2质粒DNA的酶切鉴定ppt课件

1、实验二实验二 质粒质粒DNA的酶切鉴定的酶切鉴定及琼脂糖凝胶电泳及琼脂糖凝胶电泳1. 实验目的和要求实验目的和要求学习和掌握限制性内切酶的特性、酶学习和掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法，并解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法，并理解限制性内切酶是理解限制性内切酶是DNA重组技术的重组技术的关键工具，琼脂糖凝胶电泳是分离鉴关键工具，琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定定DNA片段的有效方法。片段的有效方法。 2. 相关基础知识相关基础知识 限制性核酸内切酶：是一类能识别双限制性核酸内切酶：是一类能识别双链链DNA分子特异性核酸序列的分子特异性核酸序列的DNA水水解酶。是体外剪切基因片段的重要工

2、解酶。是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚合酶、连接酶具，所以常常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。以及末端修饰酶等一起称为工具酶。限制性核酸内切酶不仅是限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重组中重要的工具，而且还可以用于基因组重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定。酶切图谱的鉴定。1) 寄主控制的限制与修饰现象寄主控制的限制与修饰现象2) 核酸限制性内切酶的类型核酸限制性内切酶的类型3) 核酸限制性内切酶的基本特性核酸限制性内切酶的基本特性4) 同裂酶和同尾酶同裂酶和同尾酶5) 核酸限制性内切酶的命名法核酸限制性内切酶的命名法6) 影响核酸限制性内切酶活性的

3、因素影响核酸限制性内切酶活性的因素1) 寄主控制的限制与修饰现象寄主控制的限制与修饰现象限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。 各各种细菌都能合成一种或几种能够切割种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源链的核酸内切酶，它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的身的DNA不受影响，因为这种细胞还合成了不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限进行了修饰，限制性酶对修饰过的制性酶对修饰过的DNA不能起作用。这种现不能起

4、作用。这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。象被称为寄主控制的限制与修饰现象。2)限制性核酸内切酶的类型及特性限制性核酸内切酶的类型及特性按限制酶的组成、与修饰酶活性关按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同，分为系以及切断核酸的情况不同，分为三类：三类： 型型 型型* 型型第一类第一类I I型限制性内切酶能识别专一型限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割苷酸上切割DNADNA分子中的双链，但是切割分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在类限制

5、性内切酶在DNADNA重组技术或基因工重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析程中用处不大，无法用于分析DNADNA结构或结构或克隆基因。这类酶如克隆基因。这类酶如EcoBEcoB、EcoKEcoK等。等。 第二类第二类(II(II型型) )限制性内切酶能识别专一的核苷限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此，这种限制性内切酶是都是专一的。因此，这种限制性内切酶是DNADNA重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识别重组技术中最

6、常用的工具酶之一。这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是的专一核苷酸顺序最常见的是4 4个或个或6 6个核苷酸，个核苷酸，少数也有识别少数也有识别5 5个核苷酸以及个核苷酸以及7 7个、个、8 8个、个、9 9个、个、1010个和个和1111个核苷酸的。个核苷酸的。 II II 型限制性内切酶的型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向对称轴，从这个轴朝二个方向“读都完全相读都完全相同。这种酶的切割可以有两种方式：同。这种酶的切割可以有两种方式：粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链末端，粘性末端；是交错切割，结果形

7、成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。所以称为粘性末端。如如EcoRIEcoRI的识别顺序为：的识别顺序为： 5 GAA|TT_C 35 GAA|TT_C 3 3 C_TT|AAG 5 3 C_TT|AAG 5垂直线表示中心对称轴，从两侧垂直线表示中心对称轴，从两侧“读核苷酸顺读核苷酸顺序都是序都是GAATTCGAATTC或或CTTAAGCTTAAG，这就是回文顺序，这就是回文顺序palindromepalindrome）。）。_ _和和表示在双链上交错切割的表示在双链上交错切割的位置，切割后生成位置，切割后生成5

8、G5G和和AATTC3AATTC3、3CTTAA3CTTAA和和G5G5二个二个DNADNA片段，各有一个片段，各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过酯键以及氢键可通过DNADNA连接酶的作用而连接酶的作用而“粘合粘合”。IIII型酶切割方式的另一种是在同一位置型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV EcoRV 的识别位置是：的识别位置是： 5 GAT|ATC 35 GAT|ATC 33 CTA|TAG 5 3 CTA|TAG 5 切割后形成切割后形成5 GA

9、T5 GAT和和ATC 3ATC 3、 3 CTA3 CTA和和TAG 5TAG 5。这种末端。这种末端同样可以通过同样可以通过DNADNA连接酶连接起来。连接酶连接起来。平头末端：平头末端：第三类（第三类（ IIIIII型限制性内切酶也有专一型限制性内切酶也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序的识别顺序，但不是对称的回文顺序, ,在识在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度定长度DNADNA片段，具有各

10、种单链末端。因此片段，具有各种单链末端。因此不能应用于基因克隆。不能应用于基因克隆。同裂酶：同裂酶：有时两种限制性内切酶的识别核苷酸有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，有时其差别顺序和切割位置都相同，有时其差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。例如另一种则不能。例如Hpa和和Msp的识别顺序都是的识别顺序都是5GCG_G3，如果其中有，如果其中有5-甲基胞嘧啶，则只有甲基胞嘧啶，则只有Hpa能够切能够切割。这些有相同切点的酶称为同裂酶割。这些有相同切点的酶称为同裂酶同切

11、酶或异源同工酶）。同切酶或异源同工酶）。 3） 同裂酶和同尾酶：同裂酶和同尾酶：有时两种酶切割序列不完全相同，但却能产有时两种酶切割序列不完全相同，但却能产生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾酶，生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾酶，可以通过可以通过DNADNA连接酶将这类末端连接起来，但连接酶将这类末端连接起来，但原来的酶切位点将被破坏，有时可能会产生原来的酶切位点将被破坏，有时可能会产生一个新的酶切位点。如一个新的酶切位点。如Xba1Xba1、Nhe1Nhe1以及以及Spe1Spe1切割的切割的DNADNA序列不同，但均给出相同的序列不同，但均给出相同的“CTAGCTAG粘性末端。这些粘性末

12、端连接后，以上的粘性末端。这些粘性末端连接后，以上的酶将不能再切割，但却产生了一个新的酶将不能再切割，但却产生了一个新的4 4核苷核苷酸的酶切位点，即酸的酶切位点，即 Bfa1Bfa1的酶切位点。的酶切位点。同尾酶：同尾酶：4) 限制性核酸内切酶的命名法限制性核酸内切酶的命名法用属名的头一个字母和种名的头两个字用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称，如母表示寄主菌的物种名称，如E. coli 用用Eco表示，所以用斜体字。表示，所以用斜体字。用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌菌Rd菌株用菌株用d，即，即Hind。如果一种特殊的寄主菌株，具有

13、几个不如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰体，则以罗马数字表同的限制与修饰体，则以罗马数字表示，如示，如Hind, Hind，Hind等。等。5) 影响核酸限制性内切酶活性的因素影响核酸限制性内切酶活性的因素(1) DNA的纯度；的纯度；(2) DNA的甲基化程度；的甲基化程度；(3) 酶切消化反应的温度；酶切消化反应的温度；(4) DNA的分子结构；的分子结构；(5) 溶液中离子浓度及种类；溶液中离子浓度及种类；(6) 缓冲液的缓冲液的 pH值。值。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖溶化再凝固后琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖溶化再凝固后能形成带有一定孔隙的固体基质

14、的特性，其能形成带有一定孔隙的固体基质的特性，其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场的作用下密度取决于琼脂糖的浓度。在电场的作用下及中性及中性pH的缓冲条件下带负电的核酸分子就的缓冲条件下带负电的核酸分子就可以向阳极迁移。可以向阳极迁移。影响影响DNA在琼脂糖中迁移率的因素：在琼脂糖中迁移率的因素：DNA分分子的大小、子的大小、DNA的构象、电压、电场方向、的构象、电压、电场方向、碱基组成、嵌入的燃料以及电泳缓冲液的组碱基组成、嵌入的燃料以及电泳缓冲液的组成。成。琼脂糖凝的浓度影响给定大小的线状琼脂糖凝的浓度影响给定大小的线状DNA的的迁移率，因此采用不同浓度的凝胶可以分离迁移率，因此采用不同浓度的

15、凝胶可以分离不同大小范围的不同大小范围的DNA片段。片段。0.8%的琼脂糖凝的琼脂糖凝胶能很好地分辨胶能很好地分辨1-25kb的片段；的片段；0.5% 的琼脂的琼脂糖凝胶用于分辨较大片段的糖凝胶用于分辨较大片段的DNA (20-100kb）；对于小片段的）；对于小片段的DNA(0.2-2kb) 可用可用1.5%或更高浓度的凝胶进行分离。不过，以或更高浓度的凝胶进行分离。不过，以上这些并不是绝对的，因为有时我们需要同上这些并不是绝对的，因为有时我们需要同时分离多种分子量相差较大的片段，因此所时分离多种分子量相差较大的片段，因此所用琼脂糖凝胶的浓度要视情况而定。用琼脂糖凝胶的浓度要视情况而定。EB

16、EB：即：即3,8-3,8-二氨基二氨基-5-5-乙基乙基-6-6-苯基菲锭溴苯基菲锭溴盐盐, (Ethidium Bromide), (Ethidium Bromide)。它能够插入。它能够插入DNADNA分子中的碱基对之间而与分子中的碱基对之间而与DNADNA结合。由于结合。由于EBEB分子的插入，在紫外光的照射下，凝胶电泳分子的插入，在紫外光的照射下，凝胶电泳中的中的DNADNA条带呈现出红色荧光，易于检测。条带呈现出红色荧光，易于检测。可以检测可以检测10ng 10ng 的的DNADNA。留意：留意：EBEB是一种诱变剂，操作时一定要注意是一种诱变剂，操作时一定要注意安全操作，必须戴塑

17、料或乳胶手套安全操作，必须戴塑料或乳胶手套!3. 3. 实验材料与仪器实验材料与仪器质粒质粒 pCMV-Myc-T10pCMV-Myc-T10NEB NEB 标准分子量片段标准分子量片段(1kb DNA Ladder)(1kb DNA Ladder)EcoRI EcoRI 和和 XhoI XhoI 核酸内切酶核酸内切酶TakaraTakara）EcoRIEcoRI和和 XhoIXhoI酶解缓冲液酶解缓冲液(10(10H buffer)H buffer)琼脂糖琼脂糖 TBETBE或或TAETAE缓冲液缓冲液(10(10) ) 溴化乙啶染色液溴化乙啶染色液(10mg/ml)(10mg/ml) 上样

18、液上样液(6(6) )：0.25% 0.25% 溴酚兰，溴酚兰，4040(W/V)(W/V)蔗蔗糖糖 水溶液或水溶液或3030的甘油。的甘油。InsertEcoRIXhoI1.9kb质粒质粒1 kb DNA Ladder1 kb DNA Ladder不能对不能对DNADNA质量进行精质量进行精确定量分析，但可以通过与相近的条带进确定量分析，但可以通过与相近的条带进行比较估算出大概的数据。每条带大致的行比较估算出大概的数据。每条带大致的量如下按量如下按0.5g0.5g上样量计。应按上样量计。应按1313条带条带计算，因为计算，因为3kb3kb的量是其它片段量的近三的量是其它片段量的近三倍）：倍）

19、： 1 kb DNA Marker片段碱基对质量110,00242 ng28,00142 ng36,00150 ng45,00142 ng54,00133 ng63,001125 ng72,00048 ng81,50036 ng91,00042 ng10a51742 ng*10b50042 ng*EcoR I 酶切位点：酶切位点：GAATT_CXho I 酶切位点：酶切位点：CTCGA_G10H buffer: 500mM Tris-HCl(pH7.5) 100mM MgCl2 10mM Dithiothreitol 1000mM NaCl酶活性的定义：酶活性的定义：一个活性单位一个活性单位U

20、)U)，是指在，是指在5050l l反应体系中，反应体系中，37oC37oC的条件下，经过的条件下，经过1 1小时的反应时间，将小时的反应时间，将1 1g DNA g DNA 完全酶解所需要的酶量。完全酶解所需要的酶量。因为不同的酶所要求的最适反应条件不同，所因为不同的酶所要求的最适反应条件不同，所以一定要使用与酶相匹配的缓冲系统。一般按以一定要使用与酶相匹配的缓冲系统。一般按照销售酶的公司所提供的相应缓冲液。双酶切照销售酶的公司所提供的相应缓冲液。双酶切或多酶切时要考虑相容性缓冲液问题，一般公或多酶切时要考虑相容性缓冲液问题，一般公司会给用户提供这方面的信息。司会给用户提供这方面的信息。电泳

21、仪，电泳槽，紫外透射仪，电泳仪，电泳槽，紫外透射仪，凝胶成像仪，一次性塑料手套等凝胶成像仪，一次性塑料手套等仪器设备仪器设备4. 实验方法和步骤实验方法和步骤 * * 缓冲液随不同的酶而不同缓冲液随不同的酶而不同, ,本实验用本实验用 H bufferH buffer。置于置于3737水浴酶解水浴酶解0.5-10.5-1小时。酶解完成后，分小时。酶解完成后，分别加入别加入1010l 3l 3倍的上样缓冲液倍的上样缓冲液, , 然后各取然后各取1515l l进行电泳分析。进行电泳分析。1) 质粒质粒DNA的酶解自提质粒的酶解自提质粒pCMV-Myc-T10）2) 琼脂糖凝胶的制备琼脂糖凝胶的制备

22、琼脂糖凝胶液的制备：称取琼脂糖凝胶液的制备：称取0.8g琼脂糖，琼脂糖，置于三角瓶中，加入置于三角瓶中，加入100ml TBE或或TAE工作液，瓶口倒扣一个小烧杯，将该三工作液，瓶口倒扣一个小烧杯，将该三角瓶置于微波炉加直至琼脂溶解。角瓶置于微波炉加直至琼脂溶解。3胶板的制备胶板的制备取有机玻璃内槽，洗净、晾干；将有机取有机玻璃内槽，洗净、晾干；将有机玻璃内槽置于一水平位置模具上，放好玻璃内槽置于一水平位置模具上，放好梳子。梳子。 将冷却至将冷却至65左右的琼脂糖凝胶液，小心地倒左右的琼脂糖凝胶液，小心地倒在有机玻璃内槽上，控制灌胶速度和量，使胶在有机玻璃内槽上，控制灌胶速度和量，使胶液缓慢地

23、展开，直到在整个有机玻璃板表面形液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。成均匀的胶层。室温下静置室温下静置30min左右，待凝固完全后，轻轻拔左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。出梳子，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有0.5-1TAETris-乙酸）乙酸） 或或TBETris-硼酸工硼酸工作液的电泳槽中使用。作液的电泳槽中使用。4加样加样用微量加样器将上述样品分别加入胶板的用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品孔内。每加完一个样品，换一个加样样品孔内。每加完一个样品，换一个加样

24、头。加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶头。加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面以及穿透凝胶底部，本实验样品孔容量面以及穿透凝胶底部，本实验样品孔容量约约1520 l。1 kb DNA ladder能见到能见到10条带）条带）: 在第在第一个上样孔或最后一个上样孔内加入一个上样孔或最后一个上样孔内加入6l 的的 1 kb DNA ladder50ng/l ）。）。5电泳带上手套操作）电泳带上手套操作）加完样后的凝胶板即可通电进行电泳；加完样后的凝胶板即可通电进行电泳；建议在建议在80100V的电压下电泳；的电压下电泳；当溴酚兰移动到距离胶板下沿约当溴酚兰移动到距离胶板下沿约1cm处停止处停止电泳；电泳；将凝胶放入溴化乙啶将凝胶放入溴化乙啶EB工作液工作液0.5g/ml左右中染色约左右中染色约20min。为了获得电泳分离为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，片段的最大分辨率，电场强度不应高于电场强度不应高于5V/cm两电极间的距两电极间的距离）。电泳温度视需要而定，对大分子的离）。电泳温度视需要而定，对大分子的分离，以低温较好，也可在室温下进行。分离，以低温较好，也可在室温下进行