生物物质分离工程复习

1、生物物质分离工程复习第一章绪论第一节 生物工业下游技术的工作领域一、下游工程对于由生物界自然产生的或由微生物菌体发酵的、动植物细胞组织培养的、酶反应等各种生物工业生产过程获得的生物原料，经提取分离、加工并精制目的成分，最终使其成为产品的技术，通常称为下游技术（Downstream Processing），也称为下游工程或下游加工过程。二、技术范畴物质分离 产品加工三、生物工业下游技术的发展历程1.古代酿造业2.第一代生物技术:第一代(传统)生物工业主要指19世纪60年代到20世纪40年代青霉素等抗生素出现之前的生物技术产业。这一时期，发现了发酵的本质是微生物的作用，掌握了纯种培养技术。3.第二

2、代生物技术:第二代生物技术以20世纪40年代出现的青霉素产品为代表。4.第三代生物技术:第三代生物技术一般认为以20世纪70年代末崛起的DNA重组技术及细胞融合技术为代表。到了20世纪80年代以来，生物工业下游技术进步很快，出现了许多新概念、新技术、新产品和新装备。第二节 生物工业下游技术的一般工艺过程一、原料及产品特性二、下游技术的一般工艺过程如按生产过程划分，生物工业下游技术大致可分为4个阶段，即预处理、提取（初步分离）、精制（高度纯化）、成品制作，如书中P8图1-1所示。第三节 生物工业下游技术的发展动态一、传统分离技术的提高和完善 二、新技术的研究和开发1.新型分离介质的研究开发2.子

3、代分离技术3.其他新兴下游技术三、清洁生产（Cleaner Production）清洁生产是指将综合预防的环境保护策略持续应用于生产过程和产品中，以期减少对人类和环境的风险。它包括三方面内容，即清洁生产工艺（技术）、清洁产品、清洁能源。清洁生产工艺是生产全过程控制工艺，包括节约原材料和能源，淘汰有毒害的原材料，并在全部排放物和废物离开生产过程以前，尽最大可能减少它们的排放量和毒性，对必须排放的污染物实行综合利用，使废物资源化。*第五节 常用的几种精制方法简介生物产物的精制过程，往往包括浓缩、精制和干燥。常用的浓缩方法有真空单效蒸发浓缩和真空薄膜蒸发浓缩，尤以薄膜浓缩用得较多，形式也多种多样。精

4、制方法更是五花八门，但归纳起来有下列几种：（a）脱色精制除去色素及热原；（b）结晶及重结晶，其中包括共沸结晶及盐析结晶；（c）中间体转化法；（d） 柱层析法及分子筛法；（e）其他。一、分子筛去盐利用分子量大小，可将无机盐杂质从目标产物溶液中除去，从而降低灰分，提高纯度。通常采用高交联度的强酸性阳离子H型树脂处理，当溶液通过它时，其中无机阳离子被吸附，释放出来的氢离子，再通过阴离子树脂，中和氢离子，这样经过两种树脂串联处理，可以达到去盐目的。二、色谱分离法色谱分离法是一总称，它从分离的原理上可以分为：1.吸附色层分离法:靠吸附力不同而分离。2.分配色层分离法（纸层析）：靠各物质在两液相间分配系数

5、不同而分离。3.离子交换色层分离法：靠离子亲和力不同而分离。4.凝胶层离法：靠物质的分子大小或形状不同而分离。5.电泳法（电层离法）：靠电泳速度不同而分离。但从固定相的形状不同，色层分离法可以分为柱层、纸层和薄板（层）等。它的机理是多种多样的，但不管怎样，必须包括两个相，一相是固定的，叫固定相，通常为表面积很大或多孔性固体，另一相是流动的，是液体或气体，当流动相流过固定相时，由于物质在两相间的分配情况不同，经过多次差别分配而达到分离。这里着重介绍具有工业生产价值的几种方法：（一）吸附色层分离法是靠溶质与吸附剂之间的分子吸附力的差异而达到了分离精制目的。常用的吸附剂：Al2O3、硅胶、活性炭（颗

6、粒状），其他还有CaCO3、淀粉、纤维素等。下面重点介绍三种吸附剂：Al2O3有：碱性（适应于对碱性稳定的生物产物的吸附）；中性；酸性（适应对酸性稳定的生物产物的提取）之分。 Al2O3可以重复使用，洗涤后200-400度加热6小时进行活化，其活性与含水量关系很大，活性可分6级。可根据不同水分，不同温度，不同烘烤时间，可得不同活性。硅胶:它具有多孔性的硅氧烷交链结构。活性炭:是憎水性吸附剂，适宜于从水溶液中吸附非极性物质。一般说来，它对极性小的化合物吸附能力大于极性大的化合物，对芳香族的吸附能力大于脂肪族的化合物，对分子量大的化合物吸附能力大于分子量小的化合物。（二）凝胶过滤法球型交链右旋糖酐

7、凝胶，又名葡聚糖凝胶（简称凝胶），是一种分子筛，它由右旋糖酐和交联剂相互交联，形成具有二围空间的网状结构。按网孔的疏密将凝胶分为： G-15 G-25 G-50 G-75 G-100网孔： 密 疏优点：操作方便，不会使物质变性，可反复使用。原理：凝胶过滤法是把含有不同大小分子的混合物溶液倒在凝胶面上，如下图，让它在凝胶柱中流滤，由于凝胶具有网络结构，当混和物通过网络结构凝胶柱子缝隙中，溶液中的溶质凡是比网络小的的分子都能自由进入胶粒内，惟有大分子由于不能进入网络，被阻于胶粒粒外，沿胶粒间的空隙往下移，从而很快流出柱外，这样就把大小分子筛离开了。当加入洗脱液后，溶液继续往下移动，大小分子继续向相

8、反方向扩散、渗入下移，这样先流出的洗脱液中，含有大分子物质，后流出的洗脱液中含有小分子物质，从而达到精制的目的。三、洗涤工艺原理：利用某种溶剂或洗涤剂对杂质的溶解度较大，通过洗涤可提高其纯度。第六节 选择生物分离的方法和原则选择确定生物分离方法，首先必须掌握以下几个基本因素。一、生物产物的化学结构与分类以抗生素为例。据抗生素化学结构，抗生素大体上可以分成八大类：内酰胺类、氨基酸多肽类、大环内酯类、多烯类、四环类、氨基糖苷类、蒽环类、甾体类等。各类抗生素从目前工业化生产角度来归纳，大体上每一类抗生素采用相似方法。例大环内酯类一般采用溶媒萃取法，氨基糖苷类大都采用离子交换法，多烯类采用收集菌体，再

9、用溶媒法萃取等等。因此，当某一新抗生素确定其化学结构后，按其分类大致上按已知抗生素提取方法来提取，是有可能的。二、生物产物的极性及其大小三、溶解度应掌握生物产物在各种溶剂中的溶解度，是水溶性还是酯溶性以及各种溶剂的分配系数。四、化学稳定性五、化学反应性第七节 生物产物酸碱性及极性大小的测定如抗生素酸碱性、溶解度及极性大小测定用下列三种方法大体可以确定。一、纸上层析法（简称纸层析） 纸层析的原理，是以滤纸作为支柱，用一定的溶剂系统展开而达到分离分析的目的。每一种生物产物在一定溶剂中，均有它自己的比移值（即为Rf值），Rf值测量示意如下图:根据某些生物产物在同一系统中Rf值的不同，可以判断它们是不

10、同的生物产物。抗生素极性和溶解度的测定，通常是利用八种溶媒系统法的纸层析数据来进行的。层析结果的判断： Rf值为零或很小，说明抗生素不能溶于或很少溶于所用的溶剂系统； Rf值较大，说明抗生素能够很好地溶于所用的溶剂系统。一般极性强的抗生素易溶于极性高的溶剂中，极性弱的抗生素易溶于极性低的溶剂中。二、PH层析色谱法PH层析是纸层析法的一种，可用来研究某些酸类、碱类或两性生物产物在不同PH下，在有机溶剂中的溶解情况，从而可决定萃取的最适PH。 PH层析的方法如下：用九条层析纸条，分别用PH2，3，4，5，6，7，8，9，10的各种缓冲液处理，点上样品后，选用适当的水饱和的有机溶剂展开，层析完毕后用

11、生物显影，即得到PH层离谱。几种抗生素的“PH-层析”图谱如图1-5。从图中可以看出：（一）酸性生物产物：在“PH-层析”的图谱中的Rf值呈S形逆方向，其最大值在酸性区域，随PH增加其Rf值降低。（二）碱性生物产物：在 “PH-层析”的图谱中的Rf值呈S形曲线，曲线的最大值在碱性区域，而其最小值在酸性区域。（三）两性生物产物：在 “PH-层析”的图谱中的Rf 值从较低的值区域中逐渐增加，到达某一最高值时开始下降，这一类化合物的Rf值从最低点到最高点表现为碱性，从最高点到PH10则表现为酸性。（四）中性生物产物：在 “PH-层析”图谱中，在整个PH范围内，Rf值接近相同，实际上呈直线形。从“PH

12、层析图谱”的结果，可知：1.可判知生物产物的性质;2.确定用溶媒萃取法提取生物产物的最适PH值。具体地说，用溶剂抽提时的最适PH值， 即为“PH层析”谱中Rf值最大的PH值；相反，在“PH层析”谱中Rf值最小的PH值即为反萃取的最适PH值。三、纸电泳法经过系统纸层析法判断为水溶性的生物产物，可用纸电泳法进一步判断其电离性质。原理为：不同的生物产物由于带电性质，电荷数量以及分子量的大小不同，因此在一定时间内在电场作用下，移动的方向和距离是不同的。对于带有正电荷的抗生素电泳时移向负极，称为碱性抗生素；带有负电荷的抗生素电泳时移向正极，称为酸性抗生素；不具有极性基团的抗生素电泳时不移动，称为中性抗生

13、素；两性抗生素在电场作用下移动的方向与溶液的PH值密切相关。由此，利用纸电泳法可判断生物产物是：强酸性、弱酸性、强碱性、弱减性或两性、中性的，以及有可能采用何种离子交换树脂来提取。具体做法是：试样在电压、电流相同的情况下，分别用酸性和碱性缓冲液进行电泳。两次电泳结果及判断见表1-2。 第八节 提炼工作中应注意的几个问题一、遵循四条原则。（一）操作时间尽量缩短，在设备平衡上，争取当班能处理一批发酵液，特别是发酵液过滤。（二）提炼温度一般要低，避免破坏，避免异构体转化，避免长菌。（三）要选择对生物产物稳定的PH值。（四）设备管道要勤清洗消毒，特别是过滤岗位，避免染菌污染。二、注意发酵液质量对提炼的

14、影响。三、加强质量意识，正确处理产质量关系。四、应重视设备选型，提高生产效益。五、三废治理及综合利用思考题*1.生物产物提炼工作中应注意的几个问题? 2.影响生物产物稳定性的主要因素有哪些?*3.测定生物产物酸碱性或极性大小可采用哪几种方法?*4.生物工业下游技术的发展历程。第二章 下游技术的理论基础第一节 下游技术中的物理学过程 一、基础物性二、分类以物理学过程为基础的分离操作，大致可分为以下三类。1.平衡分离过程这种操作是建立在相平衡关系上的。是利用相的组成差别进行混合物体系的分离的。表2-1为平衡分离代表性单元操作。大部分平衡分离操作都包含在内。 明白单元操作属于哪一类。根据纸层析和纸电

15、泳的结果，就可以大致决定采用何种方法提取。2.拟平衡(速度差)分离操作在混合物体系本身所占有的空间之外加一个能引起物质分离的势能场，在它的作用下，形成分离场。其结果为，欲分离的物质在分离场的端面浓缩，或者在分离场内形成一个稳定的浓度分布。如表2-2所示。3.非平衡分离操作平衡和拟平衡分离操作以外的操作，有代表性的是利用物质移动速度差和广义的、基于“隐蔽效应”的分离操作。如表2-3所示。第二节 下游技术中的化学过程一、化学性分子识别1.分子间相互作用（疏水性相互作用） 2.分子识别二、下游技术中的化学反应第三节 下游技术中的生物学过程一、特异性相互作用（锁钥关系）生物学分离过程的主要特征是生物高

16、分子的特异性相互作用。有时也被称作生物亲和力。这种作用，除共价结合外，还有其他一些作用。1.离子间的相互作用 2.氢键结合 3.疏水性相互作用4.对金属原子配位5.弱共价键结合影响上述作用的因素：（1）热（2）温度（3）PH值（4）静电性的环境变化（5）试剂第三章 发酵液的过滤和预处理第一节 发酵液过滤特性的改变一、微生物发酵液的主要特性：1.发酵产物浓度较低，大多为1%-10%；2.悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大；3.固体粒子可压缩性大；4.液相粘度大，大多为非牛顿型流体；5.性质不稳定，随时间变化，如易受空气氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影响。*二、发酵液预处理的要求对发酵液的

17、预处理一般有下列的要求：（1）菌体的分离（2）固体悬浮物的去除（3）蛋白质的去除（4）重金属离子的去除（5）色素、热原质、毒性物质等有机杂质的去除（6）改变发酵液的性质（7）调节适宜PH值和温度三、确定预处理方法的基本条件1.稳定性2.生物产物的溶解度3.工艺上要求四、发酵液预处理方法按原理不同分为1.降低液体粘度：常用的方法：（1）稀释法：此法适用于，若加水一倍，液体的粘度下降50%以上的体系。（2）加热法：升温一是可以降低粘度，另外还可以凝固蛋白。2.调整PHPH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，适当调节PH值可改善其过滤特性。此法是发酵工业中发酵液预处理较常用的方法之一。3.

18、凝聚与絮凝采用凝聚和絮凝技术能有效改变细胞、细胞碎片及溶解大分子物质的分散状态，使其聚结成较大的颗粒，便于提高过滤速率。除此之外，还能有效地除去杂蛋白和固体杂质，提高滤液质量。因此，凝聚和絮凝是目前工业上最常用的预处理方法之一。（1）凝聚是指在电解质作用下，由于胶粒之间双电层电排斥作用降低，电位下降，而使胶体体系不稳定的现象。凝聚作用：就是向胶体悬浮液中加入某种电解质，在电解质中异电离子作用下，胶粒的双电层电位降低，使胶体体系不稳定，胶体粒子间因相互碰撞而产生凝集的现象。电解质的凝聚能力用凝聚值来表示。凝聚值：使胶粒发生凝聚作用的最小电解质浓度（mmol/L）。反离子的价数越高，该值就越小，即

19、凝聚能力越强。采用凝聚方法得到的凝聚体，其颗粒常常是比较细小的，有时还不能有效地进行分离。*（2）絮凝是指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，使胶粒形成较大絮凝团的过程。絮凝剂是一种能溶于水高分子聚合物，其相对分子量可高达数万至一千万以上，它们具有长链状结构，其链节上含有许多活性官能团，包括带电荷的阴离子（如-COOH）或阳离子（如-NH2）基团以及不带电荷的非离子型基团。它们通过静电引力、范德华引力或氢键的作用，强烈地吸附在胶粒的表面。絮凝作用：当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上，产生桥架联接时，就形成了较大的絮团，这就是絮凝作用。对絮凝剂的化学结构一般有下列两方面的

20、要求：.分子必须含有相当多的活性官能团，使之能和胶粒表面相结合；.必须具有长链的线形结构，以便同时与多个胶粒吸附形成较大的絮团，但相对分子量不能超过一定限度，以使其具有良好的溶解性。根据其活性基团在水中解离情况的不同，絮凝剂可分为：非离子型、阴离子型和阳离子型三类。根据其来源的不同，工业上使用的絮凝剂又可分为：.有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、聚苯乙烯类衍生物。.无机高分子聚合物，如聚合铝盐、聚合铁盐等。.天然有机高分子絮凝剂，如聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等（3）混凝对于带负电荷的菌体或蛋白质来说，采用阳离子型高分子絮凝剂同时具有降低胶粒双电层电位和产生吸

21、附桥架的双重机理，所以可以单独使用。对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，则主要通过分子间引力和氢键作用产生吸附桥架，所以它们常与无机电解质凝聚剂搭配使用。首先加入电解质，使悬浮粒子间的双电层电位降低、脱稳，凝聚成微粒，然后再加入絮凝剂絮凝成较大的颗粒。无机电解质的凝聚作用为高分子絮凝剂的架桥创造了良好的条件，从而大大提高了絮凝的效果。这种包括凝聚和絮凝机理的过程，称为混凝。4.加入助滤剂助滤剂的使用方法有两种：一种是在过滤介质表面预涂助滤剂；另一种是直接加入到发酵液中，也可两种方法同时兼用。5.加入反应剂第二节 发酵液的相对纯化一、高价无机离子的除去二、杂蛋白质的除去第三节 发酵液的过滤一、过

22、滤与预处理的基本要求1.过滤速度一般要求过滤效率高，操作时间短，劳动强度低，能连续性操作。为什么要求过滤速度要快？这是由于：大多数生物产物稳定性较差，根据生物产物半衰期的特点，过滤时间越短，生物产物生物活性、效价单位损失越少，滤液的质量和收率越好，加之生物工业生产是条大型的生产流水线，各工序之间应相互衔接，密切配合，保证生产作业计划顺利进行，尽量缩短整个品种的生产周期，周期越短越好。由此可见，在保证过滤质量的前提下，过滤速度越快越好，对提高产质量均有利。过滤速度的表示方法：m3/hm22.滤液质量（1）滤液澄清；（2）PH适中；（3）一定浓度；（4）温度；（5）杂质含量要求。对发酵液的过滤为什

23、么必须做到滤液要清，过滤速度要快？这是因为：若滤液不清就会影响生物产物的产量和质量。因为对非水溶性生物产物来讲，若滤液不清，则意味着含有生物产物的菌丝体漏入了废的滤液中，这会大大影响过滤收率，最后使生物产量减少；对水溶性生物产物来讲，若滤液不清，则意味着废的滤饼（渣）渗漏入含有生物产物的滤液中，这会给后步提取精制带来影响，甚至导致产品质量下降。3.过滤收率4.综合利用5.清洗消毒二、设备（一）板框过滤机优点：结构简单，滤液质量好。缺点：劳动强度大，费滤布，不能连续操作，占地面积大卫生差，生产能力低。若采用板框过滤机时，要考虑几个问题：1.发酵液内固形物总容量应小于板框总容积，应在50-80%。

24、2.批处理完毕总用时间应在菌丝体产生严重自溶之前。3.处理一批料液量，应一次滤完，不能考虑中途拆洗一次，因而在设计上要考虑足够的总台数。板框过滤机有明流及暗流式两种，但目前国外已趋向自动化操作，形式有立式和卧式两种，滤布可以自动行走清洗。（二）真空转鼓过滤机（三）硅藻土过滤机（四）离心分离机生物工业中常见的离心分离设备有：碟片式离心机管式离心机倾析式离心机：对于含固量较多的发酵液，还可采用倾析式(或称螺旋型)离心机(decanter centri fuge)，它依靠离心力和螺旋的推进作用自动排渣。（五）其他固液分离方法二、助滤剂和过滤介质助滤剂：发酵工业生产中为了加快过滤速率，提高滤液质量，有

25、时加入某一种固体物质，凡是能提高过滤速率的物质，就称为助滤剂。（一）助滤剂应具备的条件1.本身是一种极细的坚硬的，不具有压缩性的固体颗粒。2.是一惰性物质，在液体中不起反应，也不会释放有害物质，对抗生素等生物产物也不会释放有害物质，对目标产物无多大吸附作用。3.能悬浮在水中，有一定细度，其大小适合保留欲过滤的固体。4.因为一般用量较大，故应考虑资源与成本。三、发酵对过滤的影响（一）正常发酵对过滤的影响（二）发酵液染菌批号难过滤的几种措施第四节 不过滤提取的发酵液预处理预处理的目的：1.释放单位，提高收率；2.降低发酵液粘度，便于树脂分离；3.调整合适PH，有利吸附；4.减少杂质含量。第五节 介

26、绍几种预处理工艺第四章 微生物细胞破碎第一节 细胞壁的组成与结构一、细菌细胞壁细菌细胞壁占细胞干重的10%-25%，坚韧而略具弹性，包围在细胞的周围，使细胞具有一定的外形和强度。 肽聚糖是细菌细胞壁的主要化学成分，它是一个大分子复合体，由多糖链借短肽交联而成。细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，其网状结构的致密程度和强度取决于多糖链上所存在的肽键数量和其交联的程度。交联的程度越大，网状结构就越致密，破碎的难度也就越大。 G细菌：细胞壁较厚，只有一层（20-80nm），主要由肽聚糖组成（占40%-90%），其余是多糖和胞壁酸。其肽聚糖结构为多层网状结构，其中75%的肽聚糖亚单位相互交联，网

27、格致密坚固。 G细菌：细胞壁包括内壁层和外壁层。内壁层较薄（2-3nm），由肽聚糖组成；外壁层较厚 （8-10nm），主要由脂蛋白和脂多糖组成。 G菌细胞壁的肽聚糖为单层网状结构，它们只有30%的肽聚糖亚单位彼此交联，故其网状结构不及G细菌的坚固，显得比较疏松。二、酵母菌细胞壁酵母菌细胞壁比G细菌要厚，大多为100-300nm，但不及G细菌细胞壁坚韧。幼细胞的细胞壁较薄，有弹性，以后逐渐变厚、变硬。研究表明，有可能仅有一部分厚度对细胞壁的刚性和强度起重要作用。 酵母细胞壁由特殊的酵母纤维素构成，其主要成分是葡聚糖（30-34%）、甘露聚糖（30%）、蛋白质（6%-8%）和脂类（8.5%-13.

28、5%），几丁质含量因种而异。不含纤维素。细胞壁的结构可分为三层：最里层葡聚糖层，它构成了细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状。外层甘露聚糖层中间层蛋白质层葡聚糖层与甘露聚糖层之间靠处于中间的蛋白质交联起来，形成网状结构。近10%的甘露聚糖的侧链通过磷酸二酯键与磷酸连接同细菌细胞壁一样，酵母细胞壁破碎的阻力主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。三、霉菌细胞壁霉菌细胞壁厚度为100-250nm，主要由多糖组成（80%-90%），其次含有较少的蛋白质和脂类。不同的霉菌，细胞壁的组成有很大的不同，其中大多数的多糖壁是由几丁质和葡聚糖构成的。由于霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构，其强度比

29、细菌和酵母菌的细胞壁有所提高。四、细胞壁结构与细胞破碎为了破碎细胞，必须克服的主要阻力是连接细胞壁网状结构的共价键。各种微生物细胞壁的组成和结构差异很大，取决于遗传信息、培养生长环境和菌龄。此外，霉菌的细胞壁结构还随培养过程中机械搅拌作用的强弱而变化。在机械破碎中，细胞的大小和形状以及细胞壁的厚度和聚合物的交联程度是影响破碎难易程度的重要因素。在使用酶法和化学法溶解细胞时，细胞壁的组成显得特别重要，其次是细胞壁的结构。了解细胞壁的组成和结构，就可选择合适的溶菌酶和化学试剂，以及在使用多种酶或化学试剂相结合时确定其使用的顺序。第二节 常用破碎方法细胞破碎的目的是释出胞内产物，其方法很多。按其是否

30、使用外加作用力可分为：一、珠磨法（Bead mill）是一种有效的细胞破碎法。其工作原理是：进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径1mm一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。延长研磨时间、增加珠体装量、提高搅拌转速和操作温度等都可有效地提高细胞破碎率，但高破碎率将使能耗大大增加。珠磨法的破碎率一般控制在80%以下。此外，破碎率的确定，主要是根据产物的总收率来确定，并兼顾下游过程。二、高压匀浆法（High-pressure homogenizatio

31、n） 高压匀浆法是大规模细胞破碎的常用方法，所用设备是高压匀浆器，它是由高压泵和匀浆阀组成。影响其细胞破碎的因素主要有压力、循环操作次数和温度。 破碎性能，随菌体的种类和生长环境的不同而不同。一般说来，酵母菌较细菌难破碎，处于静止状态的细胞较处于快速生长状态的细胞难破碎，在复合培养基上培养的细胞比在简单合成培养基上培养的细胞较难破碎。 此外，不宜采用高压匀浆法破碎的微生物细胞有：易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性菌，以及含有包含体（inclusion body）的基因工程菌，因为包含体质地坚硬，易损伤匀浆阀。高压匀浆法与珠磨法相比： （1）前者操作参数少，易于确定，适合于大规模操作；

32、后者操作参数多，一般凭经验估计，在大规模操作中夹套冷却控温难度较大。珠磨机连续操作时兼具破碎和冷却双重功能，减少了产物失活的可能性。而高压匀浆法需配备换热器进行级间冷却。 （2）珠磨法破碎在适当条件下一次操作即可达到较高的破碎率，而高压匀浆法往往需循环2-4次才行。 （3）珠磨机适合于各种微生物细胞的破碎，而高压匀浆不适合于丝状真菌及含有包含体的基因工程菌。三、超声破碎法（Ultrasonication）也是应用较多的一种破碎法，通常采用的超声破碎机在15-25kHz的频率下操作。一般认为超声波破碎的机理是：在超声波作用下液体发生空化作用（cavitation），空穴的形成、增大的闭合产生极大

33、的冲击波和剪切力，使细胞破碎。超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的声频、声能有关。对不同菌种的发酵液，超声破碎的效果差别较大。一般地，杆菌比球菌较易破碎，革兰氏阴性细菌细胞比革兰氏阳性细菌细胞较易破碎，对酵母菌的效果较差。四、酶溶法（Enzymatic lysis）是一种研究较广的方法，它利用酶反应，分解破坏细胞壁上的特殊键，从而达到破壁的目的。 酶溶法可分为：1.外加酶法在外加酶法中，常用的溶酶有溶菌酶（Lysozyme）、-1,3-葡聚糖酶（Glucanase）、 -1,6-葡聚糖酶、蛋白酶（Protease）、甘露糖酶（Mannanase）、糖苷酶（Glycosidase）、肽

34、键内切酶（Endopeptidase）、壳多糖酶等，而细胞壁溶解酶（Zymolyase）是几种酶的复合物。其中溶菌酶主要用于细菌类，其他酶对酵母作用较显著。溶酶同其他酶一样具有高度专一性，外加酶法主要用于实验室规模。2.自溶法 自溶法(Autolysis)是一种特殊的酶溶方式，其所需的溶胞酶是由微生物本身产生的。自溶法的缺点是对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的变性；此外，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速率下降。五、化学渗透法某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性(渗透性)，从而使胞内物质有选择地渗透出来，这种处理方式称为化学渗透法(Ch

35、emical permeation)。化学渗透法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成，不同化学试剂对各种微生物作用的部位和方式有所不同。1.表面活性物质：可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。2.EDTA鏊合剂：可用于处理革兰氏阴性菌，它对其细胞外层膜有破坏作用。 3.有机溶剂：能分解细胞壁中的脂类。4.变性剂：盐酸胍（Guanidine hydrochloride）和脲（Urea）是常用的变性剂。一般认为变性剂与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。优点：（1）对产物释放具有一定选择性。可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，

36、而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内。控制条件可以有选择地释放出位于细胞内不同部位的产物。 （2）细胞外形保持完整，碎片少，浆液黏度低，易于固液分离和进一步提取。缺点：（1）通用性差，某种试剂只能作用于某些特定类型的细胞。（2）时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%。（3）有些化学试剂有毒性，在其后的产物提取精制过程中，需设法分离除去。六、其他方法1.X-press法：X-press法是将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25 oC形成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由于冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变形而引起的。优点：适应范围广，破碎率高，细胞

37、碎片粉碎程度低，活性保留率高。缺点：目前主要用于实验室，且不适用于对冷冻敏感的生化物质。2.渗透压法（Osmotic pressure）是一种较温和的细胞破碎法。将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），达平衡后，转入到渗透压低的缓冲液或纯水中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞溶胀，甚至破碎。于是，细胞内容物就释放出来。适用性：此法仅适用于细胞壁较脆弱的细胞，或者细胞壁预先用酶处理，或者在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。3.反复冻结-融化法将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面使细胞

38、膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性能；另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞膨胀而破裂。适用性：只适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，常需反复多次。此外，在冻融过程中，可能引起某些蛋白质变性。4.干燥法气流干燥主要适用于酵母菌。真空干燥多用于细菌。冷冻干燥适用于较不稳定的生化物质。第三节 破碎率的测定与破碎技术的研究方向一、破碎率的测定二、破碎技术的研究方向思考题1.常用细胞破碎方法（珠磨法、高压匀浆法、超声破碎法、酶溶法、化学渗透法）的原理、特点及适用性。第五章 溶剂萃取与浸取第一节 溶媒萃取一、溶剂萃取过程的理论基础目前还不能定量地解释溶解的规律，用得较多的仍然是“相

39、似相溶”原理。分子之间可以有两方面的相似：一是分子结构相似，如分子的组成、官能团、形态结构的相似； 二是能量（相互作用力）相似，如相互作用力有极性的和非极性的之分，两种物质如相互作用力相近，则能互相溶解。与水“相似”的物质易溶于水，与油“相似”的物质易溶于油就是相似相溶原理的表现。3.溶剂的极性溶剂萃取的关键是萃取溶剂的选择，而选择的依据是“相似相溶”的原则。前已说明“相似”有两个方面：一是分子结构相似，这相对容易考察；另一个是分子间作用能相似，即分子间相互作用力相似。在生物工业上，对后一点考察较多的是分子极性。介电常数是一个化合物摩尔极化程度的量度，如果已知介电常数，就能预测该化合物是极性的

40、还是非极性的。根据萃取目标物质（产物）的介电常数，寻找极性相接近的溶剂作为萃取溶剂，也是溶剂选择的重要方法之一。二、与溶剂萃取有关的一些名词及定义（一）溶剂萃取的相与相比萃取：在一个萃取体系中，水相料液与有机相接触时，料液中的溶质向有机相转移的过程。*反萃取：是将负荷有机相与反萃剂（含无机酸或碱的水溶液，有时也可以是水）相接触，使某种被萃入有机相的溶质转入水相的过程，可把这种过程看作是萃取的逆过程。（三）分配定律和分配比在萃取和反萃取的过程中，“平衡”都是暂时的、有条件的。当条件变了，原来的平衡就会被打破并建立起新的平衡。能斯特（Nernst）分配定律认为：在一定温度一定压力的条件下，溶质分配

41、在两个互不相溶的溶剂中，达到平衡时溶质在两相中的活度之比为一常数。如果是稀溶液，活度可用浓度代替，则达到平衡时溶质在两相中的浓度之比为一常数。这一常数称之为分配系数K，即有：萃取相浓度 c1K （ 5-1）萃余相浓度 c2常温下K为常数，c的单位通常用mol/L或u/ml。式（5-1）应用条件（1）稀溶液；（2）溶质对溶剂之互溶度没有影响；（3）必须是同一种分子类型，即不发生缔合或离解。当满足这样条件时，分配系数为一常数，它与溶质的总浓度和相比都没有关系，只与溶质分子在有机相中的溶解度有关，简而言之，分配定律只适用于稀溶液的简单物理分配体系。但是在大多数萃取体系中，情况往往比较复杂。分配比（D

42、）：表示萃取体系达到平衡后，被萃取溶质在有机相中总浓度与水相总浓度之比。c1 (c1)1(c1)2(c1)3···(c1)nDc2 (c2)1(c2)2(c2)3···(c2)n分配比不是常数，它随被萃取溶质的浓度、水相的酸度、萃取剂的浓度、稀释剂的性质、温度以及其他物质的存在等因素的变化而变化。（四）萃取因数（萃取比）*萃取因数：萃取平衡后，被萃取溶质进入有机相的总量与该溶质在萃余液中总量之比。通常以 E表示。这个物理量在用计算法确定流比和理论级数时有用。若以V1和V2分别表示有机相和水相的体积，M1和M2分别表示溶质在有机相和水相

43、中的平衡浓度。根据定义，萃取因数：有机相中总溶质量 M1V1E水相中总溶质量 M2V2又因分配比： 相比：M1 V1D RM2 V2所以 ED·R即萃取因数等于分配比与相比的乘积。由上式可知，萃取因数实际上就是在相比等于1时的分配比。E 不是常数，其数值与相比、萃取剂浓度、温度、PH、溶质在水相和有机相中的解离、水相中溶质浓度等因素有关。（五）萃取率()萃取率：表示萃取过程中溶质被萃取到有机相中份数，通常以百分数表示。被萃到有机相中溶质总量 M1V1×100%×100%原始料液中溶质总量 M1V1 M2V2E D×100%×100%E1 D1/

44、R由上式可以看出，萃取率与萃取因数或分配比和相比有关。分配比越高，相比越大，萃取率越高，也就是萃取越完全。当相比等于1时，萃取率的大小完全取决于分配比。（六）分离因数（分离系数）DA KADB KB根据分配比定义，上式可以写为：CA1/CA2 CA1CB2CB1/CB2 CB1CA2式中：CA1、CA2和CB1、CB2分别为溶质A、B 在萃取相和萃余相的平衡浓度。值越大（或越小），说明两种溶质越容易分离。显然，当DADB，1时，两种溶质就分不开了。值得注意的是，当萃取剂浓度、组成、水相成分、相比以及温度等改变时，值就要发生变化。（七）饱和容量及操作容量（八）萃取的协同效应协萃协萃：两种或两种以

45、上萃取剂同时萃取某一溶质或其他化合物时，萃取性能优于它们各自萃取的性能之和的效应。三、溶剂萃取原理四、溶剂萃取法的特点*五、溶剂选择的基本条件 1.有很大的萃取容量，即单位体积的萃取溶剂能萃取大量的产物。也就是分配系数K要大。K必须大于1，否则起不到浓缩作用2.分离因数高：即有良好的选择性，理想情况是只萃取产物而不萃取杂质。3.要有一定的比重差：比重差越大越好分离，一般说至少要0.1。4.溶解度与被萃取的液相（通常是水相）互溶度要小，且粘度低、界面张力小或适中，这样有利于相的分散和两相分离。 5.溶剂的回收和再生容易。6.化学稳定性好，不易分解，对设备腐蚀性小。7.经济性好，价廉易得。8.安全

46、性好，闪点高，对人体无毒性或毒性低。*六、萃取方式及理论收得率的计算工业上萃取操作通常包括三个步骤：（1）混合料液和萃取剂充分混合形成具有很大比表面剂的乳浊液，产物自料液转入萃取剂中。（2）分离将乳浊液分离成萃取相和萃余相。（3）溶剂回收从萃取相有时也需从萃余相（有少量混溶情况下）中分离出有机溶剂，并加以回收。因而工业萃取的流程中须有混合器、分离器和溶剂回收装置。混合萃取和分离也可在同一台设备内完成。萃取操作流程可分为单级萃取和多级萃取。多级萃取中又有多级错流萃取和多级逆流萃取之分。另外还有错流和逆流结合的萃取。1.单级萃取即使用一个混合器和一个分离器的萃取操作。 S _L 混 分 合 离 器

47、 机 F _R 单级萃取 S萃取剂 F料液 L萃取液 R萃余液设料液体积为VF，萃取剂的体积为VS，经萃取后，溶质在萃取液和萃余液中总量（重量或克分子、或效价）的比值是萃取因数E，则：C1·VS VSEKC2·VF VF由此，即可计算出理论收率：萃取液溶质总量1×100%料液溶质总量萃取液溶质总量×100%萃取液溶质总量萃余液溶质总量E×100%E12.多级错流萃取料液经萃取后的萃余液再用新鲜萃取剂进行萃取，称为多级错流萃取或多级顺流萃取。由下图可以看出，第一级萃余液（R1）作为第二级的料液，第二级的萃余液（R2）再作为第三级的料液，各自都用新

48、鲜萃取剂萃取。 多级错流萃取流程的特点：每级均加新鲜溶剂，故溶剂消耗量大，得到的萃取液产物平均浓度较稀，但萃取较完全。其理论收得率为：111×100%(E11)(E21)······(En1)当S1S2S3······SnS，即E1E2E3······EnE时，则：111×100%(E1)n3.多级逆流萃取在第一级中加入料液（F），萃余液顺序加为后一级的料液，而在最后一级加入萃取剂（S），萃取液顺

49、序作为前一级的萃取剂。料液移动的方向和萃取剂移动的方向相反，故称为逆流萃取。多级逆流萃取流程的特点：料液走向和萃取剂走向相反，只在最后一级中加入萃取剂，故和错流萃取相比，萃取剂消耗少，萃取液产物平均浓度高，产物收率最高。其理论收得率为：En1E1×100%En11七、影响溶剂萃取的主要因素（一）乳化和破乳化1.乳化乳化是一种液体（分散相）分散在另一种不相混溶的液体（连续相）中的现象。当有机溶剂（通称为油）和水混合加以搅拌时，可能产生两种形式的乳浊液，一种是油滴分散在水中，称为水包油型（O/W）乳浊液；另一种是水滴分散在油中，称为油包水（W/O）型乳浊液。但油与水是不相溶的，二者混在一

50、起很快会分层，不能形成稳定的乳浊液。只有第三种物质乳化剂存在时，才容易形成乳浊液。乳化剂多为表面活性剂，它一般是由亲油基和亲水基两部分组成，且能降低界面张力的物质。表面张力也可以表示为增加单位表面积所需要的功。所以表面张力降低，液体容易分散成微滴而发生乳化。在乳浊液中，界面积大，物系的自由能大，故为热力学不稳定系统。时间一长，乳浊液会自行破坏。因此，要形成稳定的乳浊液，还应具备使其稳定的条件。其稳定性和下列几个因素有关：界面上是否形成保护膜；液滴是否带电；介质的粘度。其中以为最重要。在发酵液中，蛋白质是引起乳化的最重要的表面活性物质。生产过程出现的乳浊液是水包油（O/W），还是油包水型（W/O

51、），主要由表面活性剂的性质决定。当表面活性剂的亲水基团强度大于亲油基团，易生成水 包油型（O/W）乳浊液；反之，则易生成油包水型（W/O）乳浊液。表面活性剂的亲水与亲油程度的相对强弱，在工业上常用HLB数来表示。它最早由经验得来，现在有一些经验公式用来计算，也可用实验方法测定。HLB数即亲水与亲油平衡程度：HLB数越大，亲水性越强，形成OW型乳浊液；HLB数越小，亲油性越强，形成WO型乳浊液。当HLB数未知时，可根据其溶解度或 分散程度粗略估计，见表5-6。不同HLB数的表面剂的用途见表5-7。根据对发酵液的分析，无机物中的酸、碱和盐不是表面活性物质，而在有机物中蛋白质对表面张力的影响最明显，

52、见图5-11。从图5-11可见随着蛋白质含量的上升，表面张力明显下降即d/dc<0，所以蛋白质是引起发酵液乳化的表面活性物质之一。乳浊液稳定性大小可用乳浊液在离心机中(分离因素一定)分离一定时间后，分出的有机相体积与原来有机溶剂体积之比作为指标来表征。比值愈小，乳浊液愈稳定。抗生素滤液中含有蛋白质颗粒（25- 30m），溶剂萃取时，这些颗粒在两相界面上形成保护膜，产生稳定乳浊液。蛋白质一般是由疏水性肽链和亲水性极性基团构成，由于疏水基和亲水基的平衡，蛋白质显示表面活性，而起乳化剂作用，构成乳浊液。蛋白质是憎水性的（亲油基强度大于亲水基），故形成W/O型乳浊液。2.乳化的防止和破乳化为了保

53、证溶剂萃取操作的正常进行，措施要分两方面：一方面为萃取之前去除蛋白质，使发酵滤液中的蛋白质含量达到最低浓度；另一方面为在萃取过程中如何破坏生物产物发酵滤液中蛋白质经酸化变性后所引起的乳化作用。一般采用的措施如下：(1)乳化的防止严格发酵过程的代谢控制，合理确定发酵周期，准确判断放罐时间。加强发酵液预处理和过滤操作。常用的方法：a.过滤和离心分离b.热处理c.等电点法d.加重金属盐法e.加絮凝剂法(2)破乳化a.电解质中和法b.吸附法c.顶替法d.转型法加入表面活性剂做去乳剂，改变界面的表面张力，促使乳浊液转型，就是使W/O型的乳浊液变为O/W型的过程或者是相反的过程，但又不稳定，从而达到破乳的

54、目的。3.常用的去乳化剂及应用除预先除去引起乳化的蛋白质外，如何破坏这种乳浊液，可有以下几种途径：引入一种亲水性表面活性剂，且其乳化能力要强于进入有机相的中性蛋白质；加入一种能够与蛋白质发生相互作用，从而改变蛋白质等电点的物质；加入一种水溶性阳离子表面活性剂，使其既能中和蛋白质上的负电荷，又能形成向O/w型乳浊液转化的能力。常用的破乳剂有：（1）阳离子表面活性剂a.十二烷基三甲基溴化铵（1231） 化学结构式：CH3-(CH2)10-CH2·(CH3)3NBr，易溶于水，浅黄色粘稠状液体，含量50%左右，在酸性下不溶于有机溶剂。因此适于破坏w/o型乳浊液。其作为破乳剂时和蛋白质有两种

55、作用方式：由于1231为阳离子表面活性剂，其离子带正电荷，溶液中蛋白质带负电荷，它的加入会中和蛋白质所带的负电荷，形成沉淀；和蛋白质形成1231-蛋白质复合物，并中和掉蛋白质分子上的部分负电荷，即提高了蛋白质分子的等电点。在1231浓度低时，由于溶液中的1231不足以中和掉蛋白质上所有负电荷并将其沉淀，而且因其提高了蛋白质的等电点，使得蛋白质更容易成为中性进入有机相，此时，乳化反而加剧。当1231加量0.075% w/v滤液体积，即使在离心分离后，整个有机相仍是全乳化状态，其乳化程度反而比不加1231者更为严重；当1231的加量提高至w/v0.25%w/v滤液体积时，这时不用离心，两相就可获得很好的分离，界面无中间层，水底有沉淀物，说明