微生物菌种鉴定与保藏PPT学习教案

1、会计学1微生物菌种鉴定与保藏微生物菌种鉴定与保藏2内容菌种筛选菌种鉴定1.菌种保藏第1页/共64页3微生物代谢产物的平板检测方法有机酸有机酸: 柠檬酸:pH指示剂的颜色变化,或掺入琼脂平板的碳酸钙的溶解.胞外酶胞外酶:1.淀粉酶:由碘指示的可溶性淀粉的液化2.蛋白酶:酪蛋白的溶解3.脂酶:乳化的三丁酸甘油酯的消化,清除或向橄榄油琼脂中添加0.05-0.25%的OsO4溶液4.果胶酶:果胶凝胶的液化(1.5%的聚果胶酸钠),多糖沉淀剂5.弹性蛋白酶:弹性蛋白的溶解6.核酸酶(DNA,RNA):未水解的核酸的沉淀,酸过量时可见混浊.或者氮蒽橙荧光和紫外荧光7.磷酸脂酶C:卵磷脂平板的混浊圈8.磷酸

2、脂酶A:卵磷脂平板的透明圈9.纤维素酶:纤维素平板的透明圈10.酯酶:氯化钙和Tween20释放出的月桂酸反应生成月桂酸钙沉淀.或者7-羟-4甲基香豆素荧光反应. DNA酶:亚甲胺蓝的DNA荧光变化 过氧化酶:喷洒对-茴香碱-过氧化氢酶抑制剂酶抑制剂:(用含酶的琼脂平板上的抑制圈筛选)1.胰蛋白酶抑制剂:2.蛋白酶抑制剂 其他的代谢物其他的代谢物:1.脂类. 酵母的脂类营养缺陷型的生长谱来捡出2 . N A D : 以 猪 流 感 嗜 血 菌 （haemophilus inflluenzae ）的生长谱来捡出3.雌激素:喷洒对硝基苯重氮盐 （1%在50%乙酸中）形成红色捡出4.chlorost

3、atin: Euglena gracilis 褪绿圈 第2页/共64页4第3页/共64页5第4页/共64页6第5页/共64页7影印法第6页/共64页8显微镜 第一代 第二代 第三代第7页/共64页9细菌的形态和结构观察在显微镜下观察细菌个体的形态细菌形态受培养时间、培养基成分、浓度、培养温度、培养时间等发生变化。第8页/共64页10第9页/共64页11第10页/共64页12链霉菌第11页/共64页13第12页/共64页14第13页/共64页15第14页/共64页16第15页/共64页17 来源于不同微生物的抗生素放线菌产生放线菌产生 链霉素、红霉素、四环素、利福霉素链霉素、红霉素、四环素、利福

4、霉素 庆大霉素、麦迪霉素、林可霉素等庆大霉素、麦迪霉素、林可霉素等真菌产生真菌产生 青霉素、头孢菌素青霉素、头孢菌素C C等等细菌产生细菌产生 多粘菌素、杆菌肽等多粘菌素、杆菌肽等 目前已筛选出抗生素达目前已筛选出抗生素达90009000种以上，每年还种以上，每年还新增百余种。投入生产的仅百余种。新增百余种。投入生产的仅百余种。菌种菌种发酵工业的核心发酵工业的核心第16页/共64页18Current Methods of Identification第17页/共64页19第18页/共64页20 BIOLOG以检测微生物细胞利用不同碳源进行新陈代谢过程中产生的酶与四唑类物质（如TTC、TV）发生

5、颜色反应和浊度差异为基础，运用独有的显型排列技术检测出每种微生物的特征指纹图谱，在大量试验和数学模型基础上，建立起指纹图谱与微生物种类相对应的数据库。检测时通过智能软件将待鉴定微生物的图谱与数据库参比，即可得出鉴定结果。第19页/共64页21分离纯化分离纯化平板扩大培养平板扩大培养制备菌悬液制备菌悬液调整浊度调整浊度接种培养接种培养获取结果获取结果第20页/共64页22The Bacterial Identification ProcessStep 1Step 2Step 3Step 4Step 5Isolate a pure culture on Biolog mediaDo a Gram

6、stain and determine testingprotocolPrepare inoculum at specified cell densityInoculate and incubate MicroPlateRead MicroPlate and determine ID第21页/共64页23The Fungi Identification ProcessStep 1 Step 2 Step 3 Step 4 Step 5 Isolate a pure culture on Biolog media Harvest spores from the Fungi Prepare ino

7、culum at specified cell density Inoculate and incubate MicroPlate Read MicroPlate every 24 hours and determine Identification 第22页/共64页24Pure Cultures are ImportantKrieg, Bergeys Manual, 1986第23页/共64页25第24页/共64页26Microlog1Microlog2Microlog3(Microstation)培养基培养基BUG，BUABUG，BUABUG，BUA，BUY鉴定板鉴定板GN2,GP2,A

8、NGN2,GP2,ANGN2,GP2,AN,YT,FF接种液接种液GN/GP-IFAN-IFGN/GP-IFAN-IFGN/GP-IFAN-IF,FF-IF其它通用消耗品其它通用消耗品疏基乙酸钠，水杨酸钠，试管架，吸嘴，加样槽，一次性疏基乙酸钠，水杨酸钠，试管架，吸嘴，加样槽，一次性移液管，长棉签，木制接种棒。移液管，长棉签，木制接种棒。第25页/共64页27微生物鉴定（95种碳源）微生物研究GN2鉴定革兰氏阴性好氧菌GP2鉴定革兰氏阳性好氧菌AN 鉴定厌氧菌YT 鉴定酵母菌FF 鉴定丝状真菌SFN2用于革兰氏阴性放线菌和真菌代谢研究SFP2用于革兰氏阳性放线菌和真菌代谢研究ECO用于微生物特

9、性和群落分析研究（31）MT2用于微生物代谢研究（不含碳源）ES 用于埃希氏大肠杆菌沙门氏菌的研究 （95种碳源）第26页/共64页28第27页/共64页29第28页/共64页30Electron micrograph of strain ZJB-05174 cells 第29页/共64页31分子遗传学鉴定分子遗传学鉴定 第30页/共64页32Genomic DNA extraction 第31页/共64页33Primers design 16S/18S rDNA sequence amplification第32页/共64页34Denaturing Gradient Gel Electrop

10、horesis (DGGE)第33页/共64页35第34页/共64页36第35页/共64页37第36页/共64页38第37页/共64页39第38页/共64页40第39页/共64页41 1001009093505924440.01 Bacillus aquimaris AY505499 Bacillus methanolicus AB112729 Bacillus firmus EF032672 Bacillus oleronius AY988598 Bacillus subtilis ZJB-063 DQ474759 Bacillus subtilis AB232386 Bacillus at

11、rophaeus isolate SCH0408 AY881241 Bacillus carboniphilus AB021182 Bacillus pseudomycoides AF013121 Bacillus indicus AJ583158 Sporolactobacillus inulinus SPO16SRR23 第40页/共64页42 10a 1001001001007610010096100100687210056100721000.05 Cryptococcus adeliensis strain LEVX01 (DQ269445) Cryptococcus adeliens

12、is strain RKI 456/93 (AY733078) Cryptococcus albidus var. ovalis strain CBS5810 (AF145329) Cryptococcus antarcticus strain CBS7687 (AF145326) Cryptococcus magnus (AY188384) Cryptococcus vishniacii (AB032689) Rhodotorula mucilaginosa (DQ402533) Rhodosporidium kratochvilovae (DQ402534) Rhodotorula glu

13、tinis (AM160642) Itersonilia perplexans isolate AFTOL-ID 1896 (DQ667163) Xanthophyllomyces dendrorhous strain ATCC 24261 (DQ661025) Xanthophyllomyces dendrorhous strain KBP 2604 (DQ661026) Xanthophyllomyces dendrorhous strain ATCC 24229 (DQ661023) Phaffia rhodozyma strain ZJB 00010 (DQ999084) Phaffi

14、a rhodozyma strain CBS 5905 (AF139629) Tricholoma aurantium isolate OUC99349 (DQ367919) Tricholoma saponaceum var. saponaceum isolate OUC99343 (DQ370440) Cyphellostereum laeve isolate AFTOL-ID 982 (DQ486699) Phellinus linteus strain SFC 20001106-7 (AF534070) Phellinus baumii strain SFC 960405-4 (AF5

15、34068) 第41页/共64页43第42页/共64页44第43页/共64页45第44页/共64页46第45页/共64页47第46页/共64页48第47页/共64页49第48页/共64页50第49页/共64页51第50页/共64页52第51页/共64页53第52页/共64页54定义定义 菌种保藏菌种保藏是指在广泛收集实验室和生产菌种、菌是指在广泛收集实验室和生产菌种、菌株的基础上，将它们妥善保藏，使之达到不死、不衰株的基础上，将它们妥善保藏，使之达到不死、不衰、不污染以便于研究、交换和使用的目的。、不污染以便于研究、交换和使用的目的。 第二节第二节 工业微生物菌种的保藏工业微生物菌种的保藏第5

16、3页/共64页55 菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点生理生化特点，人工创造条件，使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低生长代谢活动尽量降低，以减少其变异减少其变异。一般可通过保持培养基营养成分在最培养基营养成分在最低水平，缺氧状态，干燥和低温，使菌种处于低水平，缺氧状态，干燥和低温，使菌种处于“休眠休眠”状态，抑制其繁殖能力状态，抑制其繁殖能力。 一种好的保藏方法，首先应能长期保持菌种原有的优良性状不变。 菌种保藏的原理菌种保藏的原理第54页/共64页56 菌种保藏的方法很多，一般有下面几种：菌种保藏的方法很多，一般有下面几种：A 斜面冰箱保藏法斜面冰箱保藏法 斜面保藏是一种短期、过渡的保藏方

17、法斜面保藏是一种短期、过渡的保藏方法，用新鲜斜面接种后，置最适条件下培养到菌体或孢子生长丰满后，放在4冰箱保存。一般保存期为三个月到六个月冰箱保存。一般保存期为三个月到六个月。第55页/共64页57第56页/共64页58C、石蜡油封存法、石蜡油封存法 向培养成熟的菌种斜面上，倒入一层灭过菌的石蜡油，用量要高出斜面一厘米高出斜面一厘米，然后保存在冰箱中。此法可通用于不能利用石蜡油作碳源的细菌、霉菌、通用于不能利用石蜡油作碳源的细菌、霉菌、酵母等微生物的保存酵母等微生物的保存。 保存期约一年左右。保存期约一年左右。第57页/共64页59D、真空冷冻干燥保减法、真空冷冻干燥保减法 真空冷冻干燥保藏法

18、真空冷冻干燥保藏法是目前常用的较理想的一种方法。其基本原理基本原理是在较低的温度下（15），快速将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华水分升华。在这样的环境中，微生物的生长和代谢都暂时停止，不易发生变异。 因此，菌种可以保存很长时间，一般一般5年左右年左右。这种保藏方法虽然需要一定的设备，要求亦比较严格，但由于该方法保藏效果好，对各种微生物都适用。所以，国内外都已较普遍地应用。第58页/共64页60 这种方法的基本操作基本操作过程是先将微生物制成悬浮制成悬浮液液，再与保护剂混合与保护剂混合，然后放在特制的安瓶管内，用低温酒精或干冰，使其迅速冻结，在低温下用真空泵低温下用真空泵抽干抽干，最后将安瓿管真空熔封，并低温保藏。 保护剂一般采用脱脂牛奶或血清保护剂一般采用脱脂牛奶或血清。保护剂的作用可能是在冷冻干燥的脱水过程中代替结合水而稳定细脱水过程中代替结合水而稳定细胞成分（细胞膜）的构型胞成分（细胞膜）的构型，防此细胞膜因为冻结而破防此细胞膜因为冻结而破坏坏。保护剂还可以起支持作用支持作用，使微生物疏松地固定在上面。牛奶可以离心或加热的方法脱脂牛奶可以离心或加热的方法脱脂。第59页/共64页61E 液氮超低温保藏法液氮超低温保藏法 国外较普遍采用，是适用范围最广的微生物保藏法是适用范围最广的微生物保藏法。尤其是一些不产孢子的菌丝体不