生物化学复习参考资料汇总

1、第一章 蛋白质第一节 蛋白质概论1、 蛋白质的概念：蛋白质是由20种左右L-氨基酸通过肽键相互连接而成的一类具有特定的空间构象和生物学活性的复杂高分子含氮化合物。特点：构造复杂、功能多样、分子量大、平均含氮量为16%、具有胶体性质和两性性质蛋白质的分类：按分子外形的不对称程度分两类：球状蛋白如血红蛋白、酶等纤维状蛋白如角蛋白、血纤维蛋白原等按组成分成两类：简单蛋白质分子中只有氨基酸结合蛋白质简单蛋白质+辅基构成主要有色蛋白、金属蛋白、磷蛋白、核蛋白、脂蛋白、糖蛋白 按溶解度分清蛋白（白蛋白）如血清清蛋白、球蛋白（拟球蛋白和优球蛋白）、组蛋白、精蛋白、醇溶蛋白、硬蛋白、谷蛋白 按营养价值不同分两

2、类： 完全蛋白质 不完全蛋白质 按蛋白质的功能分两类： 活性蛋白质和非活性蛋白质蛋白质的生物学功能 催化功能-酶或辅酶如淀粉酶、蛋白酶 调节功能-激素蛋白调节体内新陈代谢如胰岛素 结构成分或支持功能-结构蛋白如胶原蛋白、 a-角蛋白、丝纤蛋白等运输功能-运输小分子和离子如血红蛋白、色素蛋白、血清蛋白免疫防御功能-保护自身生命活动如免疫球蛋白、血纤维蛋白原及干扰素收缩或运动功能-鞭毛运动和肌肉收缩如肌动蛋白和肌球蛋白营养和贮存功能-为机体提供养料如醇溶蛋白、卵清蛋白、酪蛋白生物膜受体功能-接受和传递调节信息如激素受体蛋白和感觉蛋白（味蛋白）毒素蛋白-如细菌毒素、蛇毒等控制生长、分化和遗传功能-如

3、组蛋白、阻遏蛋白、表皮生长因子、DNA蛋白等(蛋白质是生命现象的体现者)第二节 氨基酸的结构分类及性质一. 氨基酸的结构特点1. 结构特征-氨基酸是含有NH2的有机酸（1） 都是-氨基酸；（2） 具有酸性的-COOH基及碱性的-NH2基，为两性电解质;（3） 除甘氨酸（R基是H原子）外，都是L-型氨基酸，具有旋光性；二.氨基酸的种类及其结构（1）常见氨基酸（编码氨基酸）甘氨酸Gly(G) 丙氨酸Ala(A) 缬氨酸Val(V) 亮氨酸Leu(L) 异亮氨酸Ile(I) 苯丙氨酸Phe(F) 酪氨酸Tyr(Y) 色氨酸Try,Trp(W) 丝氨酸Ser(S) 苏氨酸Thr(T) 半胱氨酸Cys(

4、C) 甲硫氨酸Met(M) 精氨酸Arg(R) 赖氨酸Lys(K) 组氨酸His(H)天冬氨酸Asp(D) 谷氨酸Glu(E) 天冬酰胺Asn(N) 谷氨酰胺Gln(Q) 脯氨Pro(P)（2）稀有氨基酸:羟脯氨酸(Hyp) 羟赖氨酸(Hyly) 胱氨酸(Cys)根据R基团的结构或性质特点，巧记20种氨基酸的口诀： 甘、丙、缬、亮、异、脂链，（脂肪链R基团的5种） 丝、苏、半、蛋、羟硫添。（含-OH， -S者共4种） 天、谷、精、赖、组、酸碱；（酸性碱性者5种） 脯、酪、苯、色、杂芳环（芳香环和杂环R集团者4种） 门冬酰胺、谷酰胺，（两种酰胺） 都有密码属“常见”。（常见氨基酸都有特异的遗传密

5、码）三 .氨基酸的分类（一）分类-氨基酸的四种分类方法1.根据氨基酸的酸碱性质分类（1）中性氨基酸： 分子中含一个氨基，一个羧基； 15种，最简单为Gly；（2）酸性氨基酸：分子中含一个氨基，两个羧基； Asp， Glu；（3）碱性氨基酸：分子中含两个氨基，一个羧基； Lys、 Arg、His；2.根据R基团的化学结构分类（1）脂肪族氨基酸：Gly, Ala, Val, Leu, Ile，Ser, Thr, Cys, Met, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys,Arg；（2）芳香族氨基酸： Phe, Tyr, Try；（3）杂环氨基酸： His；（4）杂环亚氨基酸： Pro；3.

6、根据R基团的极性分类（1）非极性氨基酸 脂肪烃侧链 Ala, Val, Leu, Ile； 芳香环 Phe, Trp ； 含硫氨基酸：Met， Cys ； 亚氨基酸： Pro（2）极性氨基酸 极性不带电氨基酸： Ser， Thr， Tyr； Asn， Gln； Cys； 极性带正电荷的氨基酸3种： Lys， Arg， His； 极性带负电荷的氨基酸2种： Asp、 Glu； 4.根据营养功能分类（1）必需氨基酸：人体和动物生长发育所必需的，但自身不能合成，必需由食物中供给的氨基酸:赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、缬氨酸。（2）非必需氨基酸:人体可以自己合成，不需要从

7、食物中获取。（3）半必需氨基酸: 组氨酸、精氨酸和酪氨酸（儿童必需的氨基酸）5. 蛋白质中不常见的氨基酸 羟脯氨酸、羟赖氨酸、肉氨酸（ N-甲基甘氨酸）、磷酸丝氨酸等四、氨基酸的性质例题 向1升1mol/L的处于等电点的甘氨酸溶液加入0.3molHCl，问所得溶液的pH是多少？如果加入0.3molNaOH以代替HCl时，溶液的pH将是多少？解：羧基解离常数pK1=2.34, 氨基解离常数pK2=9.60加入0.3 molHCl时，pH=pKa+lg质子受体/ 质子供体=2.34+ lg(1-0.3)/0.3 = 2.71;加入0.3 molNaOH时，pH=pKa+lg 质子受体/ 质子供体=

8、9.60+ lg0.3/(1- 0.3) = 9.23; 与甲醛反应甲醛滴定法；用于测定-氨基氮；氨基酸的氨基与甲醛形成一羟甲基衍生物和二羟甲基生物，氢离子一次放出，可用酚酞为指示剂，用滴定法定量测定-氨基氮。 与酰化试剂反应: 氨基酸的氨基与酰氯或酸酐在弱碱溶液中发生作用时，氨基即被酰基化。例如与苄氧甲酰氯反应：与5 -二甲基奈-1-磺酰氯（ DNS-Cl）反应，产生有荧光的DNS-氨基酸；鉴定氨基酸或多肽、蛋白质的N末端氨基酸； 与2，4-二硝基氟苯的反应：氨基酸+DNFBDNP-氨基酸（黄色），鉴定氨基酸或多肽、蛋白质的N末端氨基酸； 与异硫氰酸苯酯（ PITC）的反应-Edman法测氨

9、基酸序列的原理；用于测定N-末端氨基酸弱碱： PTC-氨基酸；酸性： PTH-氨基酸 形成西夫碱-羰胺反应（美拉德反应），食品褐变；4、由-氨基和-羧基共同发生的反应5. 氨基酸侧链基团参加的反应（见蛋白质） 米伦反应酪氨酸反应呈红色 福林反应酪氨酸反应呈蓝色 坂口反应精氨酸反应呈红色 Pauly反应组氨酸、酪氨酸反应呈橘红色 乙醛酸反应色氨酸反应在界面呈紫红色 半胱氨酸的反应与亚硝酸-铁氰化钠的甲醇溶液反应呈红色四 .氨基酸的分离制备和用途（一）氨基酸的分离 1.纸层析法 2.柱层析法 3.薄层层析法 4.电泳法 5.氨基酸自动分析仪（二）氨基酸的制备1.水解蛋白质法 2.人工合成法 3.微

10、生物发酵法（三）氨基酸的用途1.科学实验 2.医药卫生 3.工农业第三节 蛋白质结构一、1.蛋白质的一级结构 蛋白质的一级结构指肽链中氨基酸的排列顺序和连接方式； 稳定一级结构的化学键：肽键；2. 一级结构的测定氨基酸序列的自动程序测定片段重叠法 其大体步骤为： 测定蛋白质中氨基酸组成和含量； 进行末端分析，确定该氨基酸的肽链数目、 N-末端、 C-末端（1） N-末端分析： DNFB法、 PITC法（ Edman法）、 DNS法、氨肽酶法（2） C-末端分析：肼解法、羧肽酶法； 肽链的拆分，采用蛋白质变性剂或巯基乙醇； 应用两种或两种以上不同的水解方法将所要测定的蛋白质肽链断裂，各自得到一系

11、列大小不同的肽段；（1）溴化氰裂解法：水解甲硫氨酸羧基形成的肽键；（2）酶水解法：例如：胰蛋白酶：主要作用于碱性氨基酸（ Lys、 Arg）羧基形成的肽键；胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）：专一性水解疏水性氨基酸的羧基形成的肽键；胃蛋白酶：断裂键两侧的氨基酸都是疏水性氨基酸，如PhePhe； 分离纯化部分降解的肽片段，分析每一片段的氨基酸组成和排列顺序； Edman降解法和酶水解法。 确定二硫键的位置； 根据重叠肽的氨基酸顺序，推断出完整肽的氨基酸顺序；例题： 第一套肽段：QGS PS EQVE RLA HQWT； 第二套肽段：SEQ WTQG VERL APS HQ；N末端H肽段，C末端为S肽段；

12、则多肽链的顺序：HQWT QGS EQVE RLA PS；二、蛋白质的空间结构 除一级结构外，蛋白质的二、三、四级结构都属于空间结构，即构象（ conformation） 。 蛋白质构象通常由非共价键（次级键） 维系。（一）维系蛋白质空间结构的化学键 氢键、离子键、 范德华力、疏水相互作用力、二硫键、酯键、金属键（配位键）1. 氢键：氢键（ hydrogen bond） 的形成常见于连接在一电负性很强的原子上的氢原子，与另一电负性很强的原子之间，如 >C=O H-N<。2. 疏水键： 非极性物质在含水的极性环境中存在时，会产生一种相互聚集的力，这种力称为疏水键或疏水作用力 （hyd

13、rophobicinteraction） 。3.离子键：又称为盐键（ salt bond） 是由带正电荷基团与带负电荷基团之间相互吸引而形成的化学键。4.范德华氏引力（van derWaals force)：原子之间存在的相互作用力。（二） 蛋白质的二级结构 蛋白质的二级结构是指多肽链的主链骨架在盘绕折叠是依靠氢键维持固定形成的有规律的空间排布， 二级结构与侧链R的构象无关，仅限于主链原子的局部空间排列。维持二级结构稳定的作用力主要是氢键。 蛋白质立体结构原则：1. 由于C=O双键中的电子云与N原子上的未共用电子对发生“电子共振”，使肽键具有部分双键的性质，不能自由旋转。2. 与肽键相连的六个

14、原子构成刚性平面结构。但由于a-碳原子与其他原子之间均形成单键，因此相邻的平面结构可以作相对旋转。蛋白质的二级结构类型-螺旋结构 -折叠结构 -转角结构 自由回转结构 胶原三螺旋 影响a-螺旋形成和稳定的因素：（1）氨基酸R基所带电荷性质；多聚赖氨酸在pH7时以无规卷曲形式存在，在pH12时，赖氨酸即自发形成-螺旋结构。（2） R基的大小连续两个或两个以上Ile、 Val、 Leu，大R基，不易形成螺旋；（空间位阻）连续的几个Ser或Thr，会破坏 -螺旋；多肽链存在脯氨酸， -螺旋即被中断，形成一个“节结”；2.-折叠结构（ b-pleated sheet）(1)-折叠又称为-片层结构，两条

15、或多条几乎完全伸展的多肽链侧向聚集在一起，相邻肽链主链上的氨基和羰基之间形成有规则的氢键，维持这种片层结构的稳定性。3.转角（-turn） 的结构特征：-转角是多肽链180°回折部分所形成的二级结构，约占转角结构的75。 主链骨架本身以大约180°回折; 回折部分通常由四个氨基酸残基构成; 构象依靠第一残基的-CO基与第四残基的-NH基之间形成氢键来维系。4. 无规卷曲（ random coil） 无规卷曲（ 自由回转结构）为没有一定规律的松散肽链的转角结构，约占25%。 对于特定的蛋白质分子而言，其无规卷曲部分的构象则是特异的。例题：一蛋白质由a-螺旋和b-折叠结构组成，

16、分子量为240000，肽链外形长为506nm，氨基酸残基平均分子量为120，计算a-螺旋和-折叠构象所占比率。1 蛋白质的总氨基酸残基数= 240000/120 = 20002 设具有a-螺旋构象的氨基酸残基数为X，则有：506 = 0.15X + 0.35(2000-X) X = 9723 a-螺旋构象所占比率= 972/2000 = 48.6%(三 ) 超二级结构和结构域 超二级结构：蛋白质分子中，肽链主链形成的二级结构互相靠近，形成的二级结构聚集体。 a-螺旋构象的聚集体（ a a型） a-螺旋和b-折叠构象的聚集体（b a b型） b-折叠构象的聚集体（b b b型和b cb型）(四)

17、 蛋白质的三级结构 蛋白质的三级结构：多肽链在二级结构、超二级结构及结构域的基础上，由于侧链基团间的相互作用而进一步盘旋或折叠形成的空间构象。 维持蛋白质三级结构的主要作用力：疏水作用力以及离子键、氢键、范德华力、配位键等。（五）蛋白质的四级结构蛋白质的四级结构（ quaternary structure）在由多条肽链构成的蛋白质分子中，具有三级结构的蛋白质分子亚单位（亚基） 彼此通过次级键相互连接聚合起来形成的空间构象。（就是指蛋白质分子中亚基的种类、数量以及各个亚基在寡聚蛋白质中的空间排布，亚基间的相互作用与接触部位的布局。）亚基（subunit） 就是指参与构成蛋白质四级结构的、每条具有

18、三级结构的多肽链。维系蛋白质四级结构的是盐键、疏水键、氢键、范氏引力等非共价键。血红蛋白的变构当血红蛋白的一个a亚基与氧分子结合以后，可引起其他亚基的构象发生改变，对氧的亲和力增加，从而导致整个分子的氧结合力迅速增高，使血红蛋白的氧饱和曲线呈“S”形。&变构效应：这种由于蛋白质分子构象改变而导致蛋白质分子功能发生改变的现象称为变构效应（allosteric effect） 。小结：蛋白质分子的结构层次一级结构（氨基酸排列顺序） 二级结构（-螺旋、-折叠、-转角、无规卷曲） 超二级结构（二级结构单位的集合） 结构域（在空间上可以明显区分的区域） 三级结构（球状蛋白质中所有原子的空间位置）

19、 四级结构（复合蛋白质的结构特征，亚基的聚集体）第五节 蛋白质的理化特性一、两性解离与等电点 两性解离：末端羧基、氨基及侧链基团均可解离 等电点：调节缓冲液的pH值使蛋白质恰成两性离子,所带正负电荷相等即净电荷为零，则其在电场中不移动,此时溶液的pH值就是该蛋白质的等电点，用pI表示。等电点时特点：（1）净电荷为零（2）一定离子强度的缓冲液等离子点是蛋白质的特征常数（3）多数蛋白质在水中等电点偏酸碱性AA/酸性 AA 等电点胃蛋白酶 0.2 1.0血红蛋白 1.7 6.7细胞色素C 2.9 10.7菊糖酶 0.34 8.2（4）导电性、溶解度、黏度及渗透压都最小。等电沉淀和蛋白电泳：迁移率与净

20、电荷量、分子大小、分子形状等有关二.胶体性质1.蛋白质具有胶体溶液所具有的性质： 布朗运动、丁道尔现象、不能透过半透膜、具有吸附力等2.使蛋白质形成胶体溶液的两个因素：（1）水膜-通过氢键与水结合（2）电荷-在非等电点状态下， 带同性电荷蛋白质分子互相排斥。 带电的胶体颗粒在电场中可以向电荷相反的电极移动。由于蛋自质在溶液中解离成带电的颗粒，因此在电场中能移动，这种大分子化合物在电场中移动的现象称为电泳。 蛋白质电泳的方向、速度主要决定于其所带电荷的正负性、所带电荷的多少以及分子颗粒大小。 各种蛋白质的等电点不同相对分子质量大小，颗粒大小也各不向，在一个指定的PH值溶液中、各种蛋白质所带电荷不

21、同，在电场中移动的方向和速度也各不相同。根据这一原理， 就可以从蛋白质混合液中将各种蛋白质分离开来。因此电泳法通常用于实验室、生产、或临床诊断来分析分离蛋白质混合物或作为蛋白质纯度鉴定的手段。3.蛋白质凝胶 凝胶作用-蛋白质颗粒周围的水膜是不均匀,使它们以一定的部位结合形成长链。这些长链有彼此结合成为复杂的网状结构的凝胶体。 溶胶-蛋白质作为分散相，水为连续相形成的溶液。 凝胶-蛋白质为连续相，水为分散相形成的网状凝胶体。 凝胶具有胀润作用 分类：（1）可逆性凝胶 （2）不可逆性凝胶 部分破坏水化膜、适当加热和远离等电点4.蛋白质胶体性质的应用 渗析（透析） 超滤三、蛋白质的沉淀作用 沉淀作用

22、-外加一些因素去除蛋白质胶体的稳定因素后，使蛋白质从溶液中析出的作用。 沉淀种类：可逆与不可逆 沉淀方法：（一）沉淀后蛋白质仍能保持生物活性的沉淀方法1 中性盐（ 氯化钠，硫酸铵，硫酸钠等）沉淀-盐析盐溶作用：中性盐（如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）对蛋白质的溶解度有显著的影响，当浓度较低时，中性盐可以增加蛋白质的溶解度，此现象称为盐溶。盐析作用：蛋白质溶液是一种胶体溶液，加入高浓度的中性盐后可以吸去胶体外层的水，减低蛋白质与水的亲和力而使蛋白质沉淀，此作用称盐析；在制备蛋白质上甚为重要。分段盐析作用：不向蛋白质盐析时所需的盐浓度不同，因此调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出，这种

23、方法称为分段盐折；如血清中加硫酸铵至50饱和度，则球蛋白先沉淀析出；继续再加硫酸铵至饱和，则清蛋白(白蛋白)沉淀析出。作用机制:中和电荷的同时破坏水化膜;优点：保持蛋白质活性盐析应用举例：加中性盐沉淀蛋白质(盐析)2. 有机溶剂沉淀法作用机制:破坏水化膜，降低介电常数；处理条件：低温操作、沉淀完全后尽快分离；3.有机溶剂沉淀法 作用机制:竞争性破坏水化膜，降低介电常数； 可保持活性的处理条件：低温操作；沉淀完全后尽快分离 低温时，用丙酮脱水，还可保存原有的生物活性，但用乙醇脱水，时间较长后可使蛋白质变性。用70酒精消毒就因其能更好地扩散到整个细菌的体内，使蛋白质变性沉淀。比70 稀的酒精，沉淀

24、力太弱，95的酒精，吸水力强，与细菌接触时细菌表面的蛋白质立即沉淀，因此酒精不能继续扩散到细菌体内，不能使细菌死亡。（二）沉淀后蛋白质失去生物活性的沉淀方法1 重金属盐沉淀法：蛋白质在碱性溶液中带负电荷，可与重金属离子如Zn2+Cu2+ Pb2+ Fe3+等作用，产生重金属蛋白盐沉淀；如铅盐及汞盐在NaoH溶液中皆可使蛋白质沉淀；铅中毒或汞中毒时，可服蛋白质使与该重金属结合呕出，有解毒作用。2 生物碱试剂沉淀法（除蛋白作用）：生物碱试剂如单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸和三氯醋酸等皆能沉淀蛋白质 其沉淀原理是：一般生物碱试剂皆为酸性物质，而蛋白质在酸性溶液中带正电荷，故能与带负电荷的酸根相结合，成为

25、溶解度很小的盐类； 临床化验常利用此类试剂沉淀血中的蛋白质(用磷钨酸、三氯酯酸)以制得血滤液，或用苦味酸 检验尿中的蛋白质。3 热凝固沉淀法4 抗体对抗原蛋白质的沉淀： 抗体蛋白质遇异体的特异性抗原蛋白质即起沉淀(或凝聚)，使外来蛋白质失其生物作用； 这就是免疫注射(打预防疫苗)的科学依据；关于抗体沉淀抗原的方式，研究认为是由于抗体蛋白质同抗原蛋白质两者分子结构上的互补性。它们之间的结合是以抗原为模板，抗体折叠在模板上而以氢键相连接，产生沉淀； 抗原抗体反应有种属专一性。即一种抗体只能对种特定的抗原起作用，因此，通过抗原抗体反应，可以鉴定生物的种属。四蛋白质的变性作用与复性（一）蛋白质变性的概

26、念天然蛋白质受物理或化学因素的影响，有序的空间结构被破坏，从原来有秩序的紧密卷曲结构变成无秩序的松散伸展状结构，致使生物活性丧失，并伴随发生一些理化性质的异常变化，但一级结构并未破坏。这就是蛋白质的变性作用。（二）变性的可逆性与复性复性：某些蛋白质变性后可以在一定的实验条件下重新形成原来的空间结构，并恢复原来部分理化特性和生物学活性，这个过程称为蛋白质的复性（renaturation）。可逆变性：变性条件除去后仍可恢复天然状态的变性。不可逆变性：变性条件除去后不能恢复天然状态的变性。（三）变性因素及作用机制1 变性理论：蛋白质的变性就是天然蛋白质分子中肽链的高度规则的紧密排列方式因氢键及其他次

27、级键的破坏而变成不规则的松散排列方式。2 变性因素及机制（1）热变性：热变性的定义、热变性三个阶段、影响热变性的因素:温度、砂糖、 H+浓度、蛋白质含水量、电解质；（2）浓酸、碱变性 （3）有机溶剂 （4）尿素 、胍 （5）重金属等（6）机械搅拌 （7）紫外线（四）变性蛋白质的性质：溶解度降低、生物活性丧失、结晶能力下降、不对称性增加，黏度增加、呈色反应加强、容易被酶消化（五）蛋白质热变性、沉淀及凝固的关系蛋白质的凝固作用：蛋白质变性后，所得的变性蛋白质分子互相凝集或相互穿插缠绕在一起的现象成为蛋白质的凝固。凝固作用分两个阶段，首先是变性，其次是失去规律性的肽链聚集缠绕在一起而凝固或结絮。（六

28、）蛋白质变性的应用五蛋白质的颜色反应 双缩脲反应：双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物；双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应产生红紫色络合物，此反应称双缩脲反应；蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似的肽键，因此也能起双缩脲反应，形成红紫色络合物；通常可用此反应来定性鉴定蛋白质，也可根据反应产生的颜色在540nm处比色，定量测定蛋白质。 茚三酮反应 黄色反应-芳香族氨基酸的特有反应：蛋白质溶液遇硝酸后，先产生白色沉淀，加热则白色沉淀变成黄色，再加碱，颜色加深呈橙黄色，这是因为硝酸将蛋白质分子中的苯环硝化，产生了黄色硝基苯衍生物； 是有芳香族氨基酸，特别是含有酪氨酸和色氨含酸的蛋白质所特有的呈色反应；

29、 如皮肤、指甲和毛发等遇浓硝酸会变成黄色。 福林酚试剂反应：福林试剂中含有磷钼酸及磷钨酸；蛋白质分子一般都含有酪氨酸，而酪氨酸中的酚基能将磷钼酸及磷钨酸还原成蓝色化合物(即钼蓝和钨蓝的混合物)；这一反应常用来定量测定蛋白质含量。 米伦氏反应酪氨酸的特有反应：米伦试剂为硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸和亚硝酸盐的混合液；蛋白质溶液加入米伦试剂后即产生白色沉淀，加热后沉淀变成红色；酚类化合物有此反应，酪氨酸含有酚基，放酪氨酸及含有酷氨酸的蛋白质都有此反应。 乙醛酸反应色氨酸的特有反应：在蛋白质溶液中加入乙醛酸，并沿试管壁慢慢注入浓硫酸，在两液层之间就会出现紫色环；凡含有吲哚基的化合物都有这一反应；色氨酸及含

30、有色氨酸的蛋白质有此反应， 不含色氨酸的白明胶就无此反应。 坂口反应精氨酸特有的反应：精氨酸分子中含有胍基，能与次氯酸钠(或次溴酸钠)及a -萘酚在氢氧化钠溶液中产生红色产物；此反应可以用来鉴定含有精氨酸的蛋白质，也可用来定量测定精氨酸的含量。六蛋白质紫外吸收性质一般蛋白质在280nm波长处都有吸收峰，利用这特异性的吸收，对蛋白质进行定性和定量检测。蛋白质浓度（ mg/ml） =1.45A2800.74A260第六节 蛋白质的分离、纯化与测定一、 分离纯化的基本方法1、盐析与等电点沉淀-根据溶解度不同的分离方法2、离子交换层析法-根据电荷不同的分离方法离子交换纤维素（ P56）3、凝胶过滤法-

31、根据分子量、分子形状不同的分离方法（ P57）4、亲和层析-根据特异性亲和力不同的分离方法5、高效液相色谱法（ HPLC）6、疏水色谱二、 蛋白质含量的测定1.凯氏定氮法 2.双缩脲法 3.福林酚试剂法 4.紫外吸收法 5.染料结合法三、 蛋白质的纯度鉴定1、在不同pH条件下电泳为一条带 2、等电聚焦电泳为一条带3、经纯化后的蛋白质应不失去生物活性 4、超速离心为单一沉降速度四、 蛋白质分子量测定1、凝胶过滤法 2、 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 3、根据某一元素量已知，计算最低分子量第二章 核酸第一节 概述一、核酸的定义：生物体内一类含有磷酸基团的重要生物大分子，是遗传变异的物质基础，是遗传

32、信息的载体，在蛋白质的生物合成中起重要的作用。二、核酸的分类：DNA：遗传信息的主要载体（1）主要在细胞核中；（线粒体、叶绿体、质粒） （2）存在于DNA病毒中；RNA： RNA在蛋白质生物合成过程中起着重要的作用（1） 细胞质中的RNA 核糖体 RNA（ribosomal RNA, rRNA） 转运 RNA（transfer RNA ,tRNA） 信使 RNA（message RNA, mRNA） 小胞浆 RNA（scRNA, small cytosolRNA） 线粒体 RNA 叶绿体 RNA（2）细胞核中的RNAhnRNA（ heterogeneous nuclear RNA） 不均一RN

33、AsnRNA（ small nuclear RNA），小核RNA；chRNA（ chromosome RNA），染色体RNA；（3）病毒RNA第二节 核酸的化学组成一、核酸的水解：（核苷酸是核酸的基本结构单位）核酸à核苷酸（碱基戊糖磷酸）à核苷（碱基戊糖）+ 磷酸à嘌呤和嘧啶（碱基）+ 核糖或脱氧核糖（戊糖）二、核苷及核苷酸1、核苷(戊糖+碱基):碱基和核糖的缩合物，以C-N糖苷键相连；成苷位置：核糖C-1与嘧啶N-1；核糖C-1与嘌呤N-9。核苷： 腺苷A，鸟苷G，胞苷C，尿苷U；脱氧核苷： 脱氧腺苷dA，脱氧鸟苷dG，脱氧胞苷dC，脱氧胸苷dT；2、核苷酸（核

34、苷的磷酸酯）（1）核苷酸的结构（2）核苷酸的种类：核糖核苷酸：5-AMP，5-GMP，5-CMP，5-UMP；脱氧核苷酸：5-dAMP，5-dGMP，5-dCMP，5-dTMP；（3）核苷酸种类的表示方法:Np和pN如Ap表示3-腺苷酸，pA表示5-腺苷酸; 细胞内游离核苷酸及其衍生物3、含高能磷酸键的ATP类化合物（ATP是能量的直接供体）（脱氧）核苷三磷酸是合成 DNA和RNA的原料；ATP、GTP、CTP、TTP、UTP；ADP、GDP、CDP、TDP、UDP；参加合成代谢：UTP-糖类合成、GTP-蛋白质合成、CTP-脂类合环状核苷酸（ cAMP、cGMP）第三节 核酸的分子结构一、1

35、.一级结构定义：指核酸分子中单核苷酸的连接方式和排列顺序。连接方式-磷酸二酯键：由一个核苷酸的5磷酸基与另一核苷酸3-OH基脱水相连成3，5-磷酸二酯键 (-C3-O-P-O-C5-),2.无分支3.戊糖和磷酸构成其骨架；l 3 末端-具有3 -磷酸基(或羟基)的(写在右边)l 5 末端-具有3 -磷酸基(或羟基)的(写在左边)4.核酸的水解作用（1）水解方式碱法、酸法和酶法（2）碱水解 RNAà2-核苷酸 + 3-核苷酸 DNAàDNA变性但不被水解（3）酸水解 DNAà无嘌呤的DNA分子 （pH4） DNA（RNA）à碱基+戊糖+磷酸（强酸高温）（4

36、）核酸酶的水解作用核酸酶-水解核酸磷酸二酯键的酶种类根据作用的底物分：脱氧核糖核酸酶（DNase） ：(DNase根据底物不同分三种)§ ssDNA(单链DNA)为底物、 dsDNA(双链DNA)为底物、 单、双链DNA均作用 核糖核酸酶（RNase）根据核酸酶对底物作用特点分：核酸内切酶 核酸外切酶核酸的高级结构二、DNA的二级结构1.DNA分子的大小：碱基对（bp）、分子量； DNA的碱基组成特点双链DNA分子中，A=T，G=C，A+G=C+T碱基组成有种的特异性，无组织、器官特异性，且不受年龄、营养和环境的影响。2.典型的双链DNA 二级结构DNA右手双螺旋结构模式的设计者：W

37、atson与Crick，1953年。设计主要依据：对DNA分子X射线衍射图分析、碱基摩尔含量的比率关系、四种碱基的理化数据分析3.经典的右手双螺旋模式要点(B型DNA） :两条反向平行的多核苷酸链围绕同一中心轴形成右旋的双螺旋结构,两条链之间通过碱基间氢键连接。碱基位于双螺旋的内侧，碱基对平面垂直于中心轴，；磷酸和核糖在外侧，平行于中心轴；碱基配对：原则A=T，G=C；螺旋参数：每螺旋10对，螺距为3.4nm；双螺旋直径为2.0nm。双螺旋有一条小沟和一条大沟；例题1： 1 双链DNA分子量为3×107，计算： a DNA的长度b 含多少圈螺旋c 分子的体积（每对核苷酸残基平均分子量

38、为618）解： a L= 3×107/618 ×0.34 b n= 3×107/618 ÷10 c V=3.14 ×1.02 × 3×107/618 ×0.34例题2: 已知某DNA溶液,碱基A占16%, 求其余碱基所含的比例。解：因为， A=T， G=C 所以， T=A=16% G=C=50%-16%=34%例题3：已知DNA分子的一条链碱基顺序为： 3GCTACGA, 写出其互补链的碱基顺序。4、DNA双螺旋结构的稳定因素（1）氢键 （2）碱基堆积力 （3）离子键5、其他双螺旋DNA类型的主要特征A、C型：右手

39、螺旋； Z型DNA：左手螺旋，12个碱基对；三、DNA的三级结构DNA的右手双螺旋结构进一步扭曲形成超螺旋结构：A. DNA超螺旋 B. 共价闭合环 C. 卷饶不足的共价环 D. 松弛型的开环RNA的二、三级结构1、tRNA的二级结构：tRNA分子结构与其它RNA一样，都是单链结构，局部区域碱基配对形成双螺旋，约占4070%，配对不象DNA那样严格，非螺旋区形成突环。研究发现tRNA多具有类似的二、三级结构。2、tRNA的三叶草型二级结构模型（1）tRNA分子量约25000，由7090核苷酸组成，沉降系数为4S。（2）为三叶草型，有四个臂（双螺旋区）和四个环（单链突起区）（3）含有许多稀有碱基

40、3、tRNA的三级结构：（1）在三叶草型二级结构基础上，扭曲形成倒L型。（2）氨基酸接受臂与反密码子环分别位于两端；分子上有两个双螺旋区；构象靠非螺旋区的碱基之间的氢键维持。第四节 核酸的性质一.核酸的一般性质1、纯品外观：DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末；2、溶解性：DNA、RNA及核苷酸为极性化合物，溶于水，不溶于有机溶剂； 影响DNA、RNA的溶解度-利用此原理分离； 应用：0.14摩尔法分离DNA蛋白和RNA蛋白，在此条件下RNA蛋白溶解度大。3、味感：酸 4、分子量大， DNA 1069， RNA几万-几百万。 5、旋光性： DNA为右旋物质，比旋值+150 6、粘度： DN

41、A>RNA（ DNA分子轴长与宽度之比为107 ，分子不对称性大） 7、亲水胶体二.核酸的解离核酸、核苷酸的两性性质都为两性电解质，具有等电点；核酸在pH>4时，带负电荷；可以用离子交换分离三、核酸的紫外吸收性质1、紫外吸收性质max=260nm2、应用 纯度测定： 纯DNA，O.D260/280>1.8；纯RNA，>2.0； 定量测定：摩尔消光系数法，比消光系数法，摩尔磷原子消光系数法e(p)；3、增色效应和减色效应四、核酸的变性、复性及杂交（一）核酸的变性 1、 变性：天然核酸受到某种因素的影响，其双螺旋的氢键断裂，碱基堆积力不再存在，变成无规则线团状的单链DNA；

42、 2、变性后果生物活性丧失DNA溶液粘度降低；比旋值下降；沉降速度增加；浮力密度上升； 紫外吸收加强增色效应；3、变性因素（1）热变性和Tm值； Tm值：当A260值达到最大值一半时所对应的温度；影响的因素： 样品的均一性； G-C含量：（G+C）%=（Tm值-69.3）*2.44；（2）极端pH和极低的离子强度 （3）化学试剂：如尿素（二）DNA的复性和分子杂交1、复性：变性DNA在适当条件下，又可使两条彼此分开的链缔合成双螺旋结构，这一过程称为复性。影响复性的因素： 盐浓度、温度、复性速度与DNA的浓度成正比、复性速度与顺序的复杂性和长度有关 C0t 1/22、分子杂交 Southern印

43、迹法五、核酸的含量与纯度测定（一）核酸含量的测定1、定磷法2、定糖法 RNA与甲基间苯二酚反应蓝绿色 DNA与二苯胺反应蓝色（二）DNA纯度的鉴定1、紫外吸收2、凝胶电泳六、核酸的分离、纯化（一）核酸的工业化生产（二）活性核酸的制备注意一般原则：低温（0-4），避免强酸、强碱和剧烈搅拌；抑制核酸酶的作用；用有机溶剂抽提以去除蛋白；乙醇沉淀；第三章 酶化学第一节 酶的一般概念一、酶的定义：酶（ enzyme） 是由活细胞产生的、能对特异底物进行高效率催化的生物催化剂，其化学本质是蛋白质。二、酶的来源与分布酶是由生物细胞产生的，然后按照需要分布在细胞内和细胞外。根据酶的活动部位，一般把酶分成：胞内

44、酶-由细胞产生并在细胞内部起作用的酶。（如氧化还原酶等）胞外酶-由细胞产生后分泌到细胞外起作用的酶。如水解酶类三、酶催化作用的特点1、酶与一般催化剂的共同点： 能加速化学反应速率，用量少而催化效率高； 在反应过程中本身不被消耗； 只能催化热力学上允许进行的化学反应，降低反应的活化能； 只能缩短反应达到平衡所需的时间，不能改变平衡点； 对可逆反应的正反两个方向的催化作用相同。2、酶作为生物催化剂的特性： 酶的催化反应条件温和酶能在常温常压和pH近中性的条件下起催化作用，这是酶作为生物催化剂所必备的条件。 酶具有很高的催化效率酶的催化活性比一般催化剂高10620倍。3. 酶具有高度专一性酶只能作用

45、于某种物质或某一类结构相似的物质，催化它们进行某种类型的反应。 即酶对其所催化的反应和反应物具有严格的选择性。这种现象称为酶作用的特异性。1. 酶的催化反应条件温和2. 酶具有很高的催化效率3. 酶具有高度专一性4. 酶的催化活性在体内受到多种因素调节控制（酶的调节方式包括抑制剂调节、共价修饰调节、 反馈调节、酶原激活及激素控制等，这些方式的存在使得生物体的代谢过程有条不紊地进行。）5. 酶的催化活力与辅酶、辅基及金属离子有关四、酶的化学本质及其组成（一）酶的化学本质（重点）：绝大部分酶是由生物细胞产生的，具有催化活性和高度专一性的特殊蛋白质。因此， 酶的化学本质是蛋白质。（具有催化功能的核酸

46、是特例。）（二）酶的组成和辅助因子：全酶 = 酶蛋白 + 辅助因子Ö 酶蛋白-不能单独表现催化活性的蛋白质部分。与底物结合，决定反应的专一性和高效率。Ö 辅助因子-结合酶中的非蛋白质部分（包括辅酶、辅基和金属离子） 。直接对电子、原子或某些化学基团起传递作用， 决定反应的类型。Ö 金属离子为催化活性中心的组成部分；搭桥作用：在酶与底物分子间起桥梁作用；稳定构象： 帮助酶分子形成酶活性所必需的构象；Ö 辅酶-与酶蛋白疏松结合并与催化活性有关的 耐热低分子有机化合物称为辅酶(coenzyme)。用透析方法可除去。Ö 辅基-与酶蛋白牢固结合并与催化活

47、性有关的耐热低分子有机化合物称为辅基(prostheticgroup)。用透析的方法不易除去。酶蛋白与辅酶（基）的结合有一定专一性五、酶的分类和命名一、1.分类（按结构）: Ö 单体酶：由一条肽链构成的酶Ö 寡聚酶：由几个至几十个亚基构成的酶，分子量3.5万几百万Ö 多酶体系：由几种酶彼此嵌合形成复合体,有利于一系列反应的进行.如脂肪酸合成酶系.由7种酶围饶着小分子物质-酰基载体蛋白(ACP)形成球状,其中若1种酶失活或解体,则丧失整个活性.2.根据酶催化反应类型和机制把酶分六大类：(1) 氧化还原酶类： 催化氧化还原反应。AH2+BóA+BH2(2)

48、转移酶类： 催化分子基团从一个分子转移到另一个分子的反应。A-R+BóA+B-R(3) 水解酶类： 催化加水分解的反应。A-B+HOHóAOH+BH(4) 裂合酶类： 双键上去除或加入一个基团的反应。反应通式为： ABóA+B(5) 异构酶类： 催化分子间重排的有关反应。反应通式为： AóB(6) 连接酶类： 催化把两个分子连接在一起，并由ATP提供能量的反应。 A+B+ATPóAB+ADP+磷酸，或AMP+焦磷酸（3）各大类酶举例氧化还原酶： 琥珀酸脱氢酶、醇脱氢酶、多酚氧化酶;转移酶类： 谷丙转氨酶（简称GPT）己糖激酶；水解酶类： 淀粉酶

49、、蛋白酶、纤维素酶等；裂合酶类： 草酰乙酸脱羧酶、醛缩酶、水化酶、脱氨酶异构酶类： 葡萄糖异构酶、磷酸甘油磷酸变位酶；合成酶类： 天冬酰胺合成酶，丙酮酸羧化酶； 二、命名（一）习惯命名法1.根据被作用的底物命名；2.根据催化反应的性质命名；3.将酶的作用底物和催化反应的性质结合起来命名；4.将酶的来源与作用底物结合起来命名；5.将酶作用的最适pH和作用底物结合起来命名；（二）国际系统命名法1.酶的系统命名由两部分组成：Ø 酶所作用的底物的名称 Ø 酶所催化的反应的类型。例如： L-乳酸： NAD+氧化还原酶 （乳酸 + NAD+ Û 丙酮酸 + NADH + H+

50、）2.系统编号-EC1111& EC-表示国际酶学委员会第一个数字表示酶所属的大类（16大类)第二个数字表示酶在该大类中所属的亚类第三个数字表示酶所属的次亚类第四个数字表示酶在所属次亚类中的流水编号Ö EC11127乳酸脱氢酶：表示该酶为氧化还原酶类，底物上发生氧化的供体基团是醇基（亚类），氢的受体是NAD（次亚类），流水编号为27。第二节 酶的结构及其催化功能的关系（一）蛋白质的一级结构与催化功能的关系（酶的一级结构是酶的基本化学结构，是催化功能的基础。）1. 必需基团：指酶蛋白分子中与酶的催化活性直接相关的氨基酸残基侧链基团，若使其改变则催化活性丧失。如Ser的羟基， H

51、is的咪唑基， Cys的巯基， Asp、 Glu的侧链羧基等。结合基团：能与底物结合的必需基团； 催化基团：能促进底物发生化学变化的必需基团；2、肽键的改变与催化功能的关系& 肽键的断裂使酶的生物活性丧失；& 酶原的激活酶原：有些酶，特别是一些与消化作用有关的酶，在最初合成和分泌时，没有催化活性，这种没有催化活性的酶的前体称为酶原；酶原激活：酶原在一定的条件下经过适当的物质作用而转变为有活性的酶的过程，称为酶原的激活，实质上是酶活性部位形成或暴露的过程。（二）酶的高级结构与其催化活性的关系1. 活性中心(active center)：是指酶分子中直接与底物结合并完成酶催化反应的

52、结构区域，该部位化学基团集中，并构成一定空间构象。2.酶的二、三级结构与催化活性的关系：酶的二、三级结构是所有的酶必须具备的空间结构，是维持酶活性部位所必须的构象。u 可使酶遭受破坏而丧失其催化功能-蛋白质变性理论u 也可以使酶形成正确的催化部位而发挥其催化功能-酶的诱导契合学说3.酶的四级结构与催化活性的关系：（1）酶的四级结构及亚基与催化活性的关系（2）酶的四级结构与代谢调节的关系Ø 聚合与解聚 Ø 别构酶4.同工酶高级结构与酶活性关系的典型：& 同工酶的概念：指能催化相同的化学反应，但酶蛋白本身的分子结构组成及理化性质不同的一组酶。& 同工酶的结构与功

53、能：同工酶的结构主要表现为非活性中心部分的不同，或所含亚基组合情况不同，对整个分子而言，各同工酶与酶活性有关的部分结构相同。第三节 酶催化反应机制 (一).酶促反应的本质：加速反应的本质-降低活化能 （二）酶与底物形成中间络合物的方式（理论）:锁匙假说 诱导契合假说 (三）与酶的高效率催化有关的因素：1.邻近效应与定向作用2.电子张力作用:应变效应，底物分子的敏感键产生张力或变形3.多元催化作用:包括酸碱催化与共价催化等。4. 酶 活 性 中 心 的 低 介 电 区 (表面效应，微环境效应)：第四节 酶促反应动力学（重点）一.内容：酶反应速度、反应过程的规律及各种环境因素对酶促反应速度的影响。

54、（一）酶促反应的速度：酶促反应过程中单位时间内底物的减少量或产物的增加量。V = - dS / dt = dP / dtØ 一般用单位时间内产物的增加量表示Ø 酶反应进程曲线-产物的生成量与时间的关系曲线。Ø 曲线的斜率-表示单位时间内产物的变化量-酶反应速度。（二）酶促反应速度的测定在研究酶促反应动力学中，为准确地表示酶活力，一般都用初速度表示，即酶反应初始阶段，即底物转化量<5%时的反应速度，也就是进程曲线的直线部分。在此阶段，任何一点上的斜率都是相等的，代表真实的酶促反应速度，即酶活力的大小。二. 酶浓度对反应速度的影响1.根据中间产物学说，酶反应式为：E + S nES àP + E酶反应速度用产物P的生成速度表示，产物的生成与中间产物ES的浓度成正比，当底物量足够时， ES的量就与酶的浓度成正比，因此，酶促反应初速度与酶浓度的关系呈一级反应规律，即：v = dP/dt = kE k为速度常数2.反应级数 当底物浓度较低时，v与S成正比，为一级反应，即v= dP/dt = kS；当底物浓度继续增加时，反应速度不再与底物浓度成