生物化学课程实验指导书

1、生物化学实验指导书适用专业：生物技术、生物工程、食品科学与工程生物与食品工程学院生物科学系生物化学实验细则为了保证生物化学实验的顺利进行，培养同学们掌握良好、规范的生物化学基本实验技能，特制定以下实验细则，请同学们严格遵守。1. 实验前应提前预习实验指导书并复习相关知识。2. 严格按照生物化学实验分组，分批进入实验室，不得迟到。非本实验组的同学不准进入实验室。3. 进入实验室必须穿实验服。各位同学进入各自实验小组实验台后，保持安静，不得大声喧哗和嬉戏，不得无故离开本实验台随便走动。绝对禁止用实验仪器或药物开玩笑。4. 实验中应保持实验台的整洁，废液倒入废液桶中，用过的滤纸放入垃圾桶中，禁止直接

2、倒入水槽中或随地乱丢。5. 实验中要注意节约药品与试剂，爱护仪器，使用前应了解使用方法，使用时要严格遵守操作规程，不得擅自移动实验仪器。否则，因非实验性损坏，由损坏者赔还。6. 使用水、火、电时，要做到人在使用，人走关水、断电、熄火。7. 做完实验要清洗仪器、器皿，并放回原位，擦净桌面。8. 实验后，要及时完成实验报告。2006年1月目 录生物化学实验细则····················&

3、#183;··············1目 录··································

4、83;···········2实验1 蛋白质的沉淀、变性反应······················3实验2 醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白··········

5、83;··6实验3 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量···11实验4 凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量·············16实验5 DNA的琼脂糖凝胶电泳·····················

6、·20实验6 唾液淀粉酶的性质和活力测定·················24实验7 生物氧化与电子传递·························25实验8 植物

7、体内的转氨基作用·······················27实验1蛋白质的沉淀、变性反应（3学时）目的要求1. 加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。2. 了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。3. 了解蛋白质变性与沉淀的关系。4.了解蛋白质两性性质原 理在水溶液中，蛋白质分子表面形成水化层和双电层而成为稳定的胶体颗粒，所以蛋白质溶液和其他亲水胶体溶液相类似。但是

8、，蛋白质胶体颗粒的稳定性是有条件的，相对的。在一定的物理化学因素影响下，蛋白质颗粒失去电荷，脱水，甚至变性，则以固态形式从溶液中析出，这个过程称为蛋白质的沉淀反应。这种反应可分为以下两种类型：1可逆沉淀反应在发生沉淀反应时，蛋白质虽已沉淀析出，但它的分子内部、空间结构并未发生显著变化，基本上保持原有的性质，沉淀因素除去后，能再溶于原来的溶剂中。这种作用称为可逆沉淀反应。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质以及利用等电点的沉淀，提纯蛋白质时，常利用此类反应。2不可逆沉淀反应在发生沉淀反应时，蛋白质分子内部结构、空间构象遭到破坏，失去原来的天然性质，这时蛋白质已发生

9、变性。这种变性蛋白质的沉淀不能再溶解于原来溶剂中的作用称为不可逆沉淀反应。重金属盐、生物碱试剂，强酸、强碱、加热、震荡、超声波、有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷）并不析出，因此，变性蛋白质不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。试剂和器材一、试剂1. 蛋白质溶液： 取5ml鸡或鸭蛋清，用蒸馏水稀释至100ml，搅拌均匀后用48层纱布过滤，新鲜配置。2. 蛋白质氯化钠溶液： 取20ml蛋清，加蒸馏水200ml和饱和氯化钠溶液100ml，充分搅匀后，以纱布滤去不溶物（加入氯化钠的目的是溶解球蛋白）。3. 其余试剂：硫酸铵粉

10、末，饱和硫酸铵溶液(150ml)，3%硝酸银（280ml），0.5%乙酸铅（200ml），浓硫酸（5ml/组），5%磺基水杨酸（100ml），0.1%硫酸铜（100ml），饱和硫酸铜溶液（400ml），0.1%乙酸（500ml），10%乙酸（500ml），饱和氯化钠溶液（25ml），10%氢氧化钠溶液（500ml）。二、器材试管，过滤漏斗，试管架，玻璃棒，沸水浴，量筒，烧杯，试剂瓶，移液管，滤纸，洗瓶，废液缸，药匙，移液管架。操作方法一、蛋白质的可逆沉淀反应蛋白质的盐析作用(分级盐析)二、蛋白质的不可逆沉淀反应1. 重金属沉淀蛋白质2. 酸沉淀蛋白质1）2）3. 加热沉淀蛋白质取5支试管，编号

11、，按下表加入有关试剂（单位/滴）。试剂管号 蛋白质溶液0.1%乙酸10%乙酸饱和氯化钠10%氢氧化钠蒸馏水123451010101010555227225将各管混匀，观察记录各管现象后，放入沸水浴中加热10min，比较各管的沉淀情况。思 考 题1. 名词解释：水化层；双电层；蛋白质变性；盐溶与盐析；蛋白质等电点沉淀。2. 将实验结果写在实验报告中操作方法的对应位置上并就实验现象作简要解释。3. 根据实验现象，讨论下列问题：1） 蛋白质可逆沉淀与不可逆沉淀的本质区别是什么？2） 简述蛋白质的沉淀反应、变性作用和凝固作用的相互关系。4. 作为杀菌剂，氯化汞是怎样起作用的？实验2醋酸纤维素薄膜电泳分

12、离血清蛋白（4学时）目的要求1. 学习蛋白质电泳的一般原理及方法。2. 掌握用醋酸纤维素薄膜电泳分离蛋白质的操作技术。原 理带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。带电颗粒之所以能在电场中向一定的方向移动，并具有一定的迁移速度，是取决于带电颗粒本身性质的影响，以及电场强度、溶液的pH值、离子强度及电渗等因素的影响。蛋白质具有两性性质，在溶液中可解离的基团除肽链末端的氨基和羧基外，还有很多侧链基团在一定的pH条件下能解离而使蛋白质带电。当溶液的pH>pI（等电点）时，蛋白质带负电荷，在电场中向正极移动，而的pH<pI时，则带正电荷，电泳时向负极移动。由于

13、蛋白质分子在溶液中解离成带电的颗粒，所以在电场中除等电点外均能定向泳动，其电泳的方向和速度主要决定于所带电荷的性质，以及所带电荷数量、颗粒大小和形状。不同的带电颗粒在同一电场中泳动速度不同，常用迁移率来表示。迁移率的定义是指带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。其计算公式如下：式中：m为迁移率（cm2/V·s）；v为颗粒的泳动速度（cm/s）；E为电场强度（V/cm）；为颗粒泳动的距离（cm）；为支持物的有效长度（cm）；V为实际电压（V）；t为电泳时间（s）。各种蛋白质的等电点、分子量及颗粒大小各不相同，在某一指定的pH值溶液中，各种蛋白质所带的电荷不同，因而在电场中迁移的方向和速度

14、不同。根据这个原理，就可以从蛋白质混合物中将各种蛋白质分离出来。因此，电泳技术在生物化学与分子生物学研究中被广泛用于生物大分子或小分子（如蛋白质、核酸、氨基酸等）的分离纯化与分析鉴定等。同时此项技术也普遍用于临床诊断和工农业生产实践中，并已发展成为这些部门的重要分析分离手段。醋酸纤维素薄膜电泳是以醋酸纤维素薄膜为支持物的一种区带电泳。这种薄膜具有均一的泡沫状结构，厚度为120m，渗透性强，对样品无吸附作用，用它作支持物进行电泳，电泳效果比纸电泳好，具有样品用量少，分离速度快，电泳图谱更为清晰，灵敏度也较高（5g / ml以上）等优点。目前已广泛应用于血清蛋白、血红蛋白、脂蛋白、同工酶的分离和测

15、定等方面。本实验以醋酸纤维素薄膜为电泳支持物，分离各种血清蛋白。血清中含有清蛋白、-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、分子量、等电点及形状不同（如图2-1），在电场中迁移速度不同。分子量小、等电点低、在相同碱性pH缓冲体系中、带负电荷多的蛋白质颗粒在电场中迁移速度快。例如，正常人血清在pH8.6的缓冲体系中电泳1h左右，染色后可显示5条区带。清蛋白泳动最快，其余依次为1，2，-及-球蛋白（如图2-2）。这些区带经洗脱后可用分光光度法定量，也可直接进行光吸收扫描自动绘出区带吸收峰及相对百分比。临床医学常利用它们间相对百分比的改变或异常区带的出现作为临床

16、鉴别诊断的依据。蛋白质名称等电点（pI）分子量清蛋白-球蛋白-球蛋白-球蛋白4.885.065.126.857.50690001-2000002-30000090000150000156000300000图2-1 人血清中5种蛋白质的等电点及分子量图2-2 正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图1为清蛋白（或称为白蛋白），2、3、4、5分别为1-、2-、-及-球蛋白，6为点样原点试剂和器材一、测试材料未溶血的人或动物血清。二、试剂1.巴比妥巴比妥钠缓冲液（PH8.6，0.07mol/L，离子强度0.06）：称取1.66g巴比妥（AR）和12.76g巴比妥钠（AR），置于三角烧瓶中，加蒸馏水约600

17、ml，稍加热溶解，冷却后用蒸馏水定容至1000ml。置4保存，备用。2. 染色液（0.5%氨基黑10B）：称取0.5g氨基黑10B，加蒸馏水40ml，甲醇（AR）50ml，冰乙酸（AR）10ml，混匀溶解后置具塞试剂瓶内贮存。3. 漂洗液：取95%乙醇（AR）45ml，冰乙酸（AR）5ml和蒸馏水50ml，混匀置具塞试剂瓶内贮存。三、器材醋酸纤维素薄膜（2×8cm），培养皿，镊子，直尺和铅笔，电泳仪及电泳槽，试管及试管架，普通滤纸。操作方法一、薄膜与仪器的准备1. 醋酸纤维素薄膜的润湿与选择用镊子取一片薄膜，小心地平放在盛有缓冲液的平皿中。若漂浮于液面的薄膜在1530s内迅速润湿，整

18、条薄膜色泽深浅一致，则此膜均匀可用于电泳；若薄膜润湿缓慢，色泽深浅不一或有条纹及斑点等，则表示薄膜不均匀应弃去，以免影响电泳结果。将选好的薄膜用镊子轻压，使其完全浸泡于缓冲液中约30min后，方可用于电泳。2. 电泳槽的准备根据电泳槽膜支架的宽度，裁剪尺寸合适的滤纸条。在两个电极槽中，各倒入等体积的电极缓冲液，在电泳槽的两支架上，各放一层滤纸条，使滤纸一端的边与支架前沿对齐，另一端侵入电极缓冲液内。当滤纸条全部润湿后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱赶气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上。滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维素薄膜的桥梁。 用平衡装置连接两个电泳槽，使两个电极槽内的缓冲液彼此处于同

19、一水平状态。 二、点样1. 制备点样模板取一张干净滤纸（10×10cm），在距纸边1.5cm处用铅笔划一平行线，此线为点样标志区。2. 点样用镊子取出浸透的薄膜，夹在两层滤纸间轻轻按压，吸去多余的缓冲液。无光泽面向上平放在点样模板上，使其底边与模板底边对齐。点样区距阴极端1.5cm处。点样时，先用玻片一端截面沾取一定量的血清，然后将沾有样品的玻片截面垂直地与纤维素薄膜点样区处轻轻接触，样品即呈一条线“印”在薄膜上，（如图2-3）使血清完全渗透至薄膜内，形成细窄而均匀的直线。此步是实验的关键，点样前应在滤纸上反复练习，掌握点样技术后再正式点样。图2-3 醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意

20、图。虚线处为点样位置三、电泳用镊子将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上，如图所示。要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。如一电泳槽中同时安放几张薄膜，则薄膜之间应相隔几毫米。盖上电泳槽盖，使薄膜平衡10min。图2-4 电泳装置剖视示意图1.滤纸桥2.电泳槽3. 醋酸纤维素薄膜4.电泳槽支架5.电极室中央隔板用导线将电泳槽的正、负极分别连接，注意不要接错。在室温下电泳，打开电源开关，用电泳仪上细调节旋扭调到每厘米膜宽电流强度为0.3mA（8片薄膜则为4.8 mA）。通电1015min后，将电流调节到每厘米膜宽电流强度为0.5mA（8片共8mA）

21、，电泳时间约5080min。电泳后调节旋扭使电流为零，关闭电泳仪切断电源。四、染色与漂洗用解剖镊子取出电泳后的薄膜，放在含0.5%氨基黑10B染色液的培养皿中，浸染5min。取出后再用漂洗液浸洗、脱色，每隔10min换漂洗液一次，连续数次，直至背景蓝色脱尽。取出薄膜放在滤纸上，用吹风机的冷风将薄膜吹干。注 意 事 项1 醋酸纤维素薄膜的预处理市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片，薄膜的浸润与选膜是电泳成败的重要关键之一。将干膜片漂浮于电极缓冲液表面，其目的是选择膜片厚薄均匀，如漂浮1530s时，膜片吸水不均匀，则有白色斑点或条纹，这提示膜片厚薄不均匀，应弃去不用，以免造成电泳后区带扭曲，界限不清，背景

22、脱色困难，结果难以重复。由于醋酸纤维素薄膜亲水性比纸小，浸泡30min以上是保证膜片上有一定量的缓冲液，并使其恢复到原来多孔的网状结构。最好是让漂浮于缓冲液的薄膜吸满缓冲液后自然下沉，这样可将膜片上聚集的小气泡赶走。点样时，应将膜片表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免缓冲液太多引起样品扩散。但也不能吸得太干，太干则样品不易进入薄膜的网孔内，而造成电泳起始点参差不齐，影响分离效果。吸干的程度以不干不湿为宜。为防止指纹污染，取膜时，应戴指套或用夹子。2 缓冲液的选择醋酸纤维素薄膜电泳常选用pH8.6巴比妥缓冲液，其浓度为0.050.09mol/L。选择何种浓度与样品及薄膜的厚薄有关。在选择时，先初步定

23、下某一浓度，如电泳槽电极之间的膜长度为810cm，则需电压25V/cm膜长，电流强度为0.40.5mA/cm膜宽。当电泳时达不到或超过这个值时，则应增加缓冲液浓度或进行稀释。缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快，并由于扩散变宽；缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢，区带分布过于集中，不易分辨。3. 加样量加样量的多少与电泳条件、样品的性质、染色方法与检测手段灵敏度密切相关。作为一般原则，检测方法越灵敏，加样量越少，对分离更有利。如加样量过大，则电泳后区带分离不清楚，甚至互相干扰，染色也较费时。如电泳后用洗脱法定量时，每厘米加样线上需加样品0.15L，约相当5-1000g蛋白。血清蛋白常规电泳分离时，每

24、厘米加样线加样量不超过1L，相当于60-80g蛋白质。但糖蛋白和脂蛋白电泳时，加样量则应多些。对每种样品加样量应先作预实验加以选择。点样好坏是获得理想图谱的重要环节之一，以印章法加样时，动作应轻、稳，用力不能太重，以免将薄膜弄破或印出凹陷而影响电泳区带分离效果。4. 电量的选择电泳过程应选择合适的电流强度，一般电流强度为0.40.5mA/cm膜宽为宜。电流强度高，则热效应高，尤其在温度较高的环境中，可引起蛋白质变性或由于热效应引起缓冲液中水分蒸发，使缓冲液浓度增加，造成膜片干涸。电流过低，则样品泳动速度慢且易扩散。5. 染色液的选择 对纤维素薄膜电泳后应根据样品的特点加以选择。其原则是染料对被

25、分离样品有较强的着色力，背景易脱色；应尽量采用水溶性染料，不宜选择醇溶性染料，以免引起醋酸纤维素薄膜溶解。应控制染色时间。时间长，薄膜底色深不易脱去；时间太短，着色浅不易区分，或造成条带染色不均匀，必要时可进行复染。 思 考 题1通过本次实验，讨论下列问题：（1）简述醋酸纤维薄膜电泳原理。（2）根据人血清中血清蛋白各组分等电点，如何估计它们在pH8.6的巴比妥巴比妥钠电极缓冲液中，移动的相对位置。（3）醋酸纤维素薄膜与滤纸相比较，有哪些优点？(4)电泳时为什么要将点样的一端靠近负极端？实验4葡聚糖凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量(4学时)目的要求1. 初步掌握利用凝胶层析法测定蛋白质分子量的原理

26、。2. 学习用标准蛋白质混合液制作Ve, Kav对的“选择曲线”以及测定未知蛋白质样品分子量的方法。原 理凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体，它们的内部有很细微的多孔网状结构。目前关于凝胶层析的原理有许多假设和理论，普遍接受的是分子筛效应。凝胶颗粒在合适的溶剂中浸泡，充分吸液膨胀，然后装入层析柱内，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱。在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，流速缓慢，以至最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。对凝胶层析分离的简单过程可用图4-1表示。图4-1 小分子由于扩散作用进入凝胶颗粒

27、内部而被滞留，大分子被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过。外水体积、内水体积、柱床体积 、洗脱体积 外水体积（Vo）是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积内水体积（Vi）是指凝胶颗粒中孔穴的体积。柱床体积 是（Vt）凝胶柱所能容纳的总体积洗脱体积（Ve）是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。它包括自加入样品时算起，到组分最大浓度出现时所流出的体积。 Ve一般是介于Vo 和Vt之间的。    对于完全排阻的大分子由于其不进入凝胶颗粒内， 故其洗脱体积 Ve Vo对于完全渗透的小分子由于它可以存在于凝胶柱整个体积内，故其洗脱体积 Ve Vt分子量介于

28、二者之间的分子，它们的洗脱体积也介于二者之间。洗脱容积Ve是自加入样品时算起，到组分最大浓度峰出现时所流出的容积，它与V0,Vi的关系为：式中Kd为分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数，只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒空隙的大小分布有关。上式可改写成：Kav是有效分配系数，对交联度小的凝胶Kav与Kd差别较小，而对交联度大的凝胶二者差别较大。Kav可用下式表示：根据凝胶层析原理，对同一类型化合物的特征与组分的分子量有关。流过凝胶柱时，按分子大小顺序流出，分子量大的走在前面。洗脱容积Ve是该物质分子量对数的线性函数：式中，为常数，为分子量。也可以用（有效分配系数）代替，与分子量的关系同上

29、式，只是常数不同。通常多以对分子量的对数作图得一曲线，称为“选择曲线”。如图4-2所示。选择曲线的斜率说明凝胶性质的一个很重要的特征。在允许的工作范围内，曲线愈陡，则分级愈好，而工作范围愈窄。凝胶层析主要决定于溶质分子量大小，每一类型的化合物如球蛋白类等都有自己特殊的选择曲线，可用于测定未知物的分子量，测定时以使用曲线的直线部分为宜。图4-2 球蛋白分子量选择曲线为了测定分子量，就必须知道一根特定柱的Vt，V0和Vi，从而计算出Kd，Kav等。V0可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液，如血红蛋白，印度黑墨水，分子量约200万的蓝色葡聚糖2000等有颜色的溶液，通过测定大分子物质的洗脱曲线，洗脱峰

30、峰顶洗出的体积就是该柱的V0值。选一种分子量小于凝胶工作范围下限的化合物，测出其洗脱体积Ve，减去V0就是Vi，常用硫酸铵来测定。Vt可用下式计算：为常数3.14，为柱直径，为凝胶床的高度。试剂和器材一、试剂1. 标准蛋白质混合液：1ml/组3mg/ml蓝色葡聚糖，8mg/ml肌红蛋白。溶剂为含15%（V/V）甘油的洗脱缓冲液。2. 洗脱液0.05mol/LTris盐酸溶液(pH7.5)，内含0.1mol/LNaCl：50ml 0.1mol/L Tris溶液与40.3ml 0.1mol/L盐酸混匀后，溶解0.585克NaCl，加水稀释至100ml，即得洗脱液3. Sephadex G-75二、

31、器材层析柱：柱管（直径1.01.3cm；管长50cm）1个/组，试管，玻璃棒，滤纸，移液管，（721分光光度计）试管架、铁架台操作方法一、一般操作方法1. 凝胶的处理（教师准备）将称好的干粉倾入过量的洗脱液中，在室温下放置，使之充分溶胀。为了缩短时间，可在沸水浴中加热将近100，这样可缩短溶胀时间至几小时，而且可以杀死细菌和霉菌，并排除凝胶内气泡。2. 装柱装柱前将凝胶上面过多的溶液倾出，用真空干燥器抽尽凝胶中空气。关闭层析柱出水口，并向柱管内加入约1/3柱容积的洗脱液，然后在缓慢搅拌下，将浓浆状的凝胶连续地倾入柱中，使之自然沉降，待凝胶沉降约23cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继

32、续沉集，待沉集的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口。接着通过23倍柱床容积的洗脱液使柱床稳定，然后在凝胶表面上放一张滤纸片或一团脱脂棉，以防将来在加样时凝胶被冲起，并始终保持凝胶上端有一段液体。3. 加样加紧上、下进出水口夹子，以防止操作压改变。用1ml移液管吸取1ml样品混合液，将移液管尖端小心插入柱中液面下方1cm处，小心释放样品，使其在脱脂棉上端形成一个层面，过程大约需要2分钟完成。看到样品层刚好完全流入凝胶床时，向柱上小心的添加缓冲液至合适高度（约5cm左右），以保证流速的稳定。（注意：不能使胶床上端无充裕的缓冲液，以防干裂）4. 洗脱洗脱时，打开上、下进出口夹子，先

33、收集10ml流出液，用洗脱液以每管4ml/管流速洗脱，用试管收集流出液，并对每管编号。当所有有色物质洗脱下来后，关闭螺旋夹停止洗脱。然后在对应的波长下读各管的光吸收值。二、蛋白质分子量的测定1. 测定V0和Vi将0.5ml蓝色葡聚糖2000和硫酸铵混合液（2mg/ml）上柱、洗脱，分别测出蓝色葡聚糖的洗脱体积Ve即为该柱的V0，硫酸铵的洗脱体积Ve即为该柱的Vi。蓝色葡聚糖的洗脱峰可根据颜色判断，硫酸铵的洗脱峰用Ba(Ac)2判断。2. 标准曲线的制作按上述方法将1ml标准蛋白质混合液上柱、洗脱，用试管收集。收集后，于以下对应波长下读各管的光吸收值：蓝色葡聚糖（蓝色）：650nm肌红蛋白（琥珀

34、色）：500nm以洗脱体积为横坐标，光吸收值为纵坐标作洗脱曲线。根据洗脱峰位置，量出每种蛋白质的洗脱体积（Ve），然后以蛋白质分子量的对数lgMr为纵坐标，Ve为横坐标，作出标准曲线。同时根据已测出的V0和Vi以及计算出的Vt，求出Kav。也可以Kav为横坐标，lgMr为纵坐标作出标准曲线。3. 未知样品分子量的测定将未知样品按标准曲线的条件操作。根据洗脱峰的位置，量出洗脱体积，也可以计算出Kav，分别由标准曲线查得样品的分子量。思 考 题1. 根据实验中遇到的各种问题，概述做好本实验的经验与教训。2. 凝胶过滤的介质有哪些，各过滤介质的异同是什么？3. 通过本次实验学习，讨论SDSPAGE和

35、凝胶过滤法测定蛋白质分子量的异同。实验5 DNA的琼脂糖凝胶电泳（4学时）目的要求1. 掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法。2. 学习利用琼脂糖电泳方法测定DNA片段大小。3. 学习有关建立DNA限制性内切酶图谱的基本技术。原 理DNA分子在碱性环境中（pH8.3缓冲液）带负电荷，外加电场作用下，向正极泳动。不同的DNA片段由于其电荷、分子量大小及构型的不同，在电泳时的泳动速率就不同，从而可以区分出不同的区带，电泳后经溴乙锭染色，在波长254nm紫外光照射下，DNA显橙红色荧光。琼脂糖凝胶电泳对DNA的分离作用主要依据DNA的分子量及分子构型，同时与凝胶的浓度也有密切关系。一定大小的DN

36、A 片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中，电泳迁移率不相同。不同浓度的琼脂糖凝胶适宜分离DNA片段大小范围见表1。因而要有效分离大小不同的DNA片段，主要是选用适当的琼脂糖凝胶浓度。不同构型的DNA在琼脂糖凝胶中的电泳速度差别较大。在分子量相当的情况下，不同构型的DNA移动速度次序如下：共价闭环DNA直线DNA开环的双链环状DNA。在同一浓度的凝胶中，分子量较小的DNA片段比较大的片段快。DNA片段的迁移距离（迁移率）与它的大小（分子量）的对数成反比。将未知DNA的迁移距离与已知分子大小的DNA标准物的电泳迁移距离进行比较，即可计算出未知DNA片段的大小。琼脂糖凝胶浓度/%可分辨的线性DNA大小范围/

37、kb0.36050.62010.7100.80.970.51.260.41.540.22.030.1表5-1 DNA大小范围与琼脂糖凝胶浓度的关系本实验采用限制性内切酶Hind或EcoR酶解DNA的片段为标准物，建立其酶切图谱，同时以酶解各片段的分子量为纵坐标，以它们对应的迁移率为横坐标，在半对数坐标纸上，连接各点绘制出测定DNA分子量的标准曲线。共价闭环质粒pBR322DNA只有一个EcoR酶切位点，酶解后成为一条线状DNA，通过琼脂糖凝胶电泳，测量酶解后线型DNA的迁移距离，可以直接在分子量标准曲线上得出其分子大小。试剂和器材一、试剂1. 限制性内切酶Hind、EcoR试剂盒 2. 标准D

38、NA：按使用说明配制3. 标准pBR322：按使用说明配制4. 酶反应终止液（10×0.1mol/L EDTA，20%Ficoll，0.25%溴酚蓝）：10L/组称取3.72克EDTA·Na2·2H2O，20克Ficoll，0.25克溴酚蓝，溶解后定容至100ml。5. 电极缓冲液（5×TBE）：用前稀释10倍称取10.88克Tris，5.52克硼酸，0.74克EDTA·Na2·2H2O，溶解后用蒸馏水定容至200ml。使用前用蒸馏水稀释10倍，称为TBE稀释缓冲液（0.5×TBE）。6. 溴乙锭（EB）染色贮存液（1mg/

39、ml）或者gold view溶液：将100mg溴乙锭溶于蒸馏水或电极缓冲液100ml，棕色瓶内封好，避光保存。EB是诱变剂，配制和使用时应戴手套，并且不要将该溶液洒在地面或桌面上。凡是沾污过EB的器皿或物品，必须经专门处理后，才能进行清洗或弃去。gold view溶液按照说明书配制7. 1%琼脂糖二、器材Eppendorf离心管，电泳槽，电泳仪，凝胶塑料托盘，小烧杯，移液器，一次性塑料手套，胶头滴管，紫外反射投射仪，洗瓶，大烧杯，量筒。操作方法一、DNA的酶解（参考）取2只清洁、干燥、无菌的Eppendorf管，编号，按照限制性内切酶Hind、EcoR试剂盒说明书用量，用微量注射器加入各种试剂

40、质粒DNA和pBR322，最后用双蒸水补足至20L，小心混匀。37水浴保温12h，然后各小管内加入2L的酶反应终止液，混匀，终止酶促反应，冰箱内保存备用。操作前各试剂用量要反复核对，保证准确无误，所加试剂用量很少，必须认真操作。实验中有DNA标样做对照二、1.0%琼脂糖凝胶板的制备1. 用配套挡板将凝胶塑料托盘短边缺口封住，置水平玻板或水平工作台面上，将样品槽模板（梳子）插进托盘长边上的凹槽内（距一端约1.5cm），梳齿底边与托盘表面保持0.51mm的间隙，安置好后保持静置状态。（挡板与托盘缝隙处可用胶带或者琼脂糖溶液封住）。2. 称取0.3克琼脂糖置于小锥形瓶中，加入30mlTBE稀释缓冲液

41、，在电炉上加热融化，一定要煮沸两次排尽气泡。3. 待琼脂糖冷却至放在手背不觉太烫手（约60）后，滴一滴EB或gold view，然后将琼脂糖溶液在靠近挡板一侧连续地倒入托盘内（注意中间不要间断），使凝胶缓慢而连续地展开直至在托盘表面形成一层约3mm厚均匀胶层（7.1×9.0cm）。胶内不要存有气泡，室温下静置约20分钟。4. 待凝固完全后，用小滴管在梳齿附近加入少量TBE稀释液润湿凝胶，双手均匀用力轻轻拔出样品槽模板（注意勿使样品槽破裂），则在胶板上形成相互隔开的样品槽。5. 取下封边的挡板，将凝胶连同托盘放入电泳槽平台上，倒入大量TBE稀释缓冲液直至浸没过凝胶面23mm，要防止样品

42、槽内窝存气泡，可以用微量注射器挑除。 图5-1 凝胶托盘的组装1. 托盘 2. 挡板 3. 梳子三、加样用微量注射器或移液枪将经酶切的样品液和未经酶切的样品液（要加2L的酶反应终止液）分别加入到胶板的不同加样槽内，每个槽（5×2×2.5mm）容积约为25L，因此加样量不要超过15L，避免因样品过多而溢出，污染邻近样品。加样时，注射器针头或枪头穿过缓冲液小心靠近加样槽底部，但不要损坏凝胶槽，然后缓慢地将样品推进槽内，让其集中沉于槽底部。加完一个样品后的微量注射器应反复洗净后才能用以加下一个样品，加完一个样品后移液器需要更换枪头。四、电泳加样完毕，将靠近样品槽一端连接负极，另一

43、端连接正极（千万不要搞错），接通电源，开始电泳。在样品进胶前可用略高电压，防止样品扩散，样品进胶后，应控制电压降不高于5V/cm。当染料带移动到距离凝胶前沿约1cm时，停止电泳。五、观察小心地取出凝胶置托盘上，将胶板推至预先浸湿并铺在紫外灯观察台上的玻璃纸内，在波长245nm紫外灯下进行观察。DNA存在的位置呈现橘红色或绿色荧光，可观察到清晰的条带。观察时应带上防护眼镜，避免紫外灯对眼睛的伤害。六、制作测定分子量标准曲线用卡尺量出DNAHind酶解各片段的迁移距离（cm），以DNA酶解各片段分子量为纵坐标，它们的迁移距离为横坐标，在半对数坐标纸上连结各点划出曲线，即为DNA分子量的标准曲线。D

44、NAHind酶解各片段大小见表5-2。片段碱基对数目（kb）道尔顿（×106）1234567823.1309.4196.5574.3712.3222.0280.5640.12515.06.124.262.841.511.320.370.08注 意 事 项1. 溴乙锭（EB）是诱变剂，配制和使用时应带乳胶手套，并且不要将该溶液洒在桌面或地面上。凡是沾污过EB的器皿或物品，必须经过专门处理后，才能进行清洗或弃去。2. DNA酶解过程中，使用的器具都应干净，并经消毒。配制时急需用灭菌的双蒸水，还要防止限制性内切酶被污染。3. 加样量的多少取决于加样槽最大容积。可以采用大小不同的样品槽模板以

45、形成容积不同的加样槽，加入样品的体积应略小于加样槽容积，为此，对于较稀的样品液应设法调整其浓度或加以浓缩。4. DNAHind酶解后应有8条带，但实际上只能看见6条，分子量小的2条带由于其荧光弱，往往看不见。思考题1. 名词解释：DNA；限制性内切酶；Marker2. 根据实验结果，解释琼脂糖凝胶电泳测定DNA片段大小的根据，聚丙烯酰胺凝胶电泳能否测定DNA分子的大小，它们的区别是什么？3. 说明DNA限制性内切酶图谱的构建在核酸研究和遗传工程等方面的应用价值。实验6 唾液淀粉酶的性质和活力测定（8学时）目的要求通过唾液淀粉酶性质的测定，了解酶的专一性和多种因素对酶促反应速度的影响，如：底物浓度、酶浓度、温度、pH值、激活剂和抑制剂等。通过对唾液淀粉酶活力的测定，学习酶活力、蛋白质含量的测定方法，及酶活力和比活力的计算方法。试剂和器材主要器材：可见光分光光度计、试