多的内皮细胞。获取更多的内皮细胞。94几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例n 脐静脉血管内皮细胞脐静脉血管内皮细胞将冲洗液一并注入离心管，以将冲洗液一并注入离心管，以1000 rpm1000 rpm离心离心 l0l0分钟，弃上清液，加分钟，弃上清液，加RPMI 1640RPMI 1640培养液，接培养液，接种

39、于种于50ml50ml一次性塑料培养瓶中，置一次性塑料培养瓶中，置3737培养箱培养箱内，在内，在5 5C0C02 2 24 24小时后换液一次，除去红细小时后换液一次，除去红细胞和未贴壁的细胞继续培养，隔两天换液一次。胞和未贴壁的细胞继续培养，隔两天换液一次。95几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例n 脐静脉血管内皮细胞脐静脉血管内皮细胞96几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例n 脐静脉血管内皮细胞脐静脉血管内皮细胞97几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例n 人滑膜细胞人滑膜细胞将手术取下的新鲜的滑膜组织置于无菌的平将手术取下的新鲜的滑膜组织置于无菌的平皿中，剔除脂肪组织，用含青

40、、链霉素的皿中，剔除脂肪组织，用含青、链霉素的D-D-HanksHanks洗涤两次，用眼科剪将滑膜组织充分剪洗涤两次，用眼科剪将滑膜组织充分剪碎，吸入螺口管中，碎，吸入螺口管中，1200rpm/min1200rpm/min，离心，离心1010分分钟。钟。98几种细胞培养方法举例几种细胞培养方法举例n 人滑膜细胞人滑膜细胞 离心后，弃上清，加入一倍体积的离心后，弃上清，加入一倍体积的0.40.4IIII型胶原酶，置于型胶原酶，置于37 537 5CO2CO2培养箱中消化培养箱中消化6060分钟（每分钟（每1515分钟吹打一次）。初次消化后，分钟吹打一次）。初次消化后，离心弃上清，再加入一倍体积的离心弃上清，再加入一倍体积的0.250.25胰蛋胰蛋白酶继续消化白酶继续消化3030分钟。最后加入含分钟。最后加入含1515血清血清的的RPMI1640RP