剪接因子PSF是一个大的复合体的一部分

1、剪接因子PSF是一个大的复合体的一部分，这个大的复合体是在前mRNA缺失的情况下组装成的，它包含了所有的五种snRNPs（PCC复合体能在缺失pre-mRNA的情况下形成，含有PS桥口snRNPs）ABSTRACTPSF（polypyrimidinetractbindingprotein-associatedsplicingfactor,PSF蛋白是一种多功能的DNA/RNA结合蛋白，它能抑制原癌基因的表达，在人和小鼠中具有抑制肿瘤的作用）蛋白是一个很大的核蛋白，参与了包括转录、RNA剪接等众多生理过程。PSF白被证实能直接与U5snRNA结合并且在许多被纯化了的剪接复合体中被发现。在这篇文章

2、中，作者展示了当hela细胞核提取物处于适于剪接的条件下时，PSF蛋白被发现作为一个很大的复合体的一部分，这个复合体包含了五种snRNPs和大部分已知的剪接因子。在4c下，不需要添加外源的pre-RNA该复合物就能形成，并且对盐离子敏感。沉降实验和通过质谱鉴定单独的组分揭示了该复合体附着有许多核内的因子，这些作用因子与剪接体组分重叠。INTRODUCTION大多数真核生物的基因都能被转录成pre-mRNA,pre-mRNA中含有被间隔序列（内含子）隔断的编码序列（外显子）。pre-mRNA的剪接过程就是在翻译之前，含子被有效且准确的切除，而外显子被连接起来。剪接过程包括两次连续的转酯反应。第一

3、步转酯反应包括5'端剪接位点的断裂，产生一个与3'端内含子相连的套马索中间体。第二步反应中外显子被链接，内含子套马索被释放。剪接过程的执行需要剪接复合体，剪接复合体是一个由小核糖核蛋白颗粒（包括U1,U2,U4/U6和U5snRNAs及其他的非snRNP蛋白因子）组成的庞大复合体。snRNAs在剪接体的组装和两步转酯反应中发挥重要作用。外显子/内含子定界的准确性需要pre-mRNA、snRNAs和其他剪接因子之间的相互作用来实现0根据现有的细胞提取和体外剪接的研究，大多数现有的剪接体组装的模型都表明一条明确的途径，即需要ATP和pre-mRNA底物。剪接复合物的形成起始于U1s

4、nRNP识别5'剪接位点，然后U2snRNP辅助因子（U2AF）异质二聚物结合聚喀噬区，由此形成独立元件早期复合体（Ecomplex）。U2AF结合聚喀噬区能招募U2snRNP结合于分支点序列并形成Acomplex,当U4/U6、U5三snRNP加入进来，Acomplex转变为Bcomplex。伴随着一系列动态的RNA/蛋白重新排列，Bcomplex转变为Ccomplex,Ccomplex是一个短寿命的有活性的剪接体。每种独立的剪接复合体都经过不同的策略来纯化和分析。这些复合体都含有大量的snRNP和非snRNPC蛋白，这些组分参与了剪接位点的识别、剪接体的组装和调控剪接过程。近年来，

5、对一些复合体的鉴定研究似乎与之前关于剪接复合体的形成相悖。这些复合体包括酵母Cwf/Cwc复合体、lnRNP复合体、一个大于150S的包含U2/U4/U5/U6的复合体，能与U2和U6配对、从啤酒发酵的酵母菌中提取的五snRNP、从Hela细胞核提取的五snRNP复合物。这些复合物间功能上的联系还需要进一步的研究，但是已经知道的是他们中的任何一种都不能单独地发挥剪接作用。PSF蛋白大小为100kDa,PSF白在剪接过程的许多步骤中都发挥作用，但是其确切作用还有待研究。PSF白能在剪接复合体的早期（H、A、B）、晚期（C）、U4/U6.U5三snRNP和U5snRNP中一起纯化出来，并且在核散斑

6、中被发现，与许多剪接因子定位在一起。PSF®白的由一个N端富含甘氨酸的区域，一个富含脯氨酸/谷氨酰胺（P/Q）的区域，两个RNA识别基序（RRMs）和C端的两个细胞核定位信号组成。p54nrb蛋白（鼠同源蛋白）与PSF白有十分相似的结构域并且能够结合PSF®白。PSF和p54nrb的结合能与RNA聚合酶II的C端结构域（CTD）相互作用，然后与转录/剪接复合体结合5'剪接位点，接着继续进行转录和剪接。除了参与剪接过程，PSF®白还参与了众多的细胞核内事件。PSF蛋白在许多情况下能作为转录调控因子，例如在调控生长因子来刺激基因表达，又可以作为共抑制因子通过S

7、in3A招募脱乙酰基酶（HDACs）然后诱导沉默，还能在cAMP的刺激下作为复合体的一部分激活人CYP17基因的启动子。PSF®白还能调控拓扑异构酶I的活性，或者作为间断的双链DNA修复因子，或者在细胞核中保留超编辑的RNA。最近的研究表明，PSF白能抑制HIV-1gag/pol和envmRNAs的表达（典型的逆转录病毒的基因组的RNA基因组长度约为7000-10000个核昔酸，携带三个基因：gap（groupassociatedantigen）,pol和env。gag基因编码病毒颗粒内的核心蛋白），包括基质、衣壳三个蛋白。pol基因编码蛋白酶、整合酶和逆转录酶。env基因编码被摸蛋

8、白，病毒RNA经拼接翻译成一条多肽链，经蛋白酶切割后成2个蛋白，即表面蛋白和跨膜蛋白），通过顺式激活不稳定性原件（INS）来靶向降解。在之前的研究中，作者已经揭示了PSF®白和P54nrb与U5snRNA的相互作用。通过PSF寺异的抗体进行免疫共沉淀实验（IP）来进一步分析这种相互作用，在这篇文章中，作者提取了Hela细胞处于剪接状态细胞核提取物并进行了五种UsnRNPs与PSF蛋白的co-IP实验（不考虑额外的pre-mRNA）。作者该状态的细胞核提取物在体外进行了沉淀分析实验，通过这个实验确定了在剪接过程中会形成一个包含PSF蛋白和多种sn-RNP的大型复合体。在这些复合物中，最

9、大的复合体表现出非特异性的结合，然而作者分离出来一个稍小的包含PSFS白的复合体（PSF-containingcomplex,PCC）,该复合体包含五种snRNPs而且其沉淀后的体积与成熟的剪接复合体十分相似。有趣的是该复合体在4c形成并且其组装不需要外源的pre-mRNA,这表明形成该复合物很可能不需要ATP。通过质谱分析分析有/无pre-mRNA组装成的该复合体，揭示了该复合体组分中有十分相似的蛋白，但通过对剪接状态的细胞核提取物进行IP实验都没有检测到这些蛋白。作者的结果表明在哺乳动物细胞中大型预先形成的剪接复合体的存在。MATERIALSANDMETHODS体外转录与剪接体外转录剪接和

10、剪接实验和之前报道的一致。对衍生自腺病毒的剪接底物RNA(AdML)用BamHI切割得到线状的RNA,然后用T7RNA连接酶转录得到正义链，用EcoRI没切后用SP6RNA连接酶得到反义链。在30c时对Hela细胞核提取物进行体外剪接反应，在细胞核提取物的最后一步用BufferD透析(20mMTris,pH8,100mMKCl,0.2mMEDTA,0.5mMDTT,20%glycerol)。剪接条件是将提取物用12mMTris-HCl,pH7.9,60mMKCl,0.12mMEDTA,0.5mMATP,20mM磷酸肌酸,2mMMgCl2,and0.5mMDTT处理，区别是一组加入了5-10ng

11、的pre-mRNA底物。剪接产物用15%的尿素(8M尿素)PAGE胶鉴定。剪接复合体在不同时间点的形成用4%native胶(不加SDS、疏基乙醇等变性剂，使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷)检测。PCC的形成Hela细胞核提取物用12mMTris-HCl,pH7.9,60mMKCl,0.12mMEDTA,0.5mMATP,20mM磷酸肌酸，2mMMgCl2,and0.5mMDTT处理为剪接条件，添加或不添加体外转录的pre-mRNA,然后在冰上或者30c孵育0-15分钟。从Hela细胞核提取物中去除外源性的Poly(A)RNA300加fiHela细胞核提取物用buffer500(2

12、0mMTris-HCl,pH7.9,500mMKCl,0.2mMEDTA,0.5mMDTT,and1mMPMSF)处理，在30C下与10mgoligo-dT纤维素柱孵育30分钟。反应后的溶液进行离心，取上清液在4c用bufferD(20mMTris-HCl,pH7.9,100mMKCl,0.2mMEDTA,0.5mMDTT,5%甘油)透析2小时。IP抗SPR禺联蛋白ASepharose如参考文献所述处理。30d的Hela细胞核提取物(约150g)处理成适于剪接状态形成PCC,作为对照，30d的核提取物在用bufferD透析时用bufferD稀释来维持相同的蛋白浓度。孵育过后，用50小IPbuf

13、fer(60%BufferD包含1mMPMSF和0.01%NP40)稀释，4c摇床摇30分钟后最大转速离心30秒，去除沉淀。接着用200d的IPbuffer进一步稀释，加入25d的抗PSH禺联蛋白ASepharose于4c下孵育1小时。孵育过后用低盐的washbuffer（20mMTris-HCl,pH7.9,100mMKCl,0.2mMEDTA,and0.005%NP-40）或者高盐的washbuffer（20mMTris-HCl,pH7.9,250mMKCl,0.2mMEDTA,and0.005%NP-40）洗三次。IP后的RNA通过石碳酸/氯仿从琼脂糖中提取出来，接着用8M15%的尿素-

14、PAGE胶分离。剪接产物和snRNAs能通过磷相仪（phosphorimager,用于在宏阵列实验中检测放射性同位素磷的放射信号强度的实验设备）和银染的方法各自观察到。当用质谱分析大规模提纯的PCC时，90医的核提取物应用75医的抗偶联琼脂糖A（或者用等量的蛋白琼脂糖A作对为对照）进行每一步反应，IP过后的蛋白应用8M尿素-50mMTris-HCl（pH=8.0）洗脱.质谱分析用多维液相色谱和串联质谱法来确定PCC的蛋白组分的方法如参考文献所述。从串联质谱法得到的数据与美国国家生物技术信息中心的人的子集的非冗余蛋白质数据库进行比对。比对结果如参考文献所述。梯度沉淀PCC和剪接复合体适于剪接状态

15、的Hela细胞核提取物（添加/不添力口AdMLpre-mRNA）在30c孵育15分钟以形成PCCo在沉淀分析实马中，每一步200医的体积都要加10%-30%的蔗糖（或者5%-20%的甘油），这一梯度含有2mMMgCl2,0.5mMDTT,60%bufferD,1mMPMSF,5mMNaFand0.01%NP-40。在4c用54000g离心3,4或者12.5小时，收集每一分层。RNA通过石碳酸/氯仿从每一层中提取出来后通过8M15%的尿素-PAGE胶分离。剪接产物和snRNAs能通过磷相仪和银染的方法各自观察到。各组分的蛋白可以通过10%的SDS-PAGE胶分离，转移到硝酸纤维素膜上，使用抗PS

16、F的抗体或者抗U5-116的抗体检测。RESULTS在未添加外源pre-mRNA的情况下，对剪接状态的Hela细胞核提取物进行co-IP试验能得到所有的五种UsnRNPs。在之前的研究中，作者揭示了PSF和p54nrb能与U5snRNA上一个保守的茎环1b结合，当核提取物处于剪接状态时，能检测到这两种蛋白以及其他的U5特异性因子都募集到生物素标记的U5snRNAs上。当使用PSFFt异性的抗体进一步研究它与U5snRNPA的作用时，作者发现五种snRNPs都会被IP沉淀下来，U1,U2,U4,U5和U6在IP后的颗粒中有着接近的化学计量。在IP试验中所用的核提取物中含有AdMLpre-mRNA

17、。剪接底物和中间体与PSF的共沉淀能力与PSF与剪接复合体的共沉淀能力一致。出乎意料的是的当在剪接状态下不加入AdMLpre-mRNA,IP实验只能得到类似但不相同的结果。作为对照，对不在剪接状态的核提取物进行IP实验，只有U1和U2被PSFB体沉淀下来。用bufferD透析核提取物，在调整为剪接状态的过程中，要降低盐离子的浓度，添加MgCl2和ATP再生系统。在调整到剪接状态中的每一个变量，作者都进行了实验检测其作用，并发现降低盐离子的浓度是其中区别最大的一个变量。总的来说，对核提取物在体外进行剪接时，降低盐离子的浓度，不论是否添加外源的pre-mRNA,PSF®白都能与五种snR

18、NPs结合。不添加pre-mRNA就能在剪接状态的Hela细胞核提取物中形成包含PS桥口多种snRNP复合体。为了确定PSF到底是与单独的snRNP作用还是与包含五种snRNPs的复合体作用，作者进行了沉淀分析实验。作者做了两组实验，一组为Hela细胞核提取物，一组为调整为剪接状态的核提取物但不添加pre-mRNA,将他们分别在30c下孵育15分钟后用10%-30%的蔗糖梯度(54000g,3h)分离。第一组中，PS林HU5snRNP特异性蛋白U5-116位于沉淀物中的顶层，这一层只有极少或者没有与PSF结合的大于U4/U6.U5三snRNP。在第二组中，PS林口U5-116的分布发生了变化。

19、游离蛋白位于顶层，PS林口U5-116能在所有梯度中分离出来。最重的组分颗粒位于梯度的最下层，即使当转速和时间减少了也不会改变，这表明这些复合体表现出非特异性的结合，这与之前描述的复合体有类似的地方。然而，在组分6-11中，有包含了PSF勺复合体与哺乳动物中的剪接复合体有相似的大小(用ADMLpre-mRNA的最大值最为指示)。包含五种snNRPs的组分的化学计量与上面IP的结果一致。通过进一步的沉淀分析分离出了一个独特的组分，它分为四层：顶层的游离蛋白，U4/U6.U5三snRNP层，与哺乳动物剪接复合体(60S)大小接近的组分层，最底层的非特异性集合层。PCC的形成在4C。作者接下来进行了

20、IP实验进一步分析PCC复合体的形成，分别在有和没有pre-mRNA的参与下和不同的时间点。当有五种snRNPs存在时，有无pre-mRNA存在下都能形成PCC,即使是在加入了反义RNA转录本的阴性对照着。有意思的是，不论组装正在进行或者在冰上反应，所有的五种snRNPs都能被分离出来而且他们的量都与在30C孵育了5-15分钟的量相同。由于在冰上ATP水解释放的能量是最少的，这说明复合体的形成似乎很大程度上与ATP无关。在有pre-mRNA参与下的组装反应中，剪接并不影响五种snRNP的IP。剪接分析的早期显示了剪接体的形成，剪接产物的形成(mRNA和离题的套马索)超过15分钟后才能检测到。最

21、为对照，在所有时间点用PSFB体对snRNP进行IP试验的条件都相同，包括在冰上开始的时候。这表有至少有三种可能性：第一，PCC可能与剪接过程无关；第二，PCC可以代替外源的pre-mRNA;第三，PCC可能预先存在于核提取物中并且随后组装为pre-mRNA的底物。Hela细胞核提取物中去除外源Poly(A)RNAPCC的形成。为了说明外源pre-mRNA在复合物的组装中是否有作用，作者对Hela细胞核提取物用oligo-dT硝酸纤维素去除了外源的Poly(A)RNAo然后用在剪接条件下用PSFB体对核提取物中形成的PCC进行IP试验分析。如Figure5所示，去除外源pre-mRNA的提取物

22、中，所有的五种snRNP都能被IP下来，无论随后的步骤中是否加入了pre-mRNA底物。为了确定去除了pre-mRNA并没有影响剪切的活性，作者对去除和普通的核提取物进行了体外剪接实验。在去除组中，剪接的效率有轻微的降低，但用IP拉下来snRNP量与之保持一致，也略有降低。因此，去除Poly(A)RNA的核提取物并不会显著影响PCC复合体的形成，但值得注意的是处理后的提取物中会有残留的内源性pre-mRNA。在有无pre-mRNA下形成的PCC中的蛋白含量十分相似。PCC中存在五种UsnRNPs表明它可能等同于哺乳动物和酵母中提取的五snRNP复合体。与酿酒酵母中的五snRNP类似，当增加了盐

23、离子的浓度，PCC复合体也变得不稳定了。作者用IP拉下了PCC复合体并对用多维液相色谱偶联串联质谱进行分析，虽然这可能导致非特异性蛋白的结合，比较在剪接状态的两种条件下（有无pre-mRNA底物）分离得到的蛋白的组成。作为对照，没有PS啦体的样品可以确保没有非特异性的蛋白。因为PCC复合体不在标准的核提取物（非剪接状态）中形成，又在250mMKCl中解离，因此对标准状态的Hela细胞核提取物进行IP过后用高盐buffer洗脱，可以出去不相关的蛋白，虽然也会除去一些hnRNPs,PSF乍用因子，热休克蛋白，核糖体蛋白和一些在剪接过程中和RNA加工中未知功能的蛋白。与预期的一致，用了减去策略后分离

24、得到了许多单独的蛋白。如Table1所示，这些蛋白能分为七类：snRNP蛋白（UsnRNP特异性蛋白和Sm蛋白（血清粘蛋白，由粘多糖和蛋白质结合的复合蛋白）；剪接因子；hnRNPs（核内不均一核糖核蛋白，RNApolii转录物与三种hnRNA蛋白A,B,C复合形成hnRNP颗粒，hnRNPC辅助RNA加工）；RNA解旋酶；丝氨酸/苏氨酸激酶；转录因子；其他RNA加工因子（mRNA稳定性，mRNA输出，mRNA3端加工）。在分离得到的蛋白质中，60%的蛋白都与pre-mRNA的剪接相关，而且其中的大多数都能从剪接复合体中提纯出来。更重要的是，在两种条件下得到的蛋白存在一致性。DISCUSSION

25、PCC复合体是一个多snRNP的复合体。作者前面已经证实了，剪接状态下的Hela细胞核提取物能形成包含PSRg白和多种snRNP的PCC复合体。将核提取物调整到剪接状态的关键过程是降低盐离子和MgCl2的浓度和ATP再生系统。PCC的大小与剪接体类似，包含五种剪接snRNPs和其他非snRNP的剪接因子。用PSF寺异性抗体进行蔗糖梯度沉淀实验和co-IP实验，他们都证明了PCC的形成不需要外源的pre-mRNA,而且组装PCC似乎不依赖于ATP的水解。从PCC中分离鉴定出了约100种的蛋白因子，其中60%的蛋白为已知的剪接复合体的组分或者功能与剪接相关。虽然PCC与完全组装/有活性的剪接复合体

26、十分相似，但他们在两种方式上存在明显的区别。首先，有活性的剪接复合体不在4c下组装且需要ATP的水解提供能量。其次，许多剪接体蛋白，如必要的剪接因子、加帽蛋白（CBP）、Prp16和Prp17都不能从PCC中分离出来。这可能是由于在提纯的过程中一些蛋白因子被洗脱出去了，或者是由于技术上的难题不能由质谱技术分离出来。剪接装置和PCCo在过去的二十年间，一些实验室研究了剪接复合体和剪接相关的微粒。如上文所诉，之前的研究表明了剪接复合体从头组装后逐步去除内含子。然而，如今有些复合体并不适用于这个模型，例如酵母中的Cwf/Cwc复合体、InRNP复合体（能与U2和U6碱基配对且沉降系数大于150S）、含有U2/U4/U5/U6的假的剪接复合体、酿酒酵母中的五snRNP复合体、Hela细胞核提取物中的五snRNP复合体（PScomplex）。之前的研究认为一些上面的复合体的作用是储存snRNP,但如今的研究者认为他们可以作为功能性复合体。与PCC最相似的为酿酒酵母中的五snRNP复合体和Hela细胞核提取物中的五snRNP复合体。这三种复合体都在低盐离子浓度下形成并且包含五种snRNP。在不添加外源RNA的Hela细胞核提取物中能分离出PS复合体，PS复合体（200S）比PCC复合体大得多且其蛋白组分还未