食品生物技术导论结课论文

1、食品生物技术导论结课论文题作者姓名：田童童专业：班级：学号：2009113248【摘要】建立在DNA 杂交基础上的基因探针技术是现分子生物学中的一种常规技术。用基西探针技术检测食品中的有害镟生物具有特异性强、灵敏度高和操作简便、省时等优点。近年来，有关非放射性基园探针、DNA生物侍感器探针及分子信标探针等技术研究取褥的重要进展，必将加速基因探针技术在食品擞生物检测中的应用。奉文对多种基哥探针的技术原理与研究应鬲概况及最新进展进行了综述讨论。【关键词】基因探针技术应用发展近几十年来，随着分子遗传学的不断发展和基因工程技术的广泛应用，人们清楚地认识到，核苷酸序列含有生命有机体构成、维持生命必须的遗

2、传信息。不同种生物含有不同的DNA 序列，同种生物含有相同的DNA 序列，并且这种核苷酸顺序是相对稳定的，可以用来检测遗传病和鉴定样本中的微生物。所谓基因探针，是能识别特异碱基序列(基因的有标记的一段单链DNA(或RNA分子，也可以说一段与被测定的核苷酸序列(靶序列互补的带标记的单股核苷酸。基因探针技术的发展和应用为传染病诊断、流行病学调查、食品卫生检验、肿瘤和人类遗传病早期检测等工作打开了一个新的局面，达到了特异性强、敏感度高、简便和快速的目的。一、DNA探针技术研究进展自1975年Southe1"11首次提出DNA 探针杂交技术以来，DNA探针技术在许多方面都已获得了改进和发展，

3、并已成为现代分子生物学中一种基本技术。目前所使用的DNA 探针杂交方法总体上可以分为2类：一是异相杂交(heterogeneousassay即固相杂交技术；二是同相杂交(homogeneousassay即液相杂交技术。另外根据DNA 探针的标记方法可分为放射性标记探针和非放射性标记探针。异相杂交技术1. Southern 印迹法Southern 印迹法(Southernblotting是最早的DNA 探针杂交技术，由英国分子生物学家Southern 所发明。Southern印迹法的全过程见图1。首先将从待检测样品中提取的DNA 经限制性内切酶降解后，用琼脂糖凝胶电泳进行分离。将带有DNA 片段

4、的琼脂糖凝胶浸泡在碱中使DNA 变性然后将变性的DNA 转移到硝酸纤维素膜上，在80下烘烤46h，使DNA 牢固地 吸附在膜上，然后与放射性标记的DNA 探针进行杂交数小时后，通过洗涤除去未杂交的DNA 撩针。将硝酸纤维素膜烘干后进行放射白显影，杂交结果即可在x 光片上显示出来。图1Southern 印迹法原理示意图2.非放射性DNA 探针最早使用的DNA 探针都是用同位素标记的。目前，放射性标记探针仍然是许多实验中常用的DNA 探针，其中使用最多的是放射性标记元素P。用来标记的同位素的放射性强度越高。信噪比也就越高，结果越好。但是P 有一些其自身难以克服的缺点，一是寿命短，其半衰期只有13d

5、；二是操作起来比较危险；三是要求有特殊的实验操作设备；四是放射性废弃物的处理十分繁琐。为此人们研究开发了非放射性DNA 探针检测方法。目前比较常见的非放射性DNA 探针检测系统是通过酶促反应将特定的底物转变为生色物质或化学发光物质而达到放大信号的目的。具体操作时大多采用将生物素(bjotin标记的核苷酸掺入到DNA 的方法制备探针操作过程(见图2大致如下：(1将生物素标记的探针杂交到目标DNA 上去；(2加入抗生物素蛋白(avidin或链霉抗生物素蛋白(streptavldin；(3加入一种经生物素标记的酶，如过氧化物酶或碱性磷酸酶；(4根据不同的酶，加入不同的生色或化学发光的底物，根据颜色变

6、化或化学发光来检测杂交结果。图2非放射性DNA 探针检测原理示意图3.DNA 生物传感器探针DNA 生物传感器探针技术是近年来发展起来的一项新技术。目前研究使用的大部分DNA 生物传感器探针的技术原理是将DNA 探针固定在支持体的表面，通过检测DNA 探针与特定的目标DNA 的专一性杂交而产生的光、电等信号的变化考查DNA 探针的杂交情况。与一般的异相杂交技术相比DNA生物传感器探针技术中省去了对DNA 探针进行放射性同位素标记或酶标记的处理。而且很多DNA 生物传感器装置可以实现对DNA 探针杂交过程的实时监测。目前，人们已用石英晶体微天平、表面等离子体子共振等技术构造DNA 生物传感器lj

7、J，获得了较好的结果。下面以金钦汉等最近报道的干扰素表面等离子体子共振(surfaceplasmon resolance，SPRDNA 生物传感器为例说明其工作原理及大致过程ljJ。该装置以碘钨灯作光源，同时检测400800m波长范围内反射光强度与入射波长的关系。利用生物素亲和素系统的相互作用将DNA 探针固定于金膜表面(见图3，通过测定杂交过程中体系的共振波长的变化值，考查DNA 探针的杂交情况。 图3利用生物素一亲和素系统固定DNA 探针的原理示意图同相杂交1.双探针常规技术固相杂交中探针非特异结合于支持物表面，降低了灵敏度。同相杂交技术最早由HeHer 和Mirrison 提出，该项技术

8、的特点是不髂要支持物减少了固定DNA 以及去除未杂交DNA 等操作。常规的同相杂交技术中使用了2个探针，这2个探针分别与目标DNA 的2个相邻区域互补。第1个探针在3末端标记第2个探针在5末端标记，利用标记物的光谱特性。使第一标记物为第二标记物的能量供体。当探针与目标DNA 杂交时，2个探针彼此靠近，通过光吸收或化学反应激发供体标记物并通过能量转移I 起受体标记物的激发，因此通过测定第一标记物发射光的减少或第二标记物发射光的增加即可定量考查DNA 探针的杂交情况。另外一种双探针同相杂交技术所采用的2个探针的碱基互补，且与目标DNA 上的同序列相对应。将一个探针的5末端标记荧光素，另一互补探针的

9、3未端标记荧光素淬灭剂。当无目标DNA 时，两探针结合，荧光素的能量转移至淬灭剂，不产生荧光。存在目标DNA 时，探针与目标DNA 之间竞争杂交，并在494496D_lll光照下产生荧光。荧光信号的强度与目标DNA 的浓度成正比。2.分子信标探针同相杂交一般同时采用2个标记探针最近Tyagi 等首次建立了分子信标探针(molecularheaconprobe，即在同一探针的5末端标记荧光紊，3末端标记荧光紊淬灭剂。分子信标探针的工作原理如下：当无目标 DNA 时，DNA 探针由于两端碱基的互补配对而形成发夹 结构，使荧光紊靠近淬灭剂，荧光紊接受的能量通过共振转移至淬灭剂，淬灭剂吸收能量后以 热

10、量形式散失，结果不产生荧光。当有目标 DNA 存在时，由于分子标探针的噜扑环与目标 DNA 的碱基互补，因此通过与目标 DNA 的分子杂交，形成了比发夹结构更加稳定的杂交双链 DNA 分 子，探针的构型同时发生改变，使两臂分开，荧光紊和淬灭剂也随之分开，此时在紫外光下， 荧光紊产生荧光。Sanjay 用与噜扑环完全互补且等长的 DNA 与分子信标探针杂交，发现当目 标 DNA 中有一个碱基错配或缺失时，均不产生荧光，因此认为只有完全互补的 DNA 才能与分子 信标探针杂交，可见分子懵标探针具有高度特异性。 二、基因探针的基础理论 DNA 探针是一个含有特异核苷酸序列的带标记的单链 DNARNA

11、 片段。利用这个片段可以 检测在临床标本中存在的与其互补的序列。DNA 杂交技术因能够检查与探针互补的特异序列而 具有高度的特异性。微生物种属的鉴定，完全取决于事先能够获得一个与被鉴定微生物特异序 列互补的 DNA 或 RNA 片段。通常 DNA 是双链，然而在适当的条件下(离子强度、DH 和温度， 双链能够变性(分离，当条件改变，这两条分离的链又可发生复性，即互补序列重新结合，因 此，可采用标记的特异 DNA 序列(DNA 探针，与临床标本培养物或临床标本中的 DNA 互补序列 (靶序列直接进行杂交(形成双链。在合适的条件下，RNA 也能与互补 DNA 链杂交。 1.基因探针技术原理 基因探

12、针或 DNA 探针技术检测微生物的依据是核酸杂交，其工作原理是 2 条碱基互补的 DNA 链在适当条件下可以按碱基配对原则，形成杂交 DNA 分子。已知每个生物体的各种性质和 特征都是由其所含的遗传基因所决定的，倒如一种微生物的病原性就是由于这种微生物含有并 表达了某个或某些有害的基因而产生的。从理论上讲，任何一个决定生物体特定生物学特性的 DNA 序列都应该是独特的。如果将某一种微生物的特征基因 DNA 双链中的一条进行标记，例如 用 P 同位紊标记，即可制成 DNA 探针。由于 DNA 分子杂交时严格遵守碱基配对的原则，通过 考查待测样品与标记性 DNA 探针能否形成杂交分子，即可判断样品

13、中是否含有此种微生物并 且还可以通过测定放射性强度考查样品中微生物数量。 2. 基因探针的特性 构建一个 DNA 探针的设想是非常重要的，这包括要选择一个适当的靶和探针分子，使能获 得最理想的结果，达到诊断的目的。敏感性高。敏感性是指探针能精确检出 DNA 或 RNA 的最 小量，从临床观点讲，是指探针能精确检出微生物的最小数量。这可通过探针对不同浓度的微 生物的最小数量检测出来确定。DNA 探针具有非常高的敏感性，如检测一个单基因仅需要 104 拷贝，而且单克隆测定至少需要 1d 抗原分子；应用肠毒素 LT(不耐热毒素和 sT(耐热毒 素DNA 探针，检测肠毒素源性大肠杆菌引起的腹泻，其敏感

14、性比 Y 一 1 肾上腺细胞和乳鼠实 验高 1 万倍；特异性强。在临床上，特异性是指探针能够从混合标本中正确鉴定目的微生物 的能力。鉴定结果可直接由临床标本中获得，或可对通过培养或选择性培养已初步鉴定的微生 物做出确诊。DNA 探针的检测技术是建立在探针与待检验核苷酸碱基序列同源性的基础上，其 本身就决定了探针的特异性是很强的； 简便快速。为了对严重疾病的及时诊断和治疗，在 大量临床待检验标本集中的实验室，使用一种简便快速的检验方法非常重要。近年不断发展起 来的 DNA 探针诊断技术，可以很好地解决这个问题，他如同在茅草堆里找一根针样，可以帮助 人们迅速地查明目标，故称之为“神奇”的 DNA

15、探针。 三、展望 虽然目前传统的分离培养方法仍然是检测食品微生物时常用的方法，但存在检测成本高 费时等缺点，对大部分微生物来说，用传统方法检测至少需要45 d时间。有些致病微生物甚 至无法进行人工培养。利用微生物生理生化特性鉴别微生物的传统方法在实际应用时也遇到越 来越多的同题。例如利用葡糖苷酸酶活性鉴别检测大肠杆菌是目前美国和日本等国采用的标准 方法，但已发现几种大肠杆菌菌株因uidA基因突变而产生假阴性检测结果 ，而样品中存在的 其它一些微生物则因含有该酶活性，而使检测结果出现假阳性。可见研究更加快速、准确的微 生物检测方法具有十分重要的意义。DNA探针杂交与PCR联合使用检测食品微生物具

16、有特异性 强、灵敏度高及操作简便快速等特点将是今后食品微生物检测技术的一个重要研究方向。目前 利用DNA探针技术检测食品中的微生物巳取得了不少重要成果。美国的Gene-Trak 公司(Gene Trak IncFraminham，Massachusetts，USA巳开发出检测大肠杆菌的商品化DNA探针系 统。以PCR扩增大肠杆菌的目标DNA，在用DNA探针杂交检测，不需要进行微生物分离培养，最 快可以在1h内完成检测操作，检测灵敏度为100个大肠杆菌细胞每g或每mL食品样品。如与免疫 等其它技术联用，还可以使检测灵敏度大大提高。美国环保署早在1990年就已正式使用DNA探 针杂交技术检测饮用水

17、中大肠杆菌总数。近年来随着DNA生物传感器探针等新技术的研究不断 取得进展，可望在不远的将来开发出一种DNA探针检测仪，用于食品微生物的快速检测，最终 实现对食品产品的现场及在线检测。虽然我国目前利用DNA探针技术检测食品中微生物的研究 报道尚不多见，但是随着现代分子生物学技术的快速发展，特别是基因测序技术的发展，各种 新的DNA探针检测技术的出现，将会使该项技术在食品微生物检测中得到更加广泛的应用，也 将吸收国内更多的研究者加入到这一领域中来。 【参考文献】 1王翔，钱微，杨泽田. 维甲酸对喉癌细胞株 Hep2 的生长及癌基因的抑制作用J. 癌症, 1995,(03 . 2钱止维,李玉英,杨

18、新科,毛淑娟,邵幸曙,周园,史连永,段淑敏,侯云德. 子宫颈糜烂病毒病 因的探讨J. 病毒学报, 1987,(01 . 3胡裕文,宇文镐,杨新科,侯云德,胡钢,段淑敏. 我国痘苗病毒天坛株基因组左端限制酶位点 的变异J. 病毒学报, 1987,(01 . 4吴淑华,侯云德,金奇,张鹏,张丽兰,张智清. 人干扰素 N 端序列的变异与其抗病毒活性的 关系J. 病毒学报, 1988,(02 . 5金奇,陈悦,刘绛光,黎志良,金冬雁,侯云德. 我国痘苗病毒疫苗株(天坛25kb 核苷酸序列 及其与非疫苗株(WR差异的比较J. 病毒学报, 1988,(04 . 6黎志良,金奇,宇文镐,金冬雁,侯云德. 我国痘苗病毒天坛株血凝素基因全序列