生物技术实验讲义

1、现代生物技术实验讲义 DNA重组技术与基因检测芯片技术 动物细胞培养及细胞活性检测技术 发酵工程及分离提取技术华东师范大学生命科学学院 SCHOOL OF LIFE SCIENCES , EAST CHINA NORMAL UNIVERSITY2007年9月引 言随着生物技术的发展，生物工程的专业技术人员的需求更为迫切，特别是生物技术已经渗透到各个行业，并已蓬勃发展。生物技术的发展不但要有深厚的理论基础，而且要求专业技术人员具有较强的动手能力，因为该学科是一门实践性较强的科学。在培养生物技术专业学生时要特别注意学生实验能力的培养，尤其是专业基本操作。本专业学生的实验课程已经包括生物化学实验、微

2、生物实验、基因工程实验、细胞工程实验和发酵工程实验等课程实验。这些实验为培养学生的基础操作能力、提高学生的实际动手能力等奠定了良好的基础，但是这些实验都是单个的小实验，各个实验各自为一体，没有系统地相互关联，学生完成实验后没有一个完整的概念。本实验以基因工程、细胞工程和发酵工程实验为基础，组成了生物工程中上游、中游和下游技术。其中每一个部分放弃了原来单独小实验的结构，而改为一个独立的大实验，增加了学生的设计性和主动性。这些实验既注重和加强了原来各自的实验内容，又注意到相互联系。本讲义分为三个部分，第一部分“DNA重组技术与基因检测芯片技术”；第二部分“动物细胞培养及细胞活性检测技术”；第三部分

3、“发酵工程及分离提取技术”。这些实验采取大实验方法，使学生有一个完整的操作过程，对理解生物工程的上游、中游和下游技术有了感性认识。第一部分DNA重组技术与基因检测芯片技术黄 静 陆泉枝 编目 录前 言31.相关基础知识 .41.1 DNA重组技术的基本原理.41.2 基因芯片技术的基本原理.62. 实验目的和要求 .72.1 DNA重组技术实验目的和要求.72.2 基因芯片技术实验目的和要求.73. 实验材料和仪器 .83.1 实验材料 .83.2 主要仪器设备 .83.3 实验器皿.83.4 细菌培养基.83.5 分子生物学试剂.83.6 SDS-PAGE电泳试剂93.7 基因芯片试剂.10

4、4. 实验内容.104.1 DNA重组技术实验内容 .104.2 基因芯片技术实验内容.115. 习题.126. 参考资源.126.1参考书目126.2 参考产品目录.136.3 参考网站.13附录一 质粒DNA的提取14附录二 琼脂糖凝胶电泳.15附录三 DNA的纯度、浓度的测定.17附录四 DNA的酶切和连接（体外重组）.18附录五 大肠杆菌感受态细胞的制备和重组DNA分子的转化19附录六 重组转化子DNA的鉴定（篮白斑筛选法）21附录七 重组转化子DNA的鉴定（限制性内切酶分析法）22附录八 DNA的体外扩增（PCR技术）23附录九 SDSPAGE电泳25附录十 毛囊中DNA的提取28附

5、录十一基因型检测芯片检测ACE基因多态性28前 言二十一世纪是生物学的世纪，分子生物学作为生物学最前沿的基础学科是生物学类专业通向生物高技术的必修课程。随着人们在分子生物学水平上的研究和学习的深入和广泛展开，除了在分子水平上了解生物学的本质特征外，在分子水平如何进行生物学操作是生物学界共同关心并十分重视的问题。“DNA重组技术”就是利用分子生物学的一般原理阐述在分子生物学实验中所涉及的技术方法、原理和策略，是一门指导分子生物学实验操作的理论与实践相结合的课程。随着生物科学和生物技术的日益发展，人们越来越重视对生物学研究手段的了解和掌握。作为新世纪的生命科学学院的大学本科生有必要学习DNA重组技

6、术的原理和方法，学会和掌握DNA重组技术。本实验讲义就是为基因工程操作的入门者而编写的。基因工程技术的核心内容就是DNA重组技术，即在分子水平上，用人工方法提取或合成不同生物的遗传物质，在体外切割、拼接和重新组合，然后通过载体把重组的DNA分子引入受体细胞，使外源DNA在受体细胞中进行复制与表达，按人们的需要生产出不同的产物或定向地创造生物的新性状，并使之稳定地遗传给后代。根据这一定义，基因工程技术涉及到极其广泛的生物学新技术新方法，但它又有一个基本的操作程序。因而，我们按照DNA重组技术的操作程序来安排实验，即从载体的选择目的基因的制备体外DNA的重组（酶切与连接）重组DNA分子引入受体细胞

7、转化子的筛选重组DNA分子的鉴定等步骤编排成一个综合性大实验。在这个综合性实验中，每一步实验既相对独立又与下一步实验紧密相连，只有获得第一个步骤的实验结果才能开始第二个实验。因此，实验也涵盖了所要训练的单项技术。在实验取材方面，我们以大肠杆菌为基本资料，建立适合于大肠杆菌的DNA重组技术实验。我们旨在通过这些实验，让同学们获得分子生物学最基本的技术训练，掌握最基本、最常用的技术，并对DNA重组技术有一个比较全面而系统的概念。此外，生物芯片技术已被国际公认为是正在和将要给二十一世纪的生物科学、医药、农业、环保等领域带来革命性变化的新技术，作为新世纪生物技术专业的大学生，有必要接触生物芯片的一些基

8、本知识。鉴于目前实验条件有限，本实验教程的内容仅涉及一种基因（ACE基因）的多态性检测，让同学们了解基因检测芯片技术的一般原理和操作技术，为今后的工作和学习打下基础。作 者2006.91. 相关基础知识1.1 DNA重组技术的基本原理基因工程技术的核心内容就是DNA重组技术，即在分子水平上，用人工方法提取或合成不同生物的遗传物质，在体外切割、拼接和重新组合，然后通过载体把重组的DNA分子引入受体细胞，使外源DNA在受体细胞中进行复制与表达，按人们的需要生产出不同的产物或定向地创造生物的新性状，并使之稳定地遗传给后代。强调外源核酸分子（一般情况下都是 DNA）在不同宿主中的繁殖，打破自然种的界限

9、，将来自不相关物种的基因放入一个宿主中是DNA重组技术的重要特征。另一个特征是繁殖。重组DNA技术主要包括以下几个要素：载体；工具酶；外源DNA，即要克隆或表达的DNA片断；原核或真核宿主细胞。基因克隆的基本步骤是先用限制性内切酶切割外源 DNA 和载体（质粒 DNA 载体或噬菌体载体），然后连接酶连接，组成DNA重组分子（重组质粒，见图1），转化入受体细胞，构建出基因文库，再筛选。除了通常的克隆外，还有亚克隆。初步克隆中的外源片段往往较长，含有许多目的基因片段以外的 DNA 片段，在诸如表达、序列分析和突变等操作中不便进行，因此必须将目的基因所对应的一小段 DNA 找出来，这个过程叫“亚克隆

10、”。图1 重组质粒构建示意图载体的作用是把外源DNA带进宿主细胞，并使之在细胞内建立稳定的遗传状态，在细胞内繁殖、传代或进行表达。质粒载体是最常见的载体，也是使用最方便的载体。它应用了质粒的复制、拷贝数及不相容性等性质。质粒载体有抗性基因、琥珀突变抑制基因等多种选择标记和 -互补、插入失活等筛选标记。常见的质粒载体有： pBR322、 pUC18/19、 pUC118/119、 pGEM-3Z/4Z以及一些多功能的质粒载体，如： pBluescriptKS（）。大肠杆菌表达载体是最常见的原核表达载体，可分为表达融合蛋白的载体和非融合蛋白表达载体。常用的标签蛋白有谷胱甘肽转移酶、六聚组氨酸肽、蛋

11、白质 A 和纤维素结合位点等。重组DNA所涉及的工具酶，最主要的是II型限制性内切酶和DNA连接酶。 型限制性内切酶用来切割DNA，相当于基因工程中的“剪刀”。II型限制性内切酶识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割 DNA ，产生带 3- 羟基和 5- 磷酸基团的 DNA 产物，需 Mg2+ 的存在才能发挥活性。识别序列主要为 4bp6bp ，或更长且呈二重对称的特殊序列，但有少数酶识别更长的序列或简并序列，切割位置因酶而异。如EcoRI 和 Hind 的识别序列和切割位置如下。 EcoR GAATTC Hind AAGCTT CTTAAG TTCGAA连接酶则是将两段核酸连接起来的酶，

12、相当于基因工程中的“糨糊”。常用的T4DNA连接酶是在T4噬菌体感染的大肠杆菌中发现和分离的，需 Mg2+ 和ATP的存在才能发挥活性。它能催化两条匹配DNA链的3OH和5P之间形成磷酸二酯键而把两个DNA分子连接在一起。外源DNA就是需要克隆的DNA片断，一般有四种来源。（1）限制性内切酶切割DNA产生的片断，经电泳分离后回收获得；（2）大DNA分子经人工剪切产生的片断，这种片断一般是平末端；（3）cDNA，即与mRNA互补的DNA，由真核基因的mRNA逆转录制备；（4）人工合成的基因，例如根据蛋白质的氨基酸顺序和遗传密码合成的一些基因。外源DNA分子与载体（质粒）经过相同的酶切可以产生相互

13、匹配的粘末端或平末端，经DNA连接酶连接就构成了重组DNA分子（重组质粒）。质粒的转化就是指将质粒或以它为载体构建的重组DNA分子导入细菌（受体细胞）的过程。这一步是实现重组克隆的增殖。受体细胞要接纳外源DNA，必须处于感受态。所谓感受态，就是细菌具有吸收周围环境中的DNA的生理状态。为了提高受体菌摄取外源DNA的能力，提高转化效率以获得更多的转化子，人们摸索出了不同的方法处理细菌，使其处于感受态。目前主要采用电转化法和CaCl2法将外源DNA导入受体细胞中，并需要相应地制备电转化感受态细胞和CaCl2感受态细胞。电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，因而使外源DNA能进入细胞，一般转化率为 1

14、09 1010 转化子 /g DNA；对于热激法，是利用冰冷的 CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的 “感受态”，易于摄取外源DNA。转化率约106 107转化子 /g DNA。获得转化子后可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。首先可根据转化细胞的特征进行初步筛选。由于载体都具有供筛选用的遗传标记，如抗生素，细胞转化后获得了这种遗传特性，使用含适当的相应抗生素的培养基即可初步筛选出转化的细菌。经过培养初步筛选出来的细菌不一定都含有重组DNA，还需进一步对DNA进行分析。常用方法之一是进行重组质粒的抽提，然后电泳分析，观察其分子量与原有载体相比是否增大；方法之二是将抽提的重组质粒进

15、行限制性内切酶分析，观察酶切下来得到的DNA片段大小是否与预计的相符；方法之三是以重组质粒为模板进行PCR鉴定，观察PCR产物的大小是否与目的基因大小相符；方法之四则是将重组质粒进行DNA序列分析，直接分析重组质粒上的插入片段即目的基因的大小与序列是否正确。在确证得到核酸序列一致的基因后，接下来就要想办法使该基因得到表达，获得基因表达产物蛋白（肽）。通常采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对蛋白质进行量化、比较及特性鉴定。SDS-PAGE电泳不但能观察到蛋白在电场中的泳动位置，而且还能知道蛋白的分子量大小以及由几个亚基组成。此外，还可将电泳胶上的蛋白质条带转移到尼龙膜上，以亲和反

16、应或免疫反应来检测特异蛋白的存在，即所谓的Western Blotting。在基因表达产物也得到确证之后，就可以对表达的蛋白（肽）进行发酵和分离纯化，并研究其生物学功能。1.2基因芯片技术的基本原理基因芯片（genechip）技术是自20世纪90年代初发展起来的新兴技术，又称DNA芯片（DNA chip），是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，然后与待测的标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统或CCD成像扫描系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检测，从而迅速得出所要的信息。基因芯片基本技术通常包

17、括：芯片制作、样品制备（标记）、生物分子反应（杂交）以及数据分析（杂交信号的检测及分析）等步骤。在本实验教程中，我们给大家介绍单基因多人份的基因检测芯片的基本原理和技术。本实验教程使用的基因芯片制作是在醛基修饰后的玻璃基片上制造的。DNA探针（寡核苷酸片段，与被检测的靶DNA互补）溶液与点样缓冲液以1：1比例混合，通过点样仪点到醛基基片上，然后用芯片活化液固定8小时。固定后DNA探针将与醛基玻片共价结合，形成阵列；在基因阵列周围贴上反应舱，完成芯片制作过程。样品制备：通过向样本，如毛发、口腔粘膜脱落细胞、全血中加入抽提液，煮沸、离心等操作，使样品中的细胞裂解释放出DNA、同时使蛋白变性沉淀，完

18、成样本DNA的抽提。抽提获得的染色体DNA浓度太小，直接进行杂交检测无法获得信号。将抽提获得的染色体DNA作为模板，进行PCR扩增。针对待检基因序列的SNP位点，设计20bp左右的上、下游引物用于扩增靶DNA，同时，在引物的5端加上标签序列，对扩增靶DNA进行标记。杂交反应：将扩增后的PCR产物变性成单链DNA分子，由于基因芯片上固定有与标签序列相结合的标签探针，可与PCR扩增产物通过碱基配对进行特异性杂交。这样，芯片上的每个标签探针都结合有一个扩增靶DNA分子。然后将芯片与经生物素（Biotin）标记的特异性检测探针进行杂交，就可以知道样本DNA序列中的SNP信息，即到底是属于野生型还是突变

19、型，是杂合子还是纯合子。在杂交反应中，序列组成、靶标DNA分子和探针的长度、杂交温度、盐浓度等均会影响杂交效率和强度。显色原理：采用生物素标记的碱性磷酸酶（AP）催化的NBT/BCIP显色反应的检测方法。首先，特异性检测探针上的生物素先与链亲和素碱性磷酸酶复合物（Stripavitin-AP）反应，生成新的复合物：Biotin-Stripavitin-AP，后者发生如下的显色反应：Biotin-Stripavitin-AP + BCI-P BCI-OH + Pi （pH 7.5）BCI-OH + NBT 蓝紫色沉淀 其中，BCIP为5溴-4氯-3吲哚磷酸；NBT为硝基四氮唑蓝。检测原理：采用C

20、CD（ Charge Coupled Device 即电荷耦合器件）原理，将芯片上的色斑信号扫描成图像，用Array Doctor分析软件进行分析，给出靶基因SNP信息。单基因多人份基因芯片检测原理示意图2实验目的和要求2.1 DNA重组技术实验目的和要求本实验利用质粒载体克隆外源DNA片段，通过这个实验大家可以掌握质粒载体的抽提、外源DNA的准备、酶切、连接及感受态细胞的制备、连接产物的转化以及阳性克隆子的鉴定和验证等。2.1.1 提取基因工程中的运载基因的载体DNA，掌握最常用的提取和纯化DNA的方法。2.1.2 掌握琼脂糖凝胶电泳的原理，学习琼脂糖凝胶电泳的操作。并以此法进一步区分质粒D

21、NA中染色体DNA和RNA的污染；估计出质粒DNA分子量的大小；观察质粒DNA三种基本构象的比例；也可用此法纯化DNA及计算出DNA的浓度，是基因工程实验中最常用的实验方法。2.1.3 学习和掌握用紫外分光光度法测定DNA的纯度和浓度。2.1.4 学习和掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法。了解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具，琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定DNA片段的有效方法。2.1.5 学习和掌握感受态细胞的制备过程。2.1.6 掌握质粒的转化方法，学习把体外重组的DNA（即连接反应物）导入受体细胞（感受态细胞），使受体菌具有新的遗传特性，并从中选择出阳性转化子。2.1.

22、7 学习从转化子中筛选和鉴定目的克隆的方法，掌握菌落PCR和限制性内切酶酶切两种鉴定方法。2.1.8 掌握PCR反应的基本原理与实验技术，了解引物设计的一般要求。2.2基因芯片技术实验目的和要求2.2.1 了解从毛囊中提取基因组DNA的原理和技术。2.2.2 了解在PCR扩增过程中如何对样品进行标记。2.2.3 掌握核酸杂交反应原理，将样品与生物素标记的探针杂交，通过检测杂交信号得出基因的基因型。2.2.4 熟悉利用基因芯片技术检测人染色体基因多态性的基本原理和方法。3实验材料和仪器3.1实验材料：菌种：大肠杆菌JM101，大肠杆菌DH5质粒：pUC18/19（Ampr）3.2主要仪器设备：超

23、净工作台；恒温培养箱；恒温振荡器；恒温水浴锅；微波炉；低温冰箱；台式高速离心机；漩涡混合器；分析天平；脱色摇床稳压电泳仪；垂直/水平式电泳槽；紫外可见光分光光度计；紫外检测仪；SDS-PAGE电泳系统PCR扩增仪；凝胶成像分析系统ACE基因检测芯片（上海百傲科技有限公司提供）BaiO生物芯片识读仪（上海百傲科技有限公司提供）Array Doctor分析软件（上海百傲科技有限公司提供）3.3实验器皿：锥形瓶；试管；烧杯；量筒；三角推棒；培养皿；tip头；Eppendorf管；微量移液枪（2l1000l）；微量进样器（50l或100l）；一次性手套，牙签。3.4细菌培养基：LB液体培养基蛋白胨 1

24、.0酵母膏 0.5NaCl 0.5%pH 7.5固体培养基加入2琼脂。将上述培养基灭菌后（1.1公斤/ cm2，保温20分钟），加入100mg/ mL的Amp，使其终浓度为100ug/ mL。3.5分子生物学试剂：RNaseA溶液: 10mg/ mL，0.1M NaOAc pH 4.8, 0.3mM EDTA，80100加热10分钟，自然冷却到室温，分装，20保藏。DNA Marker；限制性内切酶EcoRI或Hind III；DNA（线状）；质粒纯化Kit；TaqDNA聚合酶，4dNTP；引物溶液I：50mM 葡萄糖；25mM Tris-HCl(pH8.0)；10mM EDTA溶液II：0.

25、2N NaOH；1%(w/v)SDS溶液III：5M KAc 60mL； 冰醋酸 11.5 mL； H2O 28.5 mL核酸上样缓冲液：50蔗糖，0.2溴酚兰溶液（1） TBE 缓冲液（Tris-硼酸）：89 mM Tris-硼酸；2 mM EDTA（pH8.0）。（2） TAE缓冲液（Tris-HAc）：0.04M Tris-HAc，1 mM EDTA（pH8.0）。琼脂糖：按所需浓度称取，并用核酸电泳缓冲液配制，微波炉或煤气加热熔化使用。EB染液替代品：Goldernview 染料氨苄青霉素（Amp）溶液: 100mg/mL，无菌水溶解IPTG溶液（20，m/V）：20mg X-gal

26、溶于 1mL二甲基甲酰胺中，-20 避光保存X-gal溶液（20，m/V）：1g IPTG 溶于 4mL去离子双蒸水中，定容至 5mL，过滤灭菌后，-20 保存 苯酚：氯仿：异戊醇25：24：1（V/ V/ V）70%冷乙醇（20保藏）3.6 SDS-PAGE电泳试剂：储备液12M Tris-HCl (pH8.8),100ml21M Tris-HCl (pH6.8),100ml310%SDS,100ml450%甘油,100ml550%溴酚兰,10ml工作液A液：100ml130%丙烯酰胺(29.2g)20.8%甲叉双丙烯酰胺(0.8%)加蒸馏水至100ml，过滤，棕色瓶避光保存。B液：100m

27、l175ml 2M Tris-HCl(pH8.8)24ml 10%SDS1 21ml H2OC液：100ml150ml 1M Tris-HCl(pH6.8)24ml 10%SDS346ml H2O过硫酸铵，5ml0.5g过硫酸铵溶于5ml 蒸馏水。电泳缓冲液，1L13g214.4g甘氨酸31g SDS加蒸馏水定容到1L。5上样缓冲液，10ml10.6ml 1M Tris-HCl (pH6.8)25ml 50% 甘氨酸32ml 10% SDS40.5ml 2-巯基乙醇51ml 1% 溴酚兰染色液, 1L11g考马斯亮蓝R-2502450ml甲醇3450ml H2O4100ml乙酸脱色液，1L11

28、00ml乙醇2100ml冰醋酸3800ml H2O其它试剂均为国产分析纯3.7基因芯片试剂：毛囊DNA提取试剂盒，Baio基因型检测芯片试剂盒（上海百傲科技有限公司提供）4实验内容4.1 DNA重组技术实验内容4.1.1载体的制备从大肠杆菌中提取质粒作为运载外源基因的载体。并将提取到的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，观察质粒大小、构型和纯度。为作下一步的酶切，连接及转化试验，还必须测定DNA的纯度和浓度。将提取到的质粒用分光光度计检测 260nm、280nm 波长吸光值，可检测质粒纯度并根据吸光值计算出浓度。4.1.2目的基因的制备根据已知基因序列，设计两条引物，运用PCR方法扩增出目的基因片断。将扩

29、增片断用琼脂糖凝胶电泳检测，用PCR产物回收Kit纯化PCR产物，为下一步酶切准备。注意，如果是真核基因，应该是用其cDNA序列进行克隆。4.1.3体外DNA的重组（酶切与连接）选择合适的两种限制性内切酶对供体（目的基因）和受体（载体）同时进行酶切，产生相匹配的粘性末端，再利用T4DNA连接酶将基因片段与载体连接起来，在体外构建成重组DNA分子。4.1.4重组DNA分子引入受体细胞制备大肠杆菌感受态细胞。将重组DNA分子转化入感受态细胞，抗性平板筛选并培养过夜观察。4.1.5转化子的筛选利用重组质粒的氨苄抗性和蓝白斑筛选法对转化子进行初筛。4.1.6重组DNA分子的鉴定采用菌落PCR法鉴定和限

30、制性内切酶分析来进一步确定阳性克隆。或者通过DNA测序来直接检验。4.1.7目的基因产物的检测将阳性克隆发酵培养，若是诱导表达质粒，则加入诱导物进行诱导表达，然后用SDS-PAGE分析目的基因产物的大小与表达量等，若有合适抗体，还可直接用Western blotting检测目的基因是否表达。4.2 基因芯片技术实验内容4.2.1毛囊中DNA的抽提采集带毛囊的毛发，经裂解后分离出全基因组DNA。4.2.2人染色体ACE基因的PCR扩增将抽提获得的全基因组DNA作为模板，进行PCR扩增。针对ACE基因（Angiotensin Converting Enzyme 血管紧张素转化酶）序列的SNP位点，

31、设计20bp左右的上、下游引物用于扩增靶DNA，同时，在引物的5端加上标签序列，对扩增靶DNA进行标记。4.2.3 ACE基因的基因型检测芯片杂交、显色、检测实验将PCR扩增产物进行预杂交，使PCR产物的标签序列与基因芯片上的标签探针结合。提高温度，将基因芯片与带有生物素标记的特异性检测探针杂交、显色并进行检测分析。4.2.4检测结果的验证实验（琼脂糖凝胶电泳方法）人类ACE基因的16内含子中，存在287bp的插入/缺失(I/D)多态性。因此通过PCR扩增再进行琼脂糖凝胶电泳检测，可以发现有490bp(I等位基因)和190bp(D等位基因)两个片段，故可出现三种DNA基因型：（1）由两个490

32、bp等位基因构成的基因型II；（2）由两个190bp等位基因构成的基因型DD；（3）由一个490bp、一个190bp等位基因组成的基因型ID。因此，可以通过电泳验证基因芯片的检测结果。13图4.1 ACE扩增产物的电泳结果M：分子量标记II：纯合子插入型ID：杂合子插入/缺失型DD：纯合子缺失型5习题1.原核表达系统的基本要素有哪些？2.为何真核基因在原核系统中表达时要用其cDNA进行克隆？3.实验小论文以“基因的克隆和表达”为题，模拟一个来源于真核生物的基因在大肠杆菌中进行表达的实验论文。要求简单介绍欲克隆基因的背景知识，克隆策略及重组DNA分子筛选等内容。书写格式请参考中国科学杂志上相关文

33、章格式。实验小论文中应包含如下内容：标题，摘要（中英文），关键词，前言，材料，方法，结果，讨论和参考文献等。4.如何实现一人份多基因检测的基因芯片设计、制备？6参考资源6.1参考书目：1. 分子克隆实验指南（第三版），科学出版社翻译版，20022. 基因工程原理（第二版）上册，吴乃虎，科学出版社，19983. 基因工程原理（第二版）下册，吴乃虎，科学出版社，20014. 现代基因操作技术，胡福泉主编，人民军医出版社，20005. 基因工程概论，张惠展编著，华东理工大学出版社，19996. 基因工程实验技术（第二版），彭秀玲编著，湖南科学技术出版社，19987. 生物芯片技术实验教程，邢婉丽，程

34、京主编，清华大学出版社，20066.2参考产品目录：很多分子克隆技术是由一些知名公司开发出来的，其分子生物学产品目录产品介绍部分有很多值得我们学习的信息。她既对产品所涉及的基因操作原理作出论述，也对产品的技术参数作出详细的比较介绍。其工作原理、操作步骤深入浅出，图文并茂，帮助初学者对操作原理和实验步骤的理解。其附件、附表等参考信息栏目对研究工作者也有很强的借鉴意义。如 New England Biolabs 公司在分子生物学试剂方面， Bio-Rad公司在分子生物学仪器方面 都有很深的造诣。1.Invitrogen公司分子生物学产品目录2.New England Biolabs 公司分子生物学

35、产品目录 3.Promage公司分子生物学产品目录 4.TAKARA公司分子生物学产品目录 6.3参考网站：互联网上有很多关于分子生物学以及生物芯片的网站，这里仅仅罗列了一部分。 生物谷 中国生物论坛 中文分子生物学个人交流网 冷泉港实验室 美国国立生物信息中心上海百傲科技有限公司附录.附录一 质粒DNA的提取质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化。

36、本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程。一、原理：从细菌如大肠杆菌或枯草杆菌中提取DNA的方法很多，其分离原理可根据DNA分子大小的不同、碱基组成的差异以及质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构的特点来进行。目前常用的有碱变性提取法、酸酚法；PEG法、煮沸法以及溴化乙锭氯化铯梯度离心法。这些方法各有利弊，有的操作繁琐，难以控制，有的纯度不够，有的需要昂贵的仪器。而碱变性法被认为是一种既经济，且DNA收得率又高的被普遍采用的提取方法。用这种方法提取的DNA可用于酶切、连接和转化。碱变性法提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。在pH高达12.6的碱性条件下，

37、染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环结构的两条互补链不能完全分离，当以pH4.8的NaAC缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，保存于溶液中，而染色体DNA不能复性，形成缠连的网状结构，通过离心与不稳定的大分子RNA、蛋白SDS复合物等一起沉淀下来而去除，从而达到分离的目的。二、操作步骤：1. 挑取大肠杆菌JM101（pUC19）单菌落接种于20mLLB液体培养基中（含氨苄青霉素100ug/ mL），于37振荡摇床中培养过夜（1012小时）。2. 取1.2mL培养物入一1.5mL Eppendorf管中，12000

38、 rpm，离心20s，弃尽上清。3. 往沉淀中加100ul溶液I，旋涡器上振荡使菌体重悬，37水浴15min。4. 往3中溶液加200ul溶液II，轻柔混匀至溶液澄清，冰浴5min。5. 往4中溶液加150ul溶液III，轻柔颠倒2次，冰浴10min；12000rpm，离心15min。吸上清，转入一新的1.5mL Eppendorf管中。6. 往5中上清加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）混合物，用力混匀成乳状不分层；12000rpm，离心10min。7. 吸6中上清，转移至新的1.5mL Eppendorf管中，加入等体积氯仿，用力混匀；12000rpm，离心5min。8. 吸7中

39、上清至新的无菌1.5mL离心管中，加入等体积异丙醇，室温放置15分钟；或加入两倍体积的无水乙醇；-20 静置30min。12000rpm，离心15min。9. 小心弃去上清，加入1mL -20预冷的70%乙醇，颠倒3次，12000rpm，离心2min；弃尽液体，室温干燥至沉淀变透明。10. 加入20ul无菌水溶解沉淀；RNaseA（10mg/mL） 1ul（1/20体积加入，终浓度0.5 mg/mL），37水浴15分钟。-20保藏。pUC19质粒示意图附录二 琼脂糖凝胶电泳一、原理： 溴化乙锭（EB）在紫外光照射下能发出荧光。当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，加入的EB就插入DNA分子中形成荧

40、光络合物，使发射的荧光增强几十倍。而荧光的强度正比于DNA含量，如将已知的标准样品做电泳对照，就可估计出待测样品的浓度。电泳后的琼脂糖凝胶直接在紫外灯下拍照，只需510ng（1ng=10-9g）DNA，就可从照片上比较鉴别。如肉眼观察，可检测0.05g0.01g的DNA。在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与分子量的对数值呈反比关系。可以以此特征区别染色体DNA、质粒DNA和RNA，若用小刀取下含质粒DNA的凝胶带经电泳洗脱则可得纯DNA。若将质粒DNA用单一切点的酶消化后，与已知分子量大小的标准DNA片段进行电泳对照，观察其迁移距离就可估计出该样品分子量的大小。DNA分子在凝胶中泳动的速度还与

41、DNA分子本身的构型有关，共价闭合环状DNA（cccDNA）,一条链断开的开环DNA（ocDNA）,两条都断开的线状DNA（LDNA）在电泳中的迁移速率不同，一般cccDNA泳动最快，LDNA次之，ocDNA最慢，因而可以通过电泳来区别质粒DNA的构型。二、操作步骤： 1、选择适当大小的电泳槽（大、中、小、微等类型）。 2、选择适当大小的点样梳其底部离电泳槽水平面的距离为12mm。 3、制备琼脂糖凝胶：按照被分离DNA分子量的大小，决定凝胶中琼脂糖的含量。一般可参照下表：琼脂浓度（%）2.0分离线型DNA分子的有效范围（Kb）5601200.8100.570

42、.460.240.13 4、称取1%浓度的琼脂糖，加入TBE（或TAE）缓冲液，在微波炉中熔解，待凝胶冷却到50左右时，轻轻倒入电泳槽水平板上，除掉气泡。 5、待凝胶冷却至凝固后，在电泳槽内加入电泳缓冲液，使其正好漫过凝胶表面，然后取出点样梳，保持点样孔的完好。 6、在待测样品中加入1/5体积的上样缓冲液，混匀后小心地进行点样。每孔加样1015l,一般不超过20l。 7、打开电源开关，最高电压不超过5V/cm,即小电泳槽不得超过50V,当琼脂糖浓度低于0.5%时，电泳温度不能太高。 8、电泳时间随实验具体要求而定，一般待DNA带分开后即可停止，当溴酚蓝泳动至2/3凝胶时可停止电泳，约需1.5小

43、时左右。 9、电泳结束后，小心取出凝胶，放入染色液中染色15左右。 10、将凝胶放在紫外观察灯下观察电泳结果。质粒构型观察示意图附录三 DNA的纯度、浓度的测定紫外分光光度法一、原理：核酸具有吸收紫外光线的能力，在波长为260nm的条件下具吸收峰值，而蛋白质在280nm时具有吸收峰值。根据经验数据，纯核酸溶液OD260=1.82.0时，认为已达到所要求的纯度。在样品中含有蛋白质等杂质时，会使OD260/OD280的比值下降。用此法测定时，只能区别核酸和蛋白质，而无法区别质粒DNA与染色体DNA及RNA。二、计算DNA浓度（g/mL）=OD260稀释倍数/0.026LDNA纯度= OD260/

44、OD280（要求比值在1.82.0范围内）注：L为比色杯厚度（cm,一般为1cm。）核酸和蛋白质的吸光度蛋白质/%核酸/%OD260：OD280蛋白质/%核酸/%OD260：OD28010000.5745551.899551.0640601.9190101.3235651.9385151.4830701.9480201.5925751.9575251.6720801.9770301.7315851.9865351.7810901.9860401.815951.9955451.8401002.0050501.87三、操作步骤：1、取石英杯两只，分别加入TE缓冲液2990l。2、在对照杯中加入10

45、l TE buffer,在样品杯加入10l样品。盖上盖子，上下几次摇匀。3、放入751型分光光度计的比色槽中，使用氢灯，分别测出OD260和OD280的值。4、按上述计算公式算出你所制备的DNA的纯度和浓度。附录四 DNA的酶切和连接（体外重组）一、原理：各种限制性内切酶能专一的识别和切开特定的碱基顺序：Hind III酶识别和切割顺序为：5AAGCTT33TTCGAA5Hind III在载体pUC19上只有一个酶切点，用Hind III酶切载体pUC19时，就产生带有AGCTT的5粘性末端的线型DNA分子。用Hind III切DNA（48.5kb），则产生23130，9416，6557，43

46、61，2322，2027，564，125bp大小8个片段。由于采用同样的限制性内切酶酶切质粒pUC19和DNA，在T4DNA连接酶的作用下，pUC19（载体）和DNA（供体）不同大小片段的DNA粘性末端共价结合，产生一个线型的重组DNA分子。在T4DNA连接酶的继续作用下，重组DNA分子两端的粘性末端又共价结合，自身环化成为一个重组的环形DNA分子。二、操作步骤：1、酶切反应：按顺序在灭菌的1.5mLEppendorf管中加入（1） 无菌去离子水（2） 10酶切缓冲液（3） DNA或质粒pUC19（4） 限制性内切酶EcoRI或Hind III（在冰浴中进行，防止酶失活）。盖紧上述两只Eppe

47、ndorf管盖子，用手指弹几次使混合均匀。在离心机上离心5s，使样品溶液集中到Eppendorf管底部。于37水浴酶解2小时后，取上述两个样品的酶切反应物溶液各4l，进行琼脂糖凝胶电泳，观察酶切反应情况。剩余的样品继续在37水浴中酶切2小时。待电泳观察酶切反应完全后，将上述反应液置65水浴中保温10-15分钟，中止酶切反应。2、连接反应：按顺序在灭菌的1.5mLEppendorf管中加入（1） 无菌去离子水（2） 10T4DNA连接酶缓冲液（3） 供体：DNA酶切（纯化）产物（4） 载体：质粒pUC19酶切（纯化）大片段（5） T4DNA连接酶（在冰浴中进行，防止酶失活）注意：为取得较好的转化

48、效率，供体和载体的摩尔比应控制在310：1。 将连接反应管中摇匀后放入12条件下连接反应过夜或16下连接反应2-3小时。操作中的注意事项：1、基因工程是微量操作技术，DNA样品与内切酶的用量都极少，必须严格注意吸样量的标准性。2、要注意酶切时加样的次序，各项试剂加好后，最后再加酶液。待用的内切酶要放在冰中，用后立即放回-20冰箱，防止内切酶失活。3、凡用在酶切和连接反应中的一切塑料器皿（Eppendorf管，吸头等），都要反复用水洗干净，最后用ddH2O清洗，湿热灭菌，置50温箱中烘干，使用前打开包装，用镊子夹取，不直接用手去拿，严防手上杂酶污染。4、当样品在37与65保温时，请注意防止因盖子

49、未盖严密使水汽进入管内，使溶液体积大量增加而造成实验失败。同时要防止由于标签脱落而分不清样品类型。附录五 大肠杆菌感受态细胞的制备和重组DNA分子的转化一、原理：重组DNA转化不同细菌有不同的转化效率。转化效率的高低与受体菌的感受态有关。所谓感受态，就是细菌具有吸收周围环境中的DNA的生理状态。关于感受态的本质与存在，说法很多，目前主要两种假设：1、局部原生质体化假说，即认为是由于细菌表面的细胞壁结构发生变化局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA分子能通过细胞膜进入细胞；2、酶受体假说，认为感受态细胞的表面形成一种感受态的细胞使极少数。而只有感受态的细胞才能稳定地收取外源DNA分子。而且感受

50、态是在短暂时间内发生地。一般出现在细菌对数生长的后期。作为基因工程的受体菌必须是基因重组缺陷突变体，必须能同外来DNA分子发生遗传重组，同时它们又必须是限制系统缺陷或限制与修饰系统均缺陷的菌株。使外来基因（DNA）不受其限制酶的降解，这样才能进行遗传操作。受体菌的感受态往往通过CaCl2处理而获得。DNA分子转化的复杂过程如下：1、吸附：完整的双链DNA分子吸附在受体菌的表面；2、转入：双链DNA分子解链。单链DNA分子进入受体菌，另一条链被降解；3、自稳：外源质粒DNA分子在受体菌内又复制成双链环状DNA；4、表达：外源基因随同复制子同时复制，并被转录翻译。对DNA分子来说，成功转化的比率极

51、小，仅占DNA分子的0.01%。二、操作步骤：（一）大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法) 1、从新活化的E.coli DH5菌平板上挑取一单菌落，接种于35mL LB液体培养中，37振荡培养12h左右，直至对数生长期。将该菌悬液以1:1001:50转接于100mL LB液体培养基中，37振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔2030min测一次OD600nm，至OD600nm0.5时停止培养；2、每组取培养液2个1.5mL转入1.5mL离心管中，在冰上冷却20-30min，于4，4000rmin离心10min（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）；3、倒净上清培养液，用

52、1mL冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴；4、04，4000rmin离心10min；5、弃去上清液，加入500l冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液，小心悬浮细胞。04，4000rmin离心10min；6、弃去上清液，加入100l冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液；7、制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，也可加入占总体积15左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5mL离心管中，置于-70条件下，可保存半年至一年。（二）细胞转化1、分别取3个100l感受态细胞悬液(如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操作)，第一组，加入10 l重组质粒DNA(体积不超过10l)+ 100l感受态细胞，此管为转化实验组。第二组，插入DNA片段对照组，即酶切后DNA片段25ng+100l感受态细胞悬液；第三组，质粒DNA对照组，即1ng 未