DGGE技术在环境微生物多样性研究中的应用-

1、技术与方法生物技术通报B I O TECHNOLOGY BULL ET I N2009年第12期DGGE 技术在环境微生物多样性研究中的应用张珍妮1,2吴晓芙1陈永华1,2石卉1(1中南林业科技大学环境科学与工程研究所,长沙410004;2中南林业科技大学生物环境科学与技术研究所,长沙410004摘要:微生物是污水净化的主要作用者之一。采用变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electr ophresis,DGGE 方法培育和鉴定土壤微生物具有可靠性强、重复性好、方便快捷等优点,已被广泛应用于环境科学和污染防治研究领域。综述了基于PCR 2DGGE 技术的基本原理

2、、关键环节及其在微生物多样性研究中的应用,同时就其自身存在的不足进行了评价并提出了解决方案。关键词:PCR 2DGGE 微生物多样性Appli cati on i n Research on M i crobi a l D i versityof Envi ronment by DGGE Techn i queZhang Zhenni 1,2W u Xiaofu 1Chen Yonghua 1,2Shi Hui1(1Institute of Environm ent Science and Engineering,Central South U niversity of Forestry an

3、d Technology,Changsha 410004;2Institute ofB iology Environm ent Science and Technology,Central South U niversity of Forestry and Technology,Changsha 410004Abs trac t:M icr oorganis m p lays an i m portant r ole in waste water treat m ent 1Accounted f or by its high levels of reliability and rep r o

4、2ducibility as well as its convenience in operati on,the denaturing gradient gel electr ophoresis (DGGE has been widely used f or cultiva 2ti on and identificati on of m icr obial communities in the fields of envir on mental sciences with focus on polluti on contr ol 1The p rinci p le of the DGGE te

5、chnique and the concerned key fact ors in its app licati on f or analysis of m icr obial communities were described in this pa 2per 1I n comparis on,the potential app licati on areas of the DGGE technique and its li m itati ons were als o discussed 1Key wo rd s:PCR 2DGGE M icr oorganis m D iversity收

6、稿日期:2009207220基金项目:国家水体污染控制与治理科技重大专项(2008ZX072122001,国家科技部国际合作项目(20072DF A91420,湖南省博士后基金(2008RS4027,中南林业科技大学校青年基金重点项目(2008001A ,中南林业科技大学生物环境科学与技术研究所开放基金,湖南省环境科学学科建设项目(2006180作者简介:张珍妮(19852,女,在读硕士,研究方向:环境生物学;E 2mail:zhangzhenni_20031631com 通讯作者:吴晓芙(19532,男,教授,研究方向:水土污染控制;E 2mail:wuxiaofu530911vi p 11

7、631com环境中微生物的种类和数量是及其丰富的,微生物能把有机质作为营养源转化为组成物质和能量,它们在污染物的吸附和降解起着核心作用1,2。所以在分析环境样品时,了解微生物的群落结构,对鉴定和分离处理系统中的优势菌很重要。自1985年Pace 等3利用核酸测序方法来研究微生物的进化问题以来,分子生物学技术逐渐被引入到微生物多样性研究中。1993年Muyzer 等4最初将变性梯度凝胶电泳DGGE 技术引入微生物生态研究,DGGE 技术是一种DNA 指纹技术,是多态性分析技术的一种,可分辨出相同长度但序列不同的DNA 片段。这种方法可以有效地避免在传统富集、培养、分离、研究过程中造成的微生物多样

8、性丢失,种群构成发生变化等弊病,能够更直接、可靠地反映出微生物的原始组成情况。Muyzer 4研究表明占整个群落细菌数量约1%或以上的类群就能够通过DGGE 监测到,而传统方法只能分离出占环境微生物总数011%10%的微生物。因此,综述了DGGE 的基本原理与关键环节、及其在微生物多样性研究中的应用,同时就其自身存在的缺点进行了评价并提出了解决方案。1D GGE 技术的原理DGGE 技术是使用具有化学变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶对DNA 进行电泳,该凝胶电泳时能够有区别地解链PCR 扩增产物。在进行变性梯度凝胶2009年第12期张珍妮等:DGGE技术在环境微生物多样性研究中的应用电泳时,长度相同

9、而在碱基序列上存在差异的DNA 双链的解链需要不同的变性剂浓度。序列不同的DNA片段就会在各自想用的变性剂浓度下变性,发生空间构型的变化。起初双链DNA以现状向正极移动,随着变性剂浓度的增加,DNA中具有低G+C 含量的序列的部分被打开,而高G+C含量的部分仍保持双链。DNA双链一旦解链,DNA分子形成端部的叉状或中间的环节(即DNA部分熔化。其在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度将会急剧下降,以至停留在其相应的不同变性剂梯度位置,染色后可以在凝胶上呈现为分开的条带。如此使能将具有相同长度而序列有差异的DNA分子分离开(图1。图1D GGE研究微生物多样性的一般步骤2D GGE技术的关键环节和优化21

10、1提取DNA的方法的比较样品群落总DNA的提取是DGGE研究微生物群落的基础。人工湿地样品中细菌种类复杂且混杂有大量有毒物质、腐殖质5,如何使所有细胞裂解、充分释放DNA、有效去除杂质,建立高效、可靠的DNA提取方法成为研究者关注的热点。从土壤中提取DNA的方法可以分为两类6,一类是直接提取法,在土壤中直接裂解微生物体,再提取DNA7。另一类是间接提取法,先将微生物菌体与土壤颗粒分开,再提取DNA8,其优缺点见表1。采用直接提取法的较多,包括3种方法,且样品总DNA提取质量的高低多以获得量大、能用于后续分子操作和尽可能地包含样品中所有微生物类群的遗传信息为指标。DNA提取过程中一般用乙醇、异丙

11、醇和聚乙二醇(PEG等有机溶剂沉淀DNA分子,这些有机溶剂对样品的DNA均有一定的优先选择性。Porteous等12认为异丙醇沉淀核酸量较高,且腐殖酸污染较少。M iller13认为S DS 结合氯仿或苯酚进行玻璃研磨可以优化DNA 提取量。表1土壤微生物D NA提取方法的比较类型原理方法优缺点直接提取法将样品直接悬浮在裂解缓冲液中处理,使其释放DNA,继而抽提纯化S DS2高盐提取法11S DS2酚氯仿抽提法S DS高盐提取DNA得率较高;S DS酚氯仿抽提DNA得率较低,且会造成DNA的剪切9S DS法提取的DNA中含有较多腐殖酸等杂质,要经过纯化才能用于后续研究10CT AB2S DS法

12、DNA纯度较高,片段完整,可以直接用于后续一般的操作10间接提取法先将微生物菌体与土壤颗粒分开,再提取DNANycodenz法15B lending法16间接提取法的DNA得率明显低于直接提取法,Nycodenz介质密度梯度离心可得到相对干净的菌泥,且细胞分离效率较高,可达20%50%14,但其价格昂贵,操作复杂;而B lending法操作简单快速,成本低,但分离出的菌泥中含有非细胞物质和土壤污染物212PCR的扩增及其偏差和优化PCR扩增是PCR2DGGE技术中至关重要的步骤之一。通常采用16S r DNA中的保守区作为引物进行PCR反应。这是由于16S r DNA具有以下几个特点:(116

13、S r DNA约为1540个核苷酸长,序列长短适中,适合用作分类学上的研究17;(2原核生物体都具有16S r DNA;(316S r DNA非常保守,不会在不同的个体间进行基因交换,各物种具自己的独特序列18,19;(4目前已有相当完备的16S r DNA 基因资料库,经过GenBank和R ibos omal Database Pr oject(RDP基因资料库作对比分析,并可进行亲源关系分析、鉴定等。目前被广泛被广泛使用的细菌16S r DNA通用引物是338f/518r(V3区、341f/ 926r(V3V5区和968f/1401r(V6V8区。Yu94生物技术通报B iotechno

14、logyB u lletin2009年第12期等20认为扩增V3区及V3V5区的引物为最佳引物选择,V3区的PCR2DGGE条带数最多、分离效果最好。如果需要较长的扩增产物,则选择V3V5区。PCR技术主要由高温变性、低温退火和适温延伸3个步骤反复的循环构成,是在一种特异耐热酶Taq DNA聚合酶的催化下完成的由DNA聚合酶催化反应。总结不同的PCR扩增反应体系21,22,然后根据土壤微生物总DNA的特性,依据常规的PCR 反应体系,试验不同的反应程序,得出效果较好的PCR条带。其反应程序如下:941m in;501m in 和721m in,共33个循环,然后725m in为最后的延伸阶段。

15、对基本组成以外的其它变化再进行描述:在9096内每间隔2设系列变形温度,结果表明,90无区带,最适变性温度为94。在40 60内,每隔5设系列退火温度。结果表明,最适温度为45和50。当其它扩增条件确定后,设扩增的循环次数分别为25、30、35和40个。结果表明,以35个循环的产物较为理想。从研究的结果可看出,任何试验条件偏离最佳试验条件将导致扩增无产物或非特异性产物,将影响PCR试验的可靠性。213最佳电泳条件的选择电泳条件的选择在整个分析过程中具有至关重要的作用,电泳条件的优劣直接关系到条带分离的好坏,影响后续分析工作。DGGE电泳条件不同,即使是相同的样品所得的图谱也会有差异23。DGG

16、E 电泳条件选择包括变性剂梯度、电泳温度和时间、显影的效果的确定。理论认为,只要选择的电泳条件足够精细,有1个碱基差异的DNA片段都可被分开。DGGE电泳条件一般通过经验数据或反复试验来确定。通常根据基因片段的大小来确定聚丙烯酰胺凝胶浓度,当片段大小在200bp左右时,一般采用8%的凝胶。变性剂的梯度范围要根据垂直DGGE试验来确定,垂直试验曲线斜率较大的部分代表解链区域的T m(解链温度值,此时低温解链区的不同分子达到最佳分离状态24。通常选择水平胶的的变性剂梯度范围为30%(相当于T m范围10左右,对于不同的样品还需要进行调整。对大多数DNA片段5065是比较适合的,通常电泳的温度要低于

17、样品解链区域的T m值。土壤样品相对而言比较复杂多样,其解链温度通常选择在60左右进行优化25。电泳时间取决于样品的片段大小、凝胶浓度、变性剂梯度和电泳时的电压等因素,一个条件的改变都可能引起电泳时间的不同,可以用时间进程法优化出最佳电泳时间。Muyer和S malla26建议利用时间进程试验确定最佳的电泳时间。具体方法是将待测样品以恒定的时间间隔在同一块凝胶上电泳,以获得样品最大分辨率的时间为最佳电泳时间。在Sigler23的研究中发现,较长时间的电泳会改变DGGE胶中变性剂梯度,导致电泳图谱的变化,3个不同的样品,同样在电压1000V的体系下进行电泳分离,随着电泳时间的减少,分离的效果变好

18、。为了更好的显示DGGE条带,可以选择不同的染色方式(E B、SY BR Green I和银染。其中,SY BR Green染色的优点是背景色低,可以观察到尽可能多的条带;银染的灵敏度最高,但银染过后的条带不能用于杂交分析27。3D GGE在环境治理中的应用311DGGE技术在废水生物处理研究中的应用刘新春等28应用PCR2DGGE方法,对在相同的操作条件下分别用低温菌和常温菌接种的两套活性污泥系统中的微生物群落结构的动态变化进行了追踪。由于工艺相同,使得接种的低温菌和常温菌群在相同的操作条件下,产生了相似的微生物群落结构。随着运行时间的增加,其菌群结构相似程度也越来越高,说明环境的变化是决定

19、微生物群落结构的关键因子。赵兴青等29采用PCR2DGGE分子指纹图谱技术比较南京玄武湖、莫愁湖和太湖不同位置的表层沉积物微生物群落结构,研究结果表明,三湖泊沉积物微生物的16S r DNA的PCR扩增结果约为626bp,为16S r DNA V3V5区特异性片段。三湖泊除具有特征性的微生物种属外,还分布约5个相同的细菌种群。赵继红等30用PCR2DGGE技术分析啤酒废水处理系统的微生物区系,对S BR池活性污泥细菌多样性进行比较,得出S BR池不同深度和不同曝气量的微生物种群结构完全一致,不同处理时段和不同时间的微生物种群结构一致,但优势菌群不同。说明水解酸化池的活性污泥微生物多052009

20、年第12期张珍妮等:DGGE技术在环境微生物多样性研究中的应用样性受深度的影响变化较大,在结构组成和种群数量上均有较大的差异。吴卿等31应用PCR2DGGE 研究饮用水中微生物的多样性,得出不同取样点饮用水样品中虽然存在特异菌,但各取样点水样中的优势菌相同。从这些研究中可以看出菌群结构主要是由环境条件决定,一般在相同的废水中采用不同的处理,微生物种群结构一般一致,但优势菌群不同。312DGGE技术在土壤微生物研究中的应用罗海峰等32采用PCR2DGGE技术分析农田土壤微生物多样性,得出了DGGE能够对土壤样品中的不同微生物的16S r RNA基因的V3区的DNA扩增片段进行分离,为这些DNA片

21、段的定性和鉴定提供了条件。林曦等33进行了南极中山站排污口土壤中微生物群落的DGGE分析,针对16S r DNA基因中V3保守区域进行比较分析,结果发现中山站排污口样品中的微生物组成表现出与周围环境不同的特征。滕应等34用PCR2DGGE技术分析了重金属污染农田土壤细菌群落的多样性,反映了重金属复合污染影响到农田土壤生态系统的细菌丰富度,改变土壤环境的优势菌群,使农田土壤微生物群落结构多样性发生变化。Muller等35用PCR2DGGE 方法研究了Hg污染对土壤微生物群落,特别是细菌群落结构的影响。结果反映了Hg污染改变了细菌群落结构以及降低了其多样性,同时耐Hg速生细菌明显变多,证明了多样性

22、的减少会降低生态系统稳定性,甚至导致生态系统机能的衰退。313DGGE技术在膜生物处理研究中的应用孙宝盛等36应用PCR2DGGE技术解析膜生物反应器中微生物群落多样性,指出不同的膜生物反应器在长期稳定运行后形成了各自特定的生态群落结构,既有共同的优势种群也有各自特有的种群,相同的微生物种群在不同反应器中的优势地位不同,各自特有的微生物群落则是由于水质的不同经过长期演替而来。苏俊峰等37利用PCR2DGGE技术初步分析了生物陶粒反应器细菌的种群演替情况,结果表明群落结构和优势种群的数量具有时序动态性,微生物多样性与废水的处理效果出现协同变化的特征。蒋建文等38采用PCR2DGGE技术比较了生物

23、膜和水体微生物多样性的差异。结果表明随着微生物膜的逐渐成熟和微生物群落的稳定,生物膜上微生物多样性呈高于水体微生物多样性的态势。肖勇等39利用PCR2DGGE研究处理垃圾渗滤液序批式生物膜反应器(S BBR中的细菌多样性。结果表明该驯化后的S BBR生物膜和渗滤液原水中都有比较丰富的细菌多样性,渗滤液中存在着丰富的厌氧细菌,为生物膜驯化提供了丰富的脱氮功能菌种,驯化的生物膜中同时存在好氧反硝化细菌、厌氧氨氧化细菌、大量的硝化细菌和反硝化细菌。4D GGE技术的展望DGGE其自身也存在一些缺点:(1只能分离较小的片段(<500bp,对于大片段的分离效率下降。因此,给引物设计和系统发育分析带

24、来一定困难。(2DGGE图谱中单一的条带并不总是代表单一的菌株,或是在不同的泳道中移动到同一位置的条带可能由不同的细菌组成。Sehiguchi等40在试验中发现DGGE图谱中的单一条带不能被测序,对带中DNA进行克隆和基因文库研究发现,此条带中包含多条不同的DNA序列。(3DGGE通常显示群落中优势种类的r DNA片段,只有占整个群落细菌数量约l%或以上的类群能够通过DGGE检测到。Val2 laeys41发现DGGE并不能分离样品中所有的DNA 片段。(4由于某些种类的16S r DNA不同拷贝之间的多态性问题,可能导致自然群落中细菌数量的过多估计42。(5DGGE技术对微生物的分类鉴定依赖

25、于基因数据库,若数据库中基因序列信息不够丰富,将会限制DGGE的使用。DGGE技术作为一项新兴的研究手段和工具,还需要加强和改进以下几个方面:(1需要摸索适合具体样品的DNA提取方法和最佳PCR条件;(2优化DGGE条件和仔细分析具体结果。(3加强DGGE技术与其它技术的联用。有研究中发现37,同一种样品采用不同的方法分析,传统方法能够检测到的细菌,在分子方法中却不能被发现,这可能是在PCR过程中该菌未被扩增的缘故。DGGE方法可以采用双梯度DGGE/TGGE,如联合使用一个丙烯酰胺梯度或温度梯度以达到更好的分辨率;利用末端标记的荧光PCR产物、附加荧光内泳道标准化检测稀少群落组成和精确的样品

26、对样品比较。使用功能型基因作为分子标记也能区别关系相近但生态15生物技术通报B iotechnologyB u lletin2009年第12期差异的种群;DGGE与克隆文库等技术结合,可克服局限性,充分发挥分离的优势。目前的发展趋势是PCR2DGGE/TGGE与其他分子技术以及微生物学、地球化学方法联合使用,这样可以减少不同技术的弊端与局限性,综合各种技术的优势,从而更真实地揭示环境微生物群落结构和功能的本质。(4进一步丰富基因数据库,建立更加完善的基因序列信息,为DGGE技术对微生物的分类鉴定提供更好的信息平台。参考文献1Hopp HG,Emerick LC,Gocke K1App lied

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