核酸分离和纯化

1、1 2找答案？找答案？核酸分离纯化的原则是什么？为防止核酸降解需要注意什么？核酸制备基本步骤？如何鉴定核酸浓度和纯度？核酸的保存方法有哪些？3前言前言 核酸核酸（nucleic acid）是以核苷酸为基本组成单位的生物信息大分子。是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。4核酸的分类：核酸的分类： DNA 核内染色体 DNA。 核外也有少量DNA，如线粒体DNA，叶绿体DNA。 质粒DNA。 RNA 存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等。 除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。5主要内容主要内容2. 核酸制备的基本步骤3. 核

2、酸的鉴定和保存4. 核酸提取方法简介61. 1. 核酸分离与纯化的原则及要求核酸分离与纯化的原则及要求1.1 1.1 核酸分离与纯化的一般原则核酸分离与纯化的一般原则(1) 保持核酸分子一级结构的完整性，是核酸结构和功能研究的最基本要求。 (2) 排除其他分子的污染，保证核酸的纯度。71.2 核酸分离与纯化的要求(1) 为保证核酸的完整性，（防止降解），在实验中应注意： 尽量简化步骤，缩短提取时间，减少各种有害因素对核酸的破坏。 减少化学因素对核酸的降解，pH5-9。化学因素？化学因素？生物因素？生物因素？物理因素？物理因素？8 防止核酸的生物降解（细胞内或外的各种核酸酶水解）。 所用器械和一

3、些试剂需高压灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。操作温度为04。lDNA酶需要金属离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金属离子螯合剂，如EDTA或柠檬酸盐等；阴离子表面活性剂SDS。lRNA酶分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸碱、不易失活，生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素。0.1%DEPC（焦碳酸二乙酯 ）浸泡，器械180干烤8h。9 减少物理因素对核酸的降解，主要是机械剪切力，其次是高温。l 机械剪切力包括强力高速的振荡、突然暴露于低渗液、样品反复冻融等。l 高温，如长时间的煮沸。10(2) 核酸纯度的要求： 非核酸生物大分子的污染降低到最低程度，如蛋白质、多糖和脂类分子；

4、排除其它核酸分子的污染，如制备RNA时，DNA分子是污染物； 去除对后续实验有影响的物质，如有机溶剂和过高浓度的金属离子。112. 核酸制备的基本步骤I. I.材料准备材料准备II.II.破碎细胞或包膜内容物释放破碎细胞或包膜内容物释放III.III.核酸分离核酸分离IV.IV.沉淀或吸附核酸，纯化并去除杂质沉淀或吸附核酸，纯化并去除杂质 V.V.核酸溶解在适量缓冲液或水中核酸溶解在适量缓冲液或水中122.1 破碎细胞 (1)(1)玻璃匀浆器匀玻璃匀浆器匀浆浆(2)(2)液氮研磨法液氮研磨法n多用于坚硬植物材料，研磨时常加入少量石英砂，玻璃粉或其他研磨剂，以提高研磨效果肝、肾等肝、肾等 冰上冰

5、上 少量少量13(3)(3)高速组织捣碎机捣碎高速组织捣碎机捣碎(4)(4)超声波处理法超声波处理法(5)(5)化学处理法化学处理法(SDS(SDS、吐温、吐温8080（油酸酯）等）（油酸酯）等）(6)(6)生化法（溶菌酶、纤维素酶等）生化法（溶菌酶、纤维素酶等）142.2 2.2 核酸分离，去除蛋白核酸分离，去除蛋白 核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力( (核酸与碱性蛋白的结合核酸与碱性蛋白的结合) )、氢键和非极性的范、氢键和非极性的范德华力。德华力。 分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核

6、酸降解。白质分开，同时避免核酸降解。15（1）加入加入SDS SDS SDS除有破膜和抑制核酸酶的作用外，还具除有破膜和抑制核酸酶的作用外，还具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；（2） 加入浓盐溶液（如加入浓盐溶液（如NaCl） 核酸核酸- -蛋白质加入蛋白质加入NaClNaCl后，破坏静电吸力，后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚；使氢键破坏，核蛋白解聚；16（3）酚）酚/氯仿抽提氯仿抽提p酚氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有酚氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。抑制作用。p氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水

7、相氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。中的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。p在酚在酚/ /氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和为防止起泡和促使水相与有机相的分离促使水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（，再加上一定量的异戊醇（酚：酚：氯：异戊醇氯：异戊醇=25=25：2424：1 1）。）。17 (1(1）使用注意）使用注意 酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，表明其中含有酚酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等

8、。的氧化产物，例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验变色的酚不能用于核酸抽提实验，因为氧化物可，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。破坏核酸的磷酸二酯键。 (2(2）安全操作）安全操作 酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手套戴手套。使用酚时应注意182.3 沉淀核酸 重新调整核酸的浓度，起到重新调整核酸的浓度，起到浓缩核酸浓缩核酸的作用；的作用； 去除去除溶液中某些盐离子与溶液中某些盐离子与杂质杂质； 改变核酸的溶解缓冲液。改变核酸的溶解缓冲液。DNA纯化柱核酸提取（离心柱型）核酸提取（离心柱型）利用硅胶膜特异利用硅胶膜特异吸附核酸吸附核

9、酸19Na+Mg2+Li+2.3.1 核酸的有机溶液沉淀法 当核酸溶液的pH值大于4时，核酸分子呈多聚阴离子状态。 钾、钠、镁、锂及铵根等钾、钠、镁、锂及铵根等阳离子形成阳离子形成的盐的盐，通过屏蔽带，通过屏蔽带负电的磷酸基团负电的磷酸基团使使DNADNA分子聚结在一起而不溶于许多有机溶剂分子聚结在一起而不溶于许多有机溶剂。启示什么？启示什么？20 核酸沉淀的盐类及浓度盐盐贮存液浓度（贮存液浓度（mol/L)终浓度终浓度(mol/L)MgCl210.01NaAc3 (pH5.2)0.3KAc3 (pH5.2)0.3NH4Ac102.5NaCl50.2LiCl80.821乙醇乙醇优点：优点： 对

10、盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易挥发除去，不影响以后实验。易挥发除去，不影响以后实验。缺点：缺点： 需要量大，一般要求低温操作。需要量大，一般要求低温操作。常用的有机沉淀剂22异丙醇异丙醇 优点：优点： 需体积小，需体积小，速度快速度快，适于浓度低、体积大的，适于浓度低、体积大的DNADNA样品沉淀。一般不需低温长时间样品沉淀。一般不需低温长时间放置。放置。 缺点：缺点： 易使盐类、蔗糖与易使盐类、蔗糖与DNADNA共沉淀异丙醇难以挥发除去。所以，共沉淀异丙醇难以挥发除去。所以，最后用最后用7070乙醇乙醇漂洗数次漂洗数次。23聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）

11、优点：优点： 可用不同浓度的可用不同浓度的PEGPEG选择沉淀不同相对分子质量选择沉淀不同相对分子质量的的DNADNA片段片段。应用。应用60006000相对分子质量的相对分子质量的PEGPEG进行进行DNADNA沉淀时，使用浓度与沉淀时，使用浓度与DNADNA片段的大小成反比。片段的大小成反比。注意：注意： PEGPEG沉淀一般需加沉淀一般需加0.5mol/L0.5mol/L的的NaClNaCl或或10 mmol/L10 mmol/L的的MgClMgCl2 2。24精胺精胺 精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀DNADNA。 原理是：原理是： 精胺与精胺与DN

12、ADNA结合后，使结合后，使DNADNA在溶液中结构凝在溶液中结构凝缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质杂缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质杂质与质与DNADNA分开，达到纯化分开，达到纯化DNADNA的目的。的目的。25 2.3.2 2.3.2 核酸沉淀的温度和时间核酸沉淀的温度和时间 一般强调，核酸沉淀一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进在低温长时间下进行行。但时间过长，易导致盐与。但时间过长，易导致盐与DNADNA共沉淀，共沉淀，影响以后的实验。一般使用影响以后的实验。一般使用00冰水，冰水，10-10-15min15min， DNADNA样品足可达到实验要求。样品足可达到实验要求。26

13、3. 3. 核酸的浓度和纯度的测定核酸的浓度和纯度的测定 3.1 3.1 紫外分光光度法鉴定核酸紫外分光光度法鉴定核酸 3.2 3.2 荧光光度法鉴定核酸荧光光度法鉴定核酸273.1 3.1 紫外分光光度法鉴定核酸紫外分光光度法鉴定核酸 3.1.1 3.1.1 紫外分光光度法测紫外分光光度法测DNADNA和和RNARNA的含量的含量 前提：前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、琼脂糖及其他核酸污染。核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应大测定浓度应大于于0.25 g/ml 。结论：结论：在在波长波长260nm260nm紫外光下，紫外光下，1 OD1 OD值的吸光度

14、相值的吸光度相当于双链当于双链DNADNA浓度为浓度为50 g/ml50 g/ml；单链；单链DNADNA为为37 37 g/mlg/ml；RNARNA为为40 ug/ml40 ug/ml。28紫外分光光度计测定核酸浓度紫外分光光度计测定核酸浓度的操作步骤的操作步骤a a分光光度计分光光度计先用一定量的水校正零点先用一定量的水校正零点。b b吸取一定量的吸取一定量的DNADNA样品或样品或RNARNA样品，加入到盛有一定体积水的石英比色杯中。样品，加入到盛有一定体积水的石英比色杯中。29c c测定待测样品在测定待测样品在230nm230nm、260nm260nm和和280nm280nm的的OD

15、OD值值d d计算浓度。计算浓度。 双链双链DNADNA样品浓度样品浓度(g/l) = OD(g/l) = OD260260核酸稀释倍数核酸稀释倍数 50/1000 50/1000； RNARNA样品样品浓度浓度(g/l) = OD(g/l) = OD260260核酸稀释倍数核酸稀释倍数40/100040/1000。e e分析纯度。分析纯度。核酸定量仪可直接获得浓度，不用计算。小分子杂质小分子杂质核酸核酸蛋白质蛋白质30核酸的紫外吸收光谱核酸的紫外吸收光谱超微量核酸定量仪更加方便31A：测测DNA： 纯的纯的DNA样品样品OD260/OD280=1.8 （1.71.9） OD260/OD230

16、2.01) OD260/OD2801.9, RNA污染。污染。2) OD260/OD2801.6，存在蛋白质或酚污染；，存在蛋白质或酚污染；3) OD260/OD2302.02.01 1）ODOD260260/OD/OD280280比值太小，蛋白质或酚的污染；比值太小，蛋白质或酚的污染；2 2）ODOD260260/OD/OD2802802.02.0，可能被异硫氰酸胍等污染；，可能被异硫氰酸胍等污染；3 3）ODOD260260/OD/OD2302302.02.0，表明有小分子及盐存在。，表明有小分子及盐存在。333.2 3.2 荧光光度法鉴定核酸荧光光度法鉴定核酸 3.2.13.2.1 测定

17、核酸含量：测定核酸含量：原理：原理：DNADNA、RNARNA在荧光染料溴乙锭在荧光染料溴乙锭(EB)(EB)嵌入碱基平面之间后，嵌入碱基平面之间后，DNADNA、RNARNA样品在紫外光激发样品在紫外光激发下，可发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。使用一系列已知的不同浓度下，可发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。使用一系列已知的不同浓度DNADNA溶液溶液作标准对照，可比较出被测作标准对照，可比较出被测DNADNA溶液浓度。溶液浓度。 注意：注意：此法的比较主要基于目测，是估计水平。此法的比较主要基于目测，是估计水平。常用的荧光染料还有:golden view, gel red, s

18、ybr green343.2.2 3.2.2 荧光光度法鉴定核酸纯度荧光光度法鉴定核酸纯度原理：原理：溴化乙锭溴化乙锭(EB)(EB)等荧光染料示踪的核酸等荧光染料示踪的核酸电泳电泳结果。结果。基因组DNARNA35核酸鉴定实际常用操作程核酸鉴定实际常用操作程序序核酸定量仪测定浓度，核酸定量仪测定浓度，OD260/OD280及及OD260/OD230比值。比值。琼脂糖电泳，琼脂糖电泳，UV下观察下观察验证纯度及判断是否降解验证纯度及判断是否降解36(1) (1) 对对DNADNA DNADNA样品溶于样品溶于pH8.0pH8.0的的TETE，4 4 或或-20 -20 保存保存； 长期保存样品

19、中可加入长期保存样品中可加入1 1滴氯仿。滴氯仿。(2) (2) 对对RNARNA RNA RNA样品溶于样品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)0.3 mol/L NaAc (pH5.2) 可以沉淀形式贮于乙醇，可在可以沉淀形式贮于乙醇，可在-20 -20 中长期保存中长期保存; ; 最常用无最常用无RNaseRNase水或高压后的水或高压后的DEPCDEPC水溶解水溶解RNARNA，冻贮，冻贮于于-70-80 。3.3 3.3 核酸的保存核酸的保存TE：Tris-Cl, EDTA374 4、核酸提取方法简单介绍、核酸提取方法简单介绍4.1 基因组基因组DNA的提取方法的提取方法

20、4.2 质粒的提取和纯化质粒的提取和纯化4.3 Trizol法提取总法提取总RNA384.1 基因组DNA的提取方法4.1.1 酚抽提法酚抽提法以含以含EDTA、SDS及及RNase的的裂解缓冲液裂解细胞，裂解缓冲液裂解细胞，经经蛋白酶蛋白酶K处理后，用处理后，用pH8.0的的Tris饱和酚饱和酚抽提。抽提。（DNA）39原理： 在正常情况下，核酸表面覆盖了一层由水分子组成的亲水薄膜，以维持其水溶性。高浓度盐离子的加入破坏了核酸表面亲水薄膜的相对有序排列，形成了疏水环境。在此环境中，核酸与硅胶膜能有效结合，而蛋白质、代谢产物和其他污染物则不能结合。特点： 不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙

21、醇沉淀等步骤。 快速，简捷。4.1.2 基因组基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）提取试剂盒（离心柱型）常用的试剂盒：Qiagen40 甲酰胺解聚法：细胞裂解步骤与酚抽提法一致，但以高浓度甲酰胺裂解液裂解DNA与蛋白质复合体，再以透析除去杂质 玻璃棒缠绕法：将基因组DNA沉淀缠绕于带钩玻璃棒上带出，溶于pH8.0的TE 异丙醇沉淀法 玻璃珠吸附法4.1.3 其他的基因组其他的基因组DNA提取方法提取方法41裂解液裂解液+蛋白酶蛋白酶K裂解细胞裂解细胞缓冲液缓冲液GB+乙醇乙醇DNA柱子吸附柱子吸附缓冲液缓冲液GD去除蛋白去除蛋白漂洗液漂洗液漂洗漂洗DNA两次两次洗脱液洗脱液TE洗脱洗脱DNA离心

22、柱型离心柱型基因组基因组DNA提取步骤提取步骤42 透析，沉淀，电泳，选择性沉淀4.1.4 DNA4.1.4 DNA样品的进一步纯化样品的进一步纯化4.1.5 DNA4.1.5 DNA片段的回收片段的回收n原则：提高回收率，去除杂质污染原则：提高回收率，去除杂质污染n从琼脂糖凝胶中回收：从琼脂糖凝胶中回收： DEAE纤维素膜插片电泳法，纤维素膜插片电泳法， 电泳洗脱法电泳洗脱法 冷冻挤压法冷冻挤压法n从聚丙烯酰胺凝胶中回收：压碎与浸泡从聚丙烯酰胺凝胶中回收：压碎与浸泡434.2 4.2 质粒的提取和纯化质粒的提取和纯化 质粒的结构：超螺旋，半开环，线性DNA 理化性质：与一般核酸相似，但抗切割

23、和抗变性能力更强 所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤： 培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA，根据实验所需)。 选择哪一种方法主要取决于以下几个因素：质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于纯化的技术和实验要求。444.2.1 4.2.1 质粒提取原理质粒提取原理454.2.2 4.2.2 质粒质粒DNADNA的纯化与回收的纯化与回收 纯化 CsCl-EB法 聚乙二醇沉淀法 柱层析法 回收：与基因组DNA类似464.3 RNA4.3 RNA的分离和纯化的分离和纯化 RNARNA易被RNaseRNase水解，RNaseRNase除细胞内还广泛存在于人的

24、皮肤、唾液、汗液及周围的环境中 RNaseRNase分子结构中的二硫键使其生物学活性非常稳定 排除RNaseRNase的污染是RNARNA制备成功与否的关键474.3.1 RNA4.3.1 RNA制备的条件与环境制备的条件与环境 洁净的实验室 操作人员带口罩，勤换手套 玻璃器皿（如匀浆器）、镊子180干烤8 h或更长时间 枪头、EP管0.1%DEPC水浸泡过夜，再高压；或直接购买无RNase的枪头和EP管 冰上匀浆，4 离心48 Trizol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性。 Trizol中还

25、加入了8羟基喹啉、异硫氰酸胍、-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。4.3.2 Trizol法提取总RNA49Trizol法提取总RNA步骤Chloroform 首选首选Invitrogen50Trizol法提取RNA步骤1、每50-100mg 组织加入1ml Trizol ，用匀浆器匀浆处理 ，室温放置5min，使其充分裂解。 12,000rpm 离心5min，弃沉淀。2、加入氯仿200微升每管，剧烈振荡15s ，室温放置2-3 min 。 12000g ,4 ，离心15 min 3、吸取上层水相(约400微升），至另一离心管中。注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白

26、质，则保留下层酚相存于4冰箱,若只提RNA，则弃下层酚相。4、每使用1ml Trizol 加入0.5 ml 异丙醇，室温10min 。 12000g ，4 ，10 min ,弃上清， RNA沉于管底。5、加入1 mL75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。 12000g ,4 ,5min 。，尽量弃上清。6、室温晾干或真空干燥5-10min。加入20微升无RNase 水溶解RNA 沉淀。51 除血红蛋白及某些组蛋白外，绝大多数mRNA在其3末端带有1个长短不一的多聚核苷酸的结构，即poly（A）尾巴 olig（dT）-纤维素柱层析法 olig（dT）-纤维素液相结合离心法 其他方法：磁珠法 生物

27、素标记的oligo（dT）结合poly（A）尾，再结合亲和素标记的磁珠4.3.3 mRNA的分离和纯化52核酸的分类：核酸的分类： DNA 核内染色体 DNA。 核外也有少量DNA，如线粒体DNA，叶绿体DNA。 质粒DNA。 RNA 存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等。 除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。532. 核酸制备的基本步骤I. I.材料准备材料准备II.II.破碎细胞或包膜内容物释放破碎细胞或包膜内容物释放III.III.核酸分离核酸分离IV.IV.沉淀或吸附核酸，纯化并去除杂质沉淀或吸附核酸，纯化并去除杂质

28、 V.V.核酸溶解在适量缓冲液或水中核酸溶解在适量缓冲液或水中54异丙醇异丙醇 优点：优点： 需体积小，需体积小，速度快速度快，适于浓度低、体积大的，适于浓度低、体积大的DNADNA样品沉淀。一般不需低温长时间样品沉淀。一般不需低温长时间放置。放置。 缺点：缺点： 易使盐类、蔗糖与易使盐类、蔗糖与DNADNA共沉淀异丙醇难以挥发除去。所以，共沉淀异丙醇难以挥发除去。所以，最后用最后用7070乙醇乙醇漂洗数次漂洗数次。55精胺精胺 精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀DNADNA。 原理是：原理是： 精胺与精胺与DNADNA结合后，使结合后，使DNADNA在溶液中结构凝在溶液中结构凝缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质杂缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质杂质