微生物发酵法生产介乳酸的研究进展

1、微生物发酵法生产介乳酸的研究进展摘要:D-乳酸作为一种重要的手性中间体和聚乳酸合成的原料, 其生产已越来越受到人们的重视。然而, 低光学纯度D-乳酸在很多领域的应用都受到限制。微生物发酵法能够生产高光学纯度的D-乳酸。除了乳酸生产的传统菌株 乳酸细菌, 研究者们还通过基因工程的手段不断探索其它种属菌株利用更廉价的可再生资源高产光学纯度D-乳酸的可行性。介绍了D-乳酸的物化性质及其在工业生产、化学加工和聚乳酸合成中的应用, 并详细综述了国内外发酵法生产光学纯度D-乳酸的最新研究进展, 着重介绍了采用基因工程育种策略提高菌株的D-乳酸产量、转化率、生产强度以及光学纯度, 降低副产物的合成, 扩大底

2、物利用范围的研究成果。所涉及的菌株包括:乳酸细菌、大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌以及酵母等。这些研究表明, 应用基因工程手段改造生产菌株的代谢途径是选育D-乳酸发酵生产菌株的发展趋势。最后还对D-乳酸发酵生产的前景进行了展望。关键词:D-乳酸光学纯度微生物发酵代谢工程乳酸常为DL混合型, 为世界上公认的三大有机酸之一, 乳酸及其衍生物具有广泛的用途。乳酸异构体之一D-乳酸是一种重要的手性中间体, 其聚合物D-聚乳酸与L-聚乳酸形成立构复合物能提高L-聚乳酸的热稳定性。随着人们环保意识的提升, 生物可降解聚乳酸材料的市场需求量不断增加, 同时也推动了对其单体D-乳酸的需求。然而, 低光学纯度的D-乳酸在

3、很多领域的应用受到限制, 人们不断寻找单一光学纯度D-乳酸的生产方法, 并探索其以可再生、廉价资源为原料, 以高产量、高底物转化率、高生产强度和高化学纯度生产的可行性。本文将概述D-乳酸的性质与应用,并围绕D-乳酸生产菌种的最新研究进展作一综述。1、 D-乳酸及其应用1.1 D-乳酸的结构与理化性质乳酸的学名为A-羟基丙酸, 分子式为C2H5OCOOH, 是一种天然存在的有机酸, 广泛存在于人体、动物、植物和微生物中1。乳酸是自然界最小的手性分子, 分子中羧基A位碳原子为不对称碳原子, 具有L(+和D(- 两种构型。L-乳酸为右旋型, D-乳酸为左旋型, L-乳酸和D-乳酸等比例混合即为消旋的

4、DL-型。D-乳酸和L-乳酸除旋光性外, 它们的其它理化性质相同2,但DL-型的物理性质与它们有所差别, 表现在其熔点和熔化热比单一D或L构型的低。D-乳酸具有一元羧酸的典型化学性质, 水溶液呈弱酸性, 浓度达到50%以上时会部分形成乳酸酐, 与一些醇类物质反应生成醇酸树脂, 在加热条件能够进行分子间酯化反应, 形成乳酰乳酸, 稀释并加热可再水解成D-乳酸。在脱水剂氧化锌作用下, 两分子D-乳酸脱去两分子水, 自聚形成环状二聚体D-丙交酯。充分脱水则可形成聚合D-乳酸。由于乳酸越浓自身酯化趋势越强, 因此乳酸通常是乳酸和丙交酯的混合物。1.2 D-乳酸及其衍生物的应用1、D-乳酸在手性化合物合

5、成中的应用高光学纯度D-乳酸(97%以上作为一个手性中心是多种手性物质的前体, 是重要的手性中间体与有机合成原料, 广泛应用于制药、高效低毒农药及除草剂、化妆品等领域的手性合成 3。此外, 钙拮抗剂降压药、皮考啉酸衍生物以及二甲四氯丙酸、氟系除草剂等也以高光学纯度D-乳酸作为原料。2、D-乳酸衍生物在化学工业中的应用以D-乳酸为原料的乳酸酯类在香料、合成树脂涂料、胶粘剂及印刷油墨等生产中应用广泛, 在石油管道和电子工业的清洗等方面也有应用。其中, D-乳酸甲酯能与水及多种极性溶剂均匀混合, 能充分溶解硝化纤维素、醋酸纤维素、乙酰丁酸纤维素等以及多种极性合成高分子聚合物, 同时具有熔点高、蒸发速

6、度慢的优点, 是一种优秀的高沸点溶剂, 可作为混合溶剂的成分改善作业性和增溶性, 此外, 还可用作医药、农药的原料和其它手性化合物合成的前体、中间体。3、D-乳酸在聚乳酸类生物降解性材料中的应用乳酸是生物塑料聚乳酸的原料。聚乳酸材料的物理性质依赖于D, L两种异构体的组成和含量。由消旋型D, L-乳酸合成的消旋体D, L-聚乳酸( PDLLA为无定型结构, 其机械性能较差, 降解时间较短, 且在体内会发生收缩, 收缩率达50%以上, 应用受到局限。L-聚乳酸和D-聚乳酸的链段排列规整, 结晶度、机械强度和熔点等都远超过。实际应用中较多采用L和D 型聚合单体合成PLA。与传统热塑材料相比, 聚乳

7、酸塑料具有优异的生物降解性、可加工性、热塑性以及高强度性能, 并将逐步替代目前困扰世界各国的白色热塑污染产品。其制品在农业、渔业、工业、服装行业和医疗等方面都有着广阔的应用前景。如: 聚乳酸生物塑料可用于取代目前易破碎的农用地膜, 用作土壤、沙漠绿化保水材料, 水产用材, 农药化肥缓释材料等。聚乳酸还可加工成建筑用的薄膜和绳索、纸张塑膜等。由于, 聚乳酸对人体无毒无害, 最适合加工成一次性饭盒以及其它各种食品、饮料的外包装材料。还可用于生产仿棉纤维、仿羊毛和仿丝绸纤维, 并可单独纺丝用于生产各种织物。在生物医学工程领域可用作骨内固定物、疫苗佐剂、医用手术缝合线、微胶囊、植入片、人造皮肤、人造血

8、管等。由于D-乳酸聚合的聚乳酸不能被人体利用, 只有被人体内的微生物分解, 从而可以起到缓释作用, DLA 还被用于药物的缓释技术等。2、 D-乳酸发酵生产菌株与育种2.1 发酵法生产的优点人们最初采用化学合成法来生产乳酸。然而, 化学合成法生产的乳酸为外消旋型, 即D, L-乳酸, 且其所需要的乙醛和剧毒物氰化氢等原料来源于石油的裂解, 随着石油资源的日渐枯竭, 其应用受到一定限制。虽然酶法可以获得光学纯度的乳酸, 其工艺比较复杂,大规模工业应用还有待进一步研究4。与上述方法相比, 发酵法能以可再生资源为原料生产光学特异性的D-或L-乳酸, 其副产物较少, 转化率高( 有些菌体代谢葡萄糖产乳

9、酸的转化率达90% , 生产条件温和, 操作简单, 安全性高。目前, 世界乳酸产量的90%是由发酵法生产的, 其余是由化学合成的。国际上的D-乳酸生产也主要采用微生物发酵法。然而, 较高的原材料预处理费用是发酵法生产乳酸的一个瓶颈。例如,淀粉质原材料来源广泛且廉价,但不能被多数微生物直接利用, 需要将其液化、糖化为葡萄糖, 因此降低了该工艺的成本竞争力;木质纤维素是最为广泛和廉价的生物质原料, 然而其应用比淀粉原料更为困难, 预处理成本更高, 且其水解产物中的一些戊糖不能被多数微生物利用。研究微生物的代谢机制从而培育能够快速利用这些廉价原料乃至生活废弃物生产光学纯度D-乳酸的菌株, 并进一步提

10、高D-乳酸生产菌株的产量、底物转化率和生产强度, 对于乳酸的工业生产具有非常重大的意义。2.2 微生物的乳酸发酵类型按照微生物发酵糖类的过程和产物的不同, 可将乳酸发酵分为同型乳酸发酵、异型乳酸发酵和混合酸发酵三种类型5。同型乳酸发酵微生物经EMP途径, 将lmol葡萄糖转化成2 mol 乳酸,理论转化率为100%。考虑到发酵过程中的其他生理过程, 一般转化率在80% 以上即视为同型乳酸发酵。异型乳酸发酵微生物经HMP 途径将1 mol葡萄糖转化为1 mol乳酸、1molCO2和1 mol乙醇,其中产物乙醇与乙酸的比例取决于微生物体系中的氧化还原反应作用 14, 葡萄糖的理论转化率只有50%。

11、除Lactobacillus delbruelkii外的乳酸菌都是兼性异型乳酸发酵菌。在特殊情况下,如葡萄糖浓度受到了限制、pH 值改变或温度降低, 同型乳酸发酵微生物进行混合酸发酵。与同型乳酸发酵相同, 混合酸发酵也经由EMP途径, 但在丙酮酸的代谢途径发生了改变, 生成了甲酸、乙酸、乙醇等副产物。2.3 乳酸细菌用于生产D-乳酸的研究进展乳酸细菌作为传统的乳酸发酵工业的生产菌种,其优势在于: 自身就能合成高浓度的乳酸、对乳酸的耐受性较高、生产强度大等。然而, 大多数乳酸菌同时具有发酵型D-乳酸脱氢酶D(-LDH 和L-乳酸脱氢酶 L( + -LDH , 删除其中的L-LDH 编码基因可以将

12、该重组菌株用于发酵产光学纯度D-乳酸。如, 我国李剑6克隆了菌株Lactobacillus sp. MD-1 的D-LDH 基因, 序列分析表明该基因是一个新的D-LDH 基因, 将该菌株的L-LDH 基因敲除后突变株能够产生光学纯度97% 以上的D-乳酸。此外, 有的乳酸菌,还存在乳酸消旋酶,催化L-或D-乳酸向旋光性相反的乳酸类型转化, 直至两者比例达到平衡, 该酶的存在使得菌株即使只具有单一的LDH, 最终发酵产物仍为D, L-乳酸。基于以上研究, 应用大肠杆菌生产D-乳酸在培养基营养需求、D-乳酸产量、对葡萄糖底物的转化率、光学纯度等方面与乳酸细菌相比都已显示出巨大的优越性。然而, 微

13、生物的代谢调控是一个非常复杂的过程, 虽然人们已获得了很多E. coli遗传和代谢信息,许多代谢网络节点之间的作用仍不清楚, 选择一套最佳D-乳酸生产重组E. coli构建方案仍然不是一件容易的事, 还有待进一步研究。2. 5 其它D-乳酸生产菌株的研究进展谷氨酸棒杆菌常被用于生产L-谷氨酸和L-赖氨酸, 然而, 因其自身具有L-LDH, 也可利用无机盐培基生产高浓度的L-乳酸7。将其自身L-LDH 编码基因失活, 并表达来源于L.delbrueckii 的发酵型D-LDH基因, 所获得的菌株在无机盐培养基中经分批补料发酵, 达到60g/gDWC, 发酵30h产生1.336mol/L (120

14、g/L D-乳酸, 产物光学纯度大于99.9%。与上述产D-乳酸重组E. coli菌株相比, 该菌株同样营养需求简单、产物光学纯度高, 且能在更短的时间内获得高产量D-乳酸。但发酵过程中同时产生17g/L琥珀酸、3 g/L乙酸, 这些副产物的产生使得其D-乳酸转化率较低。进一步删除编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、乙酸激酶、CoA 转移酶的基因也许能够降低琥珀酸和乙酸的合成, 并提高乳酸的转化率。如上所述, 应用重组E. coli生产D-乳酸取得了较好的效果, 但若不添加中和碱, 低pH 值会抑制E. coli的生长和乳酸的合成, 而添加的中和碱与乳酸形成乳酸盐, 提取过程中将乳酸盐重新生成目的产物

15、乳酸较困难, 且大量的CaSO4废杂对环境造成了极大的污染, 限制了此方法的应用。酵母菌对低pH 的耐受性比大肠杆菌强, Ishida等构建了一株重组酿酒酵母菌,此菌株的丙酮酸脱羧酶1的编码基因被删除, 染色体DNA 中整合了两个拷贝的来源于Leuconostocm esenteroides的D-LDH 基因。在加入中和碱的条件下该重组菌能生产61.5g/L D-乳酸, 葡萄糖转化率为61.2%。值得注意的是, 若发酵过程中不加碱中和乳酸, 该菌株仍可将53. 0%的葡萄糖转化为54.2g/L 游离D-乳酸, D-乳酸光学纯度达到99.9% 以上。与上述乳酸生产菌株相比, 这一研究提供了不加中

16、和剂发酵生产纯D-乳酸的新途径。3、展望发酵工业的快速发展, 尤其是燃料乙醇生产的快速膨胀, 使得淀粉质原料如: 玉米、小麦、大米、红薯等变得已不再像从前一样丰富而廉价。此外, 这些粗原料的预处理过程极大地增加了D-乳酸发酵生产的成本, 使得其发酵产品在作为聚乳酸生产的原料时不具有价格优势。开拓新的原料来源, 如木质纤维素乃至生活废弃物类原料, 并对D-乳酸生产菌株的代谢途径进行改造使其能快速利用这些原料生产D-乳酸, 不仅可以降低生产成本而且可以避免发酵工业与人争粮的现象。虽然研究者们已在有关领域进行了大量的工作, 至今纤维素类原料的利用仍然困难, 还有待更深入的研究。基因工程手段在改造生产

17、菌株的代谢途径中体现了重要的作用, 并将是D-乳酸发酵生产菌株的研究趋势。通过代谢途径的改造理解微生物的代谢机制, 并将基因工程手段与发酵工艺控制相结合, 对D-乳酸生产菌株进行全局的代谢调控, 将有助于进一步降低副产物的含量, 提高产品的品质, 提高菌株的产量、转化率和生产强度等。D-乳酸发酵过程中存在的瓶颈性问题是, 大多数生产菌株耐酸程度有限, 需要在发酵过程中添加碱中和产物乳酸。然而, 产物乳酸钙对菌体生长和乳酸合成仍会产生一定的抑制作用, 影响产物浓度的提高, 同时乳酸钙的形成使分离纯化过程变得复杂, 使纯化成本增加。此外, 乳酸提取过程中产生的大量的硫酸钙废杂物是乳酸发酵生产的极大

18、污染。发酵过程中从培养介质中及时移走乳酸可达到减少产物抑制、控制pH值的目的, 从而有助于提高产量、生产速率和原料的利用率、降低产品后续提取成本等。近年来将发酵过程与产品分离、提取过程相结合的乳酸发酵生产技术得到了快速的发展。原位分离技术是指将生产细胞的代谢产物快速移去的方法。按照将乳酸产物从发酵液中移走的方式的不同, 可分为电渗析发酵、膜法发酵、萃取发酵和吸附发酵等。原位分离技术多应用于研究L-乳酸发酵, 尚无将原位分离技术应用于D-乳酸发酵的报道。因此, 在进一步开发耐酸性高的D-乳酸生产菌株的同时, 改进现有的乳酸原位分离发酵工艺, 实现D-乳酸发酵生产与分离的有效耦合具有重大的研究价值和广阔的应用前景。参考文献:1 王博彦,金其荣.发酵有机酸生产与应用手册