甲3(H3N2)亚型流感病毒相变异分子生物学基础的研究

1、    甲3(H3N2)亚型流感病毒相变异分子生物学基础的研究        【摘要】目的弄清甲3(H3N2)亚型流感病毒相变异的分子生物学基础。方法病毒粒RNA经逆转录合成cDNA，经聚合酶链反应(PCR)扩增，产物纯化，采用双脱氧链末端终止法进行核苷酸序列测定。结果35株甲3(H3N2)亚型流感病毒的HA1区基因长度均为984个核苷酸，它们间无发生任何核苷酸丢失或插入并发现HA1蛋白分子上氨基酸序列多变点主要在HA蛋白的顶部，尤其抗原决定簇B区和受体结合部位(RBS)，这

2、进一步证实了，HA蛋白分子上氨基酸替换主要是人群免疫压力所造成。同时还发现了半胱氨酸和脯氨酸具有高保守性及糖基化位点主要集中在HA1区的N和C端，尤其N端。糖基化位点如此分布在病毒基因进化和流行病学上意义至今不清楚。结论H3N2亚型病毒“O”相毒株的出现与其蛋白分子上第226位氨基酸发生替换密切相关并推测“O”相毒株HA蛋白三维结构与“D”相的不同。【主题词】流感病毒核苷酸序列相变 Studies on the basis of molecular biology of the phase change of influenza A(H3N2) virusesGuo Yuanji, Dong

3、Jie, Wang Min, et al. Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing100052AbstractThe analysis of nucleotide sequences on HA1 domain of 35 strains of influenza A(H3N2) virus showed that their HA1 genes all were 984 nucleotides in length coding for a HA1 protein with 328 amino

4、 acides and there was not any occurrence of insertion or deletion of nucleotides on HA1 genes among them. The appearance of “O” phase strain of influenza A(H3N2) virus was closely related with substitution at 226 position of amino acid on HA1 protein molecule and the three-dimensional structural cha

5、nge of HA protein. The results in this paper indicaded that the positions with multiple changes on HA1 protein molecule located at the top of HA protein, especially at antigenic determinant B site or receptor binding site. These further demonstrated that the substitution of amino acid on HA1 protein

6、 molecule was casued mainly by suppress of herd immunity. This study also showed that the position of the cysteine and proline residues on the HA1 protein molecule were conservative and that the glycosylation sites located at N and C terminals, especially at N terminal of the HA1 protein The signifi

7、cance of such a distrib of glycosylation sites in the evolution of viral genes and epidemiology still remain unknown.Key words：Influenza A(H3N2) virusUtion Phase change相变是甲型流感病毒变异的一种形式1，但一般认为甲2(H2N2)和甲3(H3N2)亚型毒株不具有“O”相特性，它们可直接通过鸡胚尿囊腔分离出并能凝集鸡红细胞。1996年初，我们在流感监测中发现了具有“O”相特性的甲3(H3N2)亚型流感病毒株2。由于这属首次发现，故

8、有必要弄清其出现的分子生物学基础。甲型流感病毒基因组含8个节段，至少编码10种蛋白，但它们是依靠其毒粒表面血凝素，(HA)蛋白抗原来识别和结合红细胞表面含唾液酸的糖蛋白或糖脂的受体。导致了红细胞的凝集。Weis等3采用x-射线分析法弄清了HA蛋白结合唾液酸区的结构。Nobusawa等4观察到了HA蛋白受体结合部个别氨基酸替换就能直接影响HA蛋白对红细胞结合的能力。故我们测定了1979年以来H3N2亚型毒株HA1区基因的核苷酸序列并分析和比较其产物的氨基酸序列，以便弄清H3N2病毒“O”相毒株出现的分子生物学基础。1材料和方法1.1甲3(H3N2)亚型毒株的来源见表1。除A/Bangkok/1/

9、79(H3N2)由WHO提供外，其余均来自国家流感中心。1.2病毒增殖“D”相毒株按常规法接种9-11日龄鸡胚尿囊腔进行增殖，收尿囊液，细菌培养阴性，鸡红细胞凝集滴度40者；“O”相毒株，按常规接种MDCK细胞，收其细胞维持液，细菌培养阴性，对豚鼠红细胞凝集滴度40者。1.3“O”、“D”相转变将具有“O”相特性的A/京科/32/96(H3N2)和A/京科/18/96(H3N2)两毒株经鸡胚尿囊腔适应传代，当所收获的尿囊液对胚鼠和鸡红细胞凝集能力相同时，再经鸡胚尿囊腔传两代即为已从“O”相转变成“D”相。1.4病毒浓缩和纯化1992年及之前分离的病毒在提取RNA之前，均按常规在鸡胚增殖后，所收

10、获的新鲜尿囊液，经超速离心进行浓缩，用30%60%的蔗糖梯度离心进行纯化。1.5病毒粒RNA提取1992年及之前所分离毒株提取法见参考文献5。1992年之后所分离毒株RNA提取，采用德国1995年出品的RNeasy RNA Kit，方法按QIAquickTM Handbook所提供的。1.6引物用于cDNA合成和PCR扩增的有：F7(5d-ACTATCATTGCTTTG)和R1073(5'd-CCTGCGATTGCGCCGAAT)；用于序列测定的有：25(5d-TACATTTTCTGTCAG),145(5'd-GGTAGAATATGCGACAGT),282(5'd-CA

11、GCAACTGTTACCC),490(5'd-CTGAACGTGACTATG);721(5'd-GACATACTGTTGATT),814(5'd-GACCCCATTGGCACCTGC),R362(5'd-TAAGGGTAACAGTTGCTG)和F7。35S-ATP，逆转录酶，PCR试剂盒，PCR产物纯化试剂盒以及Sequence system试剂盒均由美国CDC提供。表1本研究所用的甲3(H3N2)亚型流感病毒株Tab.1Influenza A(H3N2) viruses examined in the current study病毒Viruses简称Abbre

12、viation相PhaseA/Bangkok/1/79Bang 79-1DA/Yaan/2/87YA 87-2DA/Shanghai/11/87SH 87-11DA/Beijing/57/89BJ 89-57DA/Shanghai/1/89SH89-1DA/Sichuan/18/89SC 89-18DA/Guangdong/16/89GD 89-16DA/Guangdong/44/89GD 89-44DA/Jinan/15/90JN 90-15DA/Wuhan/7/90WH 90-7DA/Shanghai/24/90SH 90-24DA/Beijing/32/92BJ 92-32DA/Beij

13、ing/46/92BJ 92-46DA/Beijing/47/92BJ 92-47DA/Beijing/361/92BJ 92-361DA/Sichuan/3/92SC 92-3DA/Sichuan/10/92SC 92-10DA/Guangdong/1/92GD 92-1DA/Shandong/9/93SD 93-9DA/Guangdong/25/93GD 93-25DA/Johannesbury/33/94Joh 94-33DA/Guangxi/13/94GX 94-13DA/Guangdong/274/94GD 94-274DA/Beijing262/415/94BJ 94-415DA/

14、Wuhan/359/95WH 95-359DA/Shenzhen/203/95SZ 95-203DA/Shanghai/9/95SH 95-9DA/Shanxi/28/95SX 95-28DA/Fujian/57/96FJ 96-57DA/CNIC/3/96CNIC 96-3OA/CNIC/10/96CNIC 96-10OA/CNIC/32/96CNIC 96-32DA/CNIC/32/96CNIC 96-32OA/CNIC/18/96CNIC 96-18DA/CNIC/18/96CNIC 96-18O     1.7cDNA合成和聚合酶链反应见文献6。

15、1.8PCR产物纯化按德国出品的，QIAguick PCR Purification Kit所提供的方法。1.9核苷酸序列测定采用双脱氧链终止法7，基本步骤参考USB公司DNA sequence试剂盒。 2结果35株测定病毒，其HA1区基因长度均为984个核苷酸，它们彼此间无发生任何核苷酸插入或丢失。现将所测定的核苷酸序列所推导出的相应氨基酸序列列于1。    135株甲3(H3N2)亚型流感病毒HA1区氨基酸序列虚线示氨基酸序列同WH95-359；黑线示糖基化位点Fig. 1Deduced amino acid sequence of the HA1

16、gene of influenza A(H3N2) virusesThe dot line in dicates the amino acid sequence is identical with that of WH95-359 virus. The black line means the glycosylation site1结果表明，所有测定毒株HA1区蛋白分子均含328个氨基酸，它们之间共有52个位点发生了替换，保守位点与变异点之间比例为32852=5.31。发生两次或两次以上替换的位点共有9个：124(抗原决定簇A区)，133(RBS前壁)，156(抗原决定簇B区)，186(紧挨R

17、BS)，189(抗原决定簇B区)，193(紧靠RBS后壁)，197(抗原决定簇B区)，226(RBS左侧壁)，262(靠近抗原决定簇E区)。上述位点除124和262外，其余7个均位于HA蛋白三维结构顶部。清楚表明了HA1区蛋白分子上氨基酸的替换主要是由于人群免疫压力所造成。从1还可看出，所有半胱氨酸(C)位点均未发生替换，表明它们相互间双硫键是相同的，同时所有脯氨酸(P)位点也均相同。此外，糖基化位点，除了BJ96-32和BJ96-32于122位插入一个及BJ96-32和BJ96-18在246位丢失一个糖基化点外，测定的其余毒株均有共同8个糖基化位点，它们位于8，22，38，63，126，16

18、5，246和285。糖基化位点主要分布在HA1蛋白分子的两头，尤其集中在N端。从1结果很有意义地发现了第226位氨基酸，自1995年以来所分离出的毒株均为“”(异亮氨酸)，而1995年以前的毒株不是“L”(亮氨酸)就是“Q”(谷氨酰胺)。然而，在1995年所分离的“O”，“D”相毒株间见不到第226位氨基酸有差异。通过实验室诱导两组病毒间，仅在其246位点上，“O”相毒株为“N”(天冬酰胺)而“D”相毒株为D(天冬氨酸)，造成一个糖基化位点的丢失。除此之外，见不到实验诱导的“O”与“D”相毒株间有其它规律性的差异。3讨论本研究表明，H3N2亚型流感病毒相特性的出现与其蛋白分子上第226位氨基酸

19、替换有密切相关。因它是RBS袋的左侧壁重要成员。一般认为它的改变就能引起病毒粒HA蛋白与受体结合的特异性。同时根据国外过去所报道的资料9，10，无论是人，马还是禽的H3亚型毒株，其HA1蛋白分子上第226位氨基酸不是“L”就是“Q”，从未出现过“I”。但1995年以来，无论“O”相还是“D”相毒株其HA1蛋白分子上第226位均为“I”，故看来，仅第226位氨基酸改变能引起病毒粒对受体特异性的改变，但还不够完全导致H3N2亚型毒株相的改变，故推测在“O”与“D”相毒株间其HA蛋白三维结构方面存在着差异。虽然通过实验诱导的“O”、“D”毒株间在第246位上氨基酸有差异，但在其它“O”、“D”相毒株

20、间见不到有相同的差异，同时第246位是位于HA蛋白抗原决定簇的D区，离RBS甚远，故与病毒粒相变关系不密切。“C”与“P”残基具有保守性，这与国外报道11，12是一致的。一般认为它们在维持HA蛋白三维结构中起着重要的作用13。为何糖基化位点主要集中在HA1蛋白的N和C端，尤其N端，这种分布在病毒基因进化中作用及在流行病学上意义至今不清楚。估计H3N2亚型病毒“O”相毒株于1995年就已出现，由于当时没预计到，许多未分离出，分离到的也已经鸡胚传多代，已变成“D”相毒株。本文受国家自然科学基金资助(39670037)作者单位：100052北京中国预防医学科学院病毒学研究所1997年10月24日收稿

21、1998年1月20日修回参考文献1Andrewes S C, Pereira H G, Wildy P. Viruses of vertebrates. Fourth edition. London: Bailliere Tindall, 1978, 203-211.2郭元吉，赵惠芬，王敏，等. 流感病毒相变的发现及其意义. 中华实验和临床病毒学杂志，1996，10(2)：101-103.3Wei W, Brown J H, Cusack, et al. Structure of the influenza virus haemagglutinin complex with its recep

22、tor. Nature, 1988, 333: 426-431.4Nobusawa E, Nakajima. Amino acid substitution at 226 of the hemagglutinin molecule of influenza A(H1N1) affects receptor binding activity but not fusion activity. Virology, 1988, 167: 8-13.5Guo Y J, Desselberger D. Genome analysis of influenza C viruses isolated in 1

23、981/1982 from pigs in China. J Gen Virol, 1984, 65: 1873-1880.6Saiki R K, Gelfand D H, Stattels, et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science, 1988, 239: 487-492.7Cox N J, Kitame F, Klimov A, et al. Comparative studies of wild type and cold mutant

24、 (temperature-sensitive) influenza viruses: detection of mutation in all genes of the A/Ann Arbor/6/60(H2N2) mutant vaccine donor strain. Microbiol Pathogenesis, 1986, 1: 387-392.8Underwood P A. Receptor binding characteristics of strains of the influenza Hong Kong subtype, using a periodate sensitivity test. Archiv Virol, 1985, 84: 53-55.9Both G W, Sleigh M J. Conservation and variation in the hemagglutinin