食品生物技术实验指导书

1、食品生物技术实验指导何志平 等编农业与食品科学学院20012.10实验一 质粒DNA的提取及电泳检测一 实验目的 通过本实验学习掌握碱裂解法提取细菌质粒DNA。二 实验原理 1. 细菌中有两种DNA，即染色体DNA和质粒DNA。 2. 质粒DNA的提取方法有三种：碱裂解法，煮沸法，去污剂（如Triton和SDS）裂解法。3. 碱裂解法比较剧烈，可破坏碱基配对，使宿主细胞DNA变性，共价闭合环状DNA由 于空间缠绕，两条链不会彻底分开。当外界条件到达复性条件时，质粒DNA的双链又迅速恢复原状，而较大的线性染色体DNA难以复性。三 实验材料：转化后的细菌(含有质粒的大肠杆菌)四、实验用具和药品1.

2、 实验用具:摇床，离心机，移液器及枪头，玻璃试管（15mL）及塞子，离心管（1.5mL）2. 实验试剂：1 溶液I 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris）Tris·HCl（pH8.0） 10 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）2 溶液II 0.4mol/L NaOH，2%SDS，用前等体积混合3 溶液III 5 mol/L 乙酸钾 60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml4 TE 缓冲液 10 mmol/L Tris·HCl（pH8.0） 1 mmol/L EDTA（pH8.0）5 70%乙醇（放-20冰箱中，

3、用后即放回）6 RNA酶 将RNA酶溶于10 mmol/L Tris·HCl（pH7.5）、15 mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的浓度，于100加热15min，缓慢冷却至室温，保存于-20。 7 加样缓冲液（6X）：40%蔗糖、0.25%溴酚兰电泳缓冲液：0.045mol/L Tris-硼酸   0.001mol/L EDTA （0.5X TBE buffer）贮存液：5X：54g Tris碱    27.5g硼酸    20ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0）五 实验步骤（一）细菌繁殖挑取白色的单菌落

4、若干，转移到3mL液体LB培养基(附加100mg/ml Amp ),37过夜振荡（200r/min）培养。（二）菌体收集将过夜培养的菌体转入1.5mL离心管，离心30sec 5000r/min；弃上清提取质粒（三）质粒提取方法一：碱裂解法提取质粒DNA1.将上述沉淀重悬于250L冰预冷的溶液中，剧烈震荡；2加入250L溶液，盖紧管口，快速颠倒离心管510次；3加入350L冰预冷的溶液，盖紧管口，温和地颠倒离心管510次；9000r/min离心5min上清转移到另一新1.5mL离心管中；4加等体积氯仿，振荡混合，静置， 9000r/min离心5min，上清转移到另一新1.5mL离心管中；5加入1

5、/10体积3mol/L的醋酸钠和2倍体积的乙醇，充分混匀，静置5min；9000r/min离心5min；6弃上清，用70ethanol洗涤；7加30LTE溶解，-20 保存。方法二：试剂盒提取方法1.离心收集的菌体中加入含RNAase的溶液250L，重悬菌体；2. 加溶液250L，轻轻颠倒离心管10次，静止（1-2分钟），至溶液澄清；3. 加入350L冰预冷的溶液，快速颠,20-30次；4. 12000r/min离心10min；5. 将上清转移到DNA结合离心管中，12000r/min离心1min；6. 加入去蛋白试剂500L，12000r/min离心1min；7. 加洗涤液750L，1200

6、0r/min离心1min；8. 加洗涤液700L，12000r/min离心1min；9. DNA结合柱12000r/min离心2min，去除残余的洗涤液；10 DNA结合柱放入另一个新的1.5mL离心管中，室温1-2min，加入洗脱缓冲液50-100L；11 12000r/min离心1min；（四）检测提取DNA质量的电泳检测。l 取2ul质粒DNA+2ul加样缓冲液+6ul ddH2O；l 配制1%的琼脂糖凝胶l 电泳30min，EB染色，拍照。注意事项：氯仿对眼睛、皮肤、粘膜及呼吸道都有刺激作用，它是致癌剂并可损伤肝脏和肾脏，操作时需戴手套、口罩。六 实验作业1. 思考本实验的关键步骤是什

7、么？2. 琼脂糖电泳鉴定质粒DNA时，能看到几条带，快慢顺序是什么？3. 附上电泳图片。实验二、固定化-淀粉酶及活性测定一、实验目的和原理目的：学会包埋法制备固定化酶的操作技术内容：制备固定化酶的方法很多，利用双功能试剂或多功能试剂在酶分子间，酶分子与惰性蛋白间，或酶分子与载体间进行交联反应，以共价键制备固定化酶的方法称为交联法，本实验即采用包埋法。二、实验器材1 恒温水浴锅2 恒温振摇仪三、实验试剂1. 海藻酸钠2. CaCl23. 碘原液：称取碘1.1g。碘化钾2.2g，置于小烧杯中，加10ml蒸馏水使之溶解，然后转入容量瓶中。再加少量的蒸馏水洗涤烧杯数次，洗涤液均转入容量瓶中，最后定容至

8、50ml。摇均后放于棕色试管中备用。4. 比色稀碘液：取碘原液2ml，加碘化钾20g，再用蒸馏水定容至5000ml。5. 2%淀粉溶液：称取2g可溶淀粉，放入小烧杯中，加少量蒸馏水做成悬浮液。然后在搅拌下注入沸腾的蒸馏水中，继续煮沸一分钟，冷却后加蒸馏水定容至100ml。6. pH6磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液：称取磷酸二氢钠（Na2HPO4.12H2O）45.23g,柠檬酸（C6H8O7.H2O）8.07g,先在烧杯中使之溶解，然后转入容量瓶中定容至1000ml。四、实验操作（1）酶液的制备精确称取-淀粉酶2g，先用少量40pH6的磷酸二氢钠柠檬酸缓冲液溶解，溶解过程中轻轻用玻璃棒捣研。将上层液小

9、心倾入100ml容量瓶，沉渣部分再加入少量上述缓冲液，如此反复捣研34次。最后，将溶液与残渣全部移入容量瓶中，用缓冲液先定容摇匀后，通过四层纱布过滤，溶液供测定使用。（2）配制CaCl2溶液：0.83gCaCl2150mL蒸馏水200mL烧杯溶解备用。（3）配制海藻酸钠溶液：0.7g海藻酸10mL水50mL烧杯酒精灯微火（或间断）加热，并不断搅拌，使之溶化蒸馏水定容到10mL。（4）海藻酸钠溶液与酶液的混合：将溶化的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入酶液，搅拌后吸入到注射器中。（5）固定化酶制备：以恒定速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到CaCl2溶液中，形成凝胶珠状颗粒。（6）固定化-淀粉酶活力测定及

10、活力回收率的计算a. 首先用吸管取1ml的标准终点色溶液，加至白瓷板的空穴内，作为终点参照的标准。b. 固定前总酶活力测定：取20ml 2%的可溶淀粉液与5mLpH6的磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液，加入一支大试管中。将试管置于60水浴5分钟。然后加入前面制备的酶液0.5ml。摇匀后，立即用秒表记录时间。此后，每经一段时间，用吸管吸出0.2ml反应液，加入预先盛入稀碘液的白瓷板中。当穴内颜色反应由紫色逐渐变为红棕色并与标准色相同时，即为反应终点，记录反应到达终点时的时间。c. 固定化酶活力测定：取20ml 2%的可溶淀粉液与5mLpH6的磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液，加入一支大试管中。将试管置于60水浴5分

11、钟。然后加入前面制备的固定化酶。摇匀后，立即用秒表记录时间。此后，不断振摇，每经一段时间，用吸管吸出0.2ml反应液，加入预先盛入稀碘液的白瓷板中。当穴内颜色反应由紫色逐渐变为红棕色并与标准色相同时，即为反应终点，记录反应到达终点时的时间。d. 酶活力计算：以60、pH6的条件下，每小时水解1g淀粉的酶量为一个活力单位。 固定前原酶活力单位 = 60/T×20×2%×n/0.5固定后的酶活力单位 = 60/T×20×2%×n/10T：反应到终点时的时间（分）n：酶粉稀释的倍数5. 固定化后酶活力回收率计算：酶活力回收率=（固定后的酶活

12、力单位/固定前原酶活力单位） × 100%五、思考题1、固定化酶有哪些优点？实验三、固定化酵母细胞发酵一、实验目的和原理目的：学会包埋法制备固定化酵母的操作技术内容：采用包埋法制备固定化酵母，应用固定化酵母进行发酵。二、实验器材1、恒温水浴锅2、恒温振摇仪三、实验试剂1. 海藻酸钠2. CaCl23. 葡萄糖四、实验操作1制备固定化酵母细胞（1）酵母细胞的活化：1g干酵母10mL蒸馏水50mL烧杯搅拌均匀放置1h，使之活化。（2）配制CaCl2溶液：0.83gCaCl2150mL蒸馏水200mL烧杯溶解备用。（3）配制海藻酸钠溶液：0.7g海藻酸10mL水50mL烧杯酒精灯微火（或间

13、断）加热，并不断搅拌，使之溶化蒸馏水定容到10mL。（4）海藻酸钠溶液与酵母细胞的混合：将溶化的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入活化酵母细胞液，搅拌后吸入到注射器中。防止高温杀死酵母细胞。（5）固定化酵母细胞：以恒定速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到CaCl2溶液中，形成凝胶珠状颗粒。2固定化酵母细胞的发酵（6）冲洗：将固定的酵母细胞凝胶珠用蒸馏水冲洗23次。（7）发酵：150mL10葡萄糖固定化酵母细胞200mL锤形瓶密封25发酵24h。五、思考题1、微火加热并不断搅拌的目的是什么？2、为什么要海藻酸钠溶液冷却后才能加入酵母细胞？3、发酵过程中锥形瓶为什么要密封？实验四 溶菌酶的制备一、实验目的与

14、内容目的：1. 掌握等电点沉淀法进行初级分离的操作方法和注意事项；2. 掌握测定蛋白质标准曲线的制作方法；3. 能针对不同的目标产物选择恰当的初级分离方法，锻炼应用生物分离技术知识分析、解决实际问题的能力。内容：1. 从鸡蛋清中粗提取出溶菌酶；2. 制作测定蛋白质的标准曲线。 二、溶菌酶的粗提取（一）实验仪器和试剂1. 实验仪器721型分光光度计、摇床、高速离心机2. 实验材料和试剂：200mL烧杯、玻璃棒、漏斗、定性快速滤纸、200mL量筒、50mL离心管鸡蛋1只、0.02 mol/L PBS( pH8.0),  （二）实验步骤1. 取鸡蛋一个，破壳去蛋清置于250ML

15、烧杯中，并记录器体积；2. 加入1.5倍体积的pH7.0的PBS缓冲液，搅拌均匀，取0.5 ML蛋清至1.5 ML离心管中备用（样品1）；3. 用醋酸将蛋清也的pH调至4.7，充分搅拌；4. 3500rpm/min,离心20min,去上清;5. 取0.5 ML蛋清至1.5 ML离心管中备用(样品2)二、SDS-PAGE蛋白电泳（一） 原理: 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺 (简称Acr) 和交联剂N,N亚甲基双丙烯酰胺(简称Bis)在催化剂作用下,聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶,并以此为支持物进行电泳.聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同

16、迁移率将蛋白质分离成若干条区带,如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质,蛋白质样品电泳后,就应只分离出一条区带.    SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键,并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物,使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷,掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异.因此,各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率,不再受原有电荷和分子形状的影响,而只是棒长的函数.这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称SDSPAGE).由于SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度,因此常用来鉴定蛋

17、白质分离样品的纯化程度,如果被鉴定的蛋白质样品很纯,只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质,那么SDSPAGE 后,就只出现一条蛋白质区带.    SDSPAGE 可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统.本实验采用垂直板状不连续系统.所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH 和凝胶孔径等所组成.1. 蛋白样品浓缩效应    在不连续电泳系统中,含有上、下槽缓冲液(TrisGly,pH8.3)、浓缩胶缓冲液(TrisHCl,pH6.8)、分离胶缓冲液(TrisHCl,pH8.8),两种

18、凝胶的浓度(即孔径)也不相同.在这种条件下,缓冲系统中的HCl 几乎全部解离成Cl,两槽中的Gly (pI6.0,pK a=9.7)只有很少部分解离成Gly 的负离子,而酸性蛋白质也可解离出负离子.这些离子在电泳时都向正极移动.C1速度最快(先导离子),其次为蛋白质,Gly 负离子最慢(尾随离子).由于C1很快超过蛋白离子,因此在其后面形成一个电导较低、电位梯度较陡的区域,该区电位梯度最高,这是在电泳过程中形成的电位梯度的不连续性,导致蛋白质和Gly 离子加快移动,结果使蛋白质在进入分离胶之前,快、慢离子之间浓缩成一薄层,有利于提高电泳的分辨率.2. 分子筛效应  

19、0; 蛋白质离子进入分离胶后,条件有很大变化.由于其pH 升高(电泳进行时常超过9.0),使Gly 解离成负离子的效应增加;同时因凝胶的浓度升高,蛋白质的泳动受到影响,迁移率急剧下降.此两项变化,使Gly 的移动超过蛋白质,上述的高电压梯度不复存在,蛋白质便在一个较均一的pH 和电压梯度环境中,按其分子的大小移动.分离胶的孔径有一定的大小,对不同相对分子质量的蛋白质来说,通过时受到的阻滞程度不同,即使净电荷相等的颗粒,也会由于这种分子筛的效应,把不同大小的蛋白质相互分开.（二）实验仪器和试剂1. 电泳仪，水平摇床2. 试剂: 丙烯酰胺，双丙烯酰胺，Tris-base，TEMED，SDS，过硫酸

20、铵，甘油，溴酚兰，甘氨酸，DTT，考马斯亮蓝R-250，甲醇，冰醋酸，蛋白Marker（50ul装），溶菌酶10mg。3. 缓冲液(1) 2M Tris-HCL (pH8.8)100ml：24.2g Tris-base，50ml蒸馏水，加入浓盐酸调pH8.8，最后定容至100ml。(2) 1M Tris-HCL (pH6.8)100ml：12.1g Tris-base，50ml蒸馏水，加入浓盐酸调pH6.8，最后定容至100ml。(3) 10%SDS 100ml：10gSDS，加入70ml蒸馏水在60搅拌溶解，待泡沫消失后，定容至100ml。(4) 50%（w/v）甘油  100ml

21、：50ml甘油，50ml蒸馏水，混匀即可。(1) 1%（w/v）溴酚兰10ml：100mg溴酚兰，蒸馏水定容至10ml。0.139g乙酸钠溶于100ml蒸馏水中，调pH至5.2。4. 工作液：(1)30%聚丙酰胺母液（A液）实际需要250ml100ml：                   丙烯酰胺29g，双丙烯酰胺1g，去离子水在37溶解，定容到100ml。0.45m滤器过滤除菌，棕色瓶保存。pH7.0。

22、(2) 4×分离胶缓冲液（B液）100ml：                  75ml 2M Tris-HCL (pH8.8)                       

23、60;  4ml 10%SDS                          21ml蒸馏水                  

24、0;       4存放。(3) 4×浓缩胶缓冲液（C液）100ml：                   50ml 1M Tris-HCL (pH6.8)              

25、60;           4ml 10%SDS                          46ml蒸馏水         

26、0;                4存放。(4) 10%过硫酸铵（D液）5ml：                 0.5g过硫酸铵，5ml蒸馏水，0.1ml分装。(5) TEMED （E液）(6) 1×Tris-甘氨酸缓冲液1L：Tris-base 3g&#

27、160;     甘氨酸 14.4gSDS 1g蒸馏水定容到1L，pH8.3左右。(7) 5×上样缓冲液 10ml：                 0.5ml 1M Tris-HCL（pH6.8）             

28、60;         1ml 1M DTT                       2ml 10% SDS              

29、         1ml 1%溴酚兰                       5ml 50%甘油               

30、        0.5ml 蒸馏水(8) 考马斯亮蓝染色液 1L：                   考马斯亮蓝R-250 1.0g               

31、60;       甲醇450ml                       冰醋酸 100ml                 

32、;      蒸馏水450ml(9) 考马斯亮蓝脱色液 1L：     甲醇100ml                       冰醋酸 100ml