啮齿类小鼠γ-干扰素原核表达、纯化及功能鉴定-2019年文档

1、啮齿类小鼠丫 -干扰素原核表达、纯化及功能鉴定Prokaryotic expression and purification of murine interferon-gammaLIU Xiao-hui, CHEN Zhuo-jia, DU Jun(Department of Microbiology and Biopharmaceutics inSchool of Pharmaceutical Sciences,Sun Yat-sen University ， Guangzhou510080， China) Objective:To clone murine interferon-gamma

2、 gene, do effective prokaryotic expression and purify recombinantmurine IFN- 丫 for further study.Methods:To amplify mIFN-丫 cDNA from ConA-activated murine splenocytes byRT-PCR and clone into pET30a(+) vector Then the targetprotein His6-mIFN- 丫 was induced by IPTG and purified withNi2+-NTA agarose. T

3、he biologic activity was identified by western blotting.Results:The prokaryotic expressionsystem of mIFN- 丫 was constructed . And the fusion protein mIFN-y was dissoluble and bioactive.Conclusion:Thetechnology of mIFN- y production is successfully optimized.It lays a foundation of further research o

4、f IFN-丫 .s IFN- 丫； Prokaryotic expression ； Purification英国国立医学研究所的Isancs 和 Lindenman 在研究病毒的干扰现象时发现了一种可溶性物质，进一步研究表明这一物质能够抑制多种病毒在细胞内的繁殖，于是将其命名为干扰素( interferons ， IFN) 1 。干扰素是一类由低分子可溶性蛋白组成的重要细胞因子，自 1957年 Isancs 首次发现鸡干扰素以来，先后已有人、鼠、犬以及猪等动物的干扰素基因被成功克隆。IFN- 丫具有很强的抗病毒活性、免疫调节活性和抗肿瘤活性。IFN- 丫可通过多种途径来发挥抗肿瘤作用，既通

5、过延长细胞周期以延缓肿瘤细胞的生长和繁殖；又可通过抑制癌基因的表达来阻止或减慢肿瘤细胞的转化过程；还可诱导肿瘤坏死因子(tumornecrosis factor- a, TNF-a )上调癌细胞对 TNF 受体、MH(E 类 抗原等的表达，使其易被杀伤性T淋巴细胞(cytotoxic Tlymphocyte, CTL) 识别而被杀伤2 。当病原体侵入机体组织后，淋巴细胞在感染部位聚集并释放干扰素等细胞因子。IFN- 丫主要通过JAK-STAT途径来发挥作用 的。IFN- 丫与几乎分布于所有正常细胞表面的高亲合力的受体 IFN- yR (IFNGFR结合并使受体发生二聚化后，受体的胞内近膜 区可

6、与胞浆内非受体TPK-JAK激酶(janus kinase)结合并发生磷 酸化，进而与信号转导和转录激活因子1(signal transducersand activators of transcription , STAT-1)相结合。在 JAK催 化下， STAT-1 结合成活化的STAT-1 二聚体转移入核，他们通过与 IFN- 丫 活化位/点(gamma-interferon activation sites , GAS)结合而诱导免疫活性蛋白表达，如CD54呷口剁安2, 3 二加氧酶 3 ( idoleamine 2,3-dioxygenase, IDO )等。据资料显示，我国在啮齿

7、类 y-干扰素的克隆、制作方面还 赶不上其他国家。尽管国外已经制备有基因重组啮齿类y-干扰素，但是由于其开发成本高、前期投入大，用于肿瘤药物的基础研究， 价格相当昂贵，这也严重地限制了我国相关领域的基础研究。因此本研究进行啮齿类丫-干扰素的制备对肿瘤药物的相关研究将具有重要的实际意义4 。1 材料与方法1.1 材料5周C57BL/6雄鼠，由中山大学动物实验中心提供。pET30a(+),购自Novagen公司。大肠杆菌JM109和BL21由本实 验室保存。限制性核酸内切酶 BamH I和Hindm、Taq DNA聚 合酶、T4 DNA连接酶、AMV®转录酶均购自 TaKaR赤司；IPT

8、G 购自华美生物工程公司；凝胶回收试剂盒及质粒小提试剂盒购自Omega Bio-tek 公司；镍离子螯合层析柱购自Pharmacia 公司。一抗兔抗IDO来自本实验室保存5 ; B-actin多克隆抗体购自 杰特伟公司；羊抗兔 HRP勾自博士德生物XX公司；蛋白定量试 剂为 Bio-Rad 公司的 Bio-Rad Protein Assay 试剂盒；RPMI1640、DMEM&养基粉末购自 Gibco公司；新生牛血清(NPS购 自PPA公司；小鼠mIFN-丫标准品购自品美生物工程 XX公司； 其余试剂为国产分析纯。1.2 方法1.2.1 引物设计与合成根据NCBI Gene Bank

9、发表的序列设计引物，由上海生工生物工程技术服务 XX公司合成。其序列为， 上游引物：5' -CAGAGCTTTCAGCAGCAGCTCCTTTTC- BamHI 位点)；下游引物：5' -TCGGATCCCACGGCACAGTCATT3AAAG- Hind 出位点)。1.2.2 目的基因的获取健康 6周龄的雄性C57BL/6小鼠，无 菌条件下取脾，放入盛有 5 ml不含血清RPMI1640的培养皿中， 不锈钢网(200 目)磨碎过滤，使之成为单细胞悬液。离心，弃上清，加入含有10 %新生牛血清RPMI164Q调整浓度为5X106 个/ml , ConA(8 以 g/ml)诱导

10、24 h(37 C , 5% CO2> 用 Trizol 二步法进行RT-PCFT增。PCRS应程序为：94c预变性5 min;94 变性30 s， 52退火30 s ， 72延伸1 min ，循环扩增 30次 , 最后72延伸10 min 。扩增产物经1.2 %琼脂糖凝胶电泳鉴定。1.2.3 pET30a(+)/mIFN- 丫 原核表达载体 的构建与鉴定PCFT物经1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，BamH I和 Hindm双酶切，凝胶回收试剂盒纯化回收。质粒小提试剂盒小 提质粒pET30a(+);质粒pET30a(+)经BamHI和Hind出双酶切， 凝胶回收试剂盒纯化回收。T4 DNA连

11、接酶连接纯化的PCRT物和pET30a(+),将连接产物转化至感受态大肠杆菌JM109,卡那霉素抗性筛选，PC吸酶切鉴定阳性重组质粒pET30a（+）/mIFN- T。将 pET30（+）/mIFN- T 转化至感受态大肠杆 菌BL21,从转化平板上随机挑取单菌落，在 3 ml LB中37c震 荡培养 1216 h ，菌液- 80冻存。1.2.4 His6-mIFN- 丫蛋白的融合表达取冻存菌接种于45ml的LB （卡那霉素50 ng/ml ） , 37c培养过夜，按 1 ： 50转接 于LB （含卡那霉素50 ng/ml）中，37c培养至OD直为0.60.8 , 加入终浓度为0.5 mmol

12、/L的IPTG 37c震荡培养3 h,并设IPTG 未诱导对照组。离心收集1.5 ml菌液，进行SDS-PAG辰达分析。1.2.5 工程菌裂解后融合蛋白的可溶性鉴定取蛋白表达阳性的冻存菌种于 45 ml的LB （卡那霉素50 ng/ml ） , 37 C培 养过夜，按1 ： 50转接于LB （含卡那霉素50 ng/ml ）中，37 C 培养至。琬为0.60.8，加入终浓度为 0.5 mmol/L的IPTG 25C 震荡培养7 h ，离心收集1.5 ml 菌液，冰上适量溶菌酶裂解缓冲液裂解菌体，超声裂菌（输出频率为25 Hz, 4C, 30 sX10）。4 ,15 000 r/min 离心 15

13、 min ，分别取适量上清和沉淀进行SDS-PAG盅泳，分析目的蛋白的分布，其余冻存于-80C冰箱。1.2.6 融合蛋白His6-mIFN- 丫的纯化架好银离子亲和层析柱，先以Washing buffer 流洗 （流速为 2 ml/min） 达平衡后，换成 Native Binding buffer 使其管柱结合上新的镍离子。再以Washing buffer 流洗达平衡后，注入保存的蛋白上清液，以Binding buffer 流洗 （流速为1 ml/min ） 约 250 ml。 再以 Washingbuffer 流洗 （ 流速为 2 ml/min） 约 300 ml。 最后以 Elution

14、 buffer洗脱，连续收集洗脱液，每次收集14 ml 。分别取少量Bindingbuffer 洗脱液，末次Washing buffer 洗脱液及Elution buffer洗脱液进行SDS-PAG分析。1.2.7 纯化蛋白的超滤将收集到的Elution buffer 洗脱液放入截流孔径5 KD的超滤管中，超滤20 min, 2 800 g/min , 4。 用PBS和5%的甘油清洗，继续超滤 20 min, 2 800 g/min 。收 集超滤后的蛋白，分装于1.5 mlEP 管中，冻存于- 80冰箱中。1.2.8 Western Blotting 鉴定融合蛋白 His6-mIFN- 丫 的

15、生 物学活性以小鼠巨噬细胞 RAW264.7乍为待测样本，检测IFN- 丫 诱导前后细胞内IDO表达的情况。取标准小鼠IFN- 丫作为阳性 对照，均诱导24 h 。光学显微镜下观察其形态学变化。WesternBlotting 参照分子克隆方法进行。电压80100 V 进行10%SDS-PAGE泳，电转 100 V, 70 min。2 结果2.1 目的基因的获取应用设计的特异性引物，采用RT-PCFT增mIFN-丫，1.2%琼脂糖凝胶电泳分析，可见426 bp 左右有一条特异条带，与预期片段大小相符；见图1。2.2 pET30a(+)/mIFN-丫原核表达载体的鉴定克隆至pET30a(+)载体的

16、重组质粒以 BamH I和Hindm双 酶切后，分别切出426 bp 和 5 422 bp 左右 2 个片段，见图2。与预想结果一致，证明构建重组质粒成功。His6-mIFN- 丫的表达和纯化 pET30a(+)/mIFN- 丫转化至感受态大肠杆菌BL21,随机挑选单克隆菌落，扩大培养经 IPTG诱 导后，SDS-PAG分析，可看到目的蛋白在 2、5和6号菌落中得 到融合表达。经诱导表达的目的蛋白的 Mr约18 kDa,与其理论 值基本接近，表明 pET30a(+)/mIFN- 丫可以在大肠杆菌中 BL21 融合表达，见图3。超声裂解菌后分别取适量上清和沉淀做SDS-PAG E发现目的蛋白多集

17、中在上清液，大部分是以可溶形式表达，见图4。阳性菌株经扩大培养及IPTG诱导表达，用银离子亲和层析 柱纯化收集到的可溶性蛋白，SDS-PAG分析，可看到29号收集液在 18 kDa 左右均有一条清晰的条带，并且59 号收集液中几乎没有杂带。可见利用银离子亲和层析柱对His6-mIFN- 丫蛋白液的纯化效果极好，见图5。2.3 His6-mIFN- 丫生物活性鉴定分别将纯化的重组蛋白 His6-mIFN- 丫和标准品mIFN-丫刺激小鼠巨噬细胞系RAW264.7， 24 h 后可见受刺激的细胞发生明显的形态学变化，见图6。 Western Blotting分析可见经His6-mIFN- 丫和标准

18、品 mIFN-丫诱导后，RAW264.碇达IDO的 活性明显升高，见图7。图1PCN物电泳图M: DNA标准 DL 2000;1 : PCR物Fig.1 Electrophoresis map for PCR productsM： DNA Marker DL 2000;1 ： PCR amplification图 2 重组质粒的酶切电泳图1: PCR扩增产物mIFN-丫片段;2:经双酶切的重组质粒；3：未经处理的重组质粒;M： DNA 标准DL 2000Fig.2 Restriction enzyme digestion analysis of the recombinant plasmid1

19、: PCR amplification mIFN- y ；2 : BamH I + Hind 田 pET30/mIFN-丫 ;3: pET30/mIFN- 丫 ;M, DNA Marker DL 2000图3IPTG诱导蛋白的 SDS-PAGEM中分子量蛋白 marker； 1:未加IPTG诱导菌液总蛋白；26: IPTG诱导菌液总蛋白Fig.3SDS-PAGE of induced products with IPTGM： protein molecular weight marker; 1： UninducedpET30a(+)/mIFN- 丫 ；26: induced pET30a(+)

20、/mIFN- 丫图4超声裂解菌SDS-PAG西泳M中分子量蛋白marker； 1:裂解菌后的上清液；2：裂解 菌后的沉淀物Fig.4 SDS-PAGE of split productsM： Protein molecular weight marker； 1 ： Superior liquid of split products；2： Deposit of split products图5纯化啮齿类Y-干扰素的SDS-PAGI®M 中分子量蛋白 marker； 1: Binding buffer洗脱液；2：末次 Washing buffer 洗脱液，39： Elution buff

21、er 洗脱液Fig.5 SDS-PAGE analysis of the purification of recombinant murine IFN- 丫 （m IFN- 丫）M： moderate protein molecular weight markers ； 1： Binding buffer eluent ；2： ultimate Washing buffer eluent 3-9 ， Elution buffer eluent图6mIFN-Y刺激RAW264.7后的形态学变化1:未加 mIFN-丫刺激的RAW264.7细胞形态；2:标准品 mIFN-丫刺激后的RAW264.N田

22、胞形态；3: His6-mIFN- 丫刺激后 的RAW264.7细胞形态Fig.6 microscope observation of RAW264.7 induced by mIFN-丫1: morphology of RAW264.7without IFN- y ; 2: morphology of RAW264.7induced by mIFN-丫 standard ； 3: morphology of RAW264.7 with His6-mIFN- 丫图7IDO在RAW264.7细胞中的表达情况1: His6 -mIFN- 丫刺激后RAW264.7细胞溶胞产物；2:标 准品mIFN-丫刺激后RAW264.颜胞溶月6产物