基因工程制药的下游技术

1、 基因工程药物的分离纯化技术基因工程药物的分离纯化技术 基因工程药物的特点基因工程药物的特点l目的产物在初始物料中含量低目的产物在初始物料中含量低l含目的产物的初始物料组成复杂含目的产物的初始物料组成复杂l目的产物的稳定性差目的产物的稳定性差l种类繁多（多糖、多肽、蛋白质、抗体、疫苗等）种类繁多（多糖、多肽、蛋白质、抗体、疫苗等）l应用面广，对其质量、纯度要求高，甚至要求无应用面广，对其质量、纯度要求高，甚至要求无菌、无热源等菌、无热源等下游技术下游技术l指从发酵液中分离和纯化产品的技术过程，包指从发酵液中分离和纯化产品的技术过程，包括括固液分离技术固液分离技术（离心、过滤、沉淀等）、（离心、

2、过滤、沉淀等）、细细胞破壁技术胞破壁技术（超声、高压剪切、渗透压、表面（超声、高压剪切、渗透压、表面活性剂和溶壁酶等）、活性剂和溶壁酶等）、蛋白质纯化技术蛋白质纯化技术（沉淀（沉淀法、色谱分离法和超滤法等），最后还有法、色谱分离法和超滤法等），最后还有产品产品的包装处理技术的包装处理技术（真空干燥、冰冻干燥等），（真空干燥、冰冻干燥等），是运用生物化学、物理学方法分离、纯化产品，是运用生物化学、物理学方法分离、纯化产品，最终将产品推向市场并获得社会或经济效益的最终将产品推向市场并获得社会或经济效益的过程。过程。l基因工程产业化除上游构建工程菌之外基因工程产业化除上游构建工程菌之外,下游下游必须

3、建立生产规模的发酵工艺、离心、细胞破必须建立生产规模的发酵工艺、离心、细胞破碎、目的产物的分离、纯化、恢复表达产物的碎、目的产物的分离、纯化、恢复表达产物的天然结构使之具有生物活性、表达产物的修饰天然结构使之具有生物活性、表达产物的修饰加工等。加工等。l就基因工程产业化而言就基因工程产业化而言,下游技术的研究与建下游技术的研究与建立是十分重要的立是十分重要的,又是十分耗时的又是十分耗时的,需要远比上需要远比上游研究多得多的投资。游研究多得多的投资。（一）、建立工艺需了解各种因素（一）、建立工艺需了解各种因素l含目的产物的初始物料的特点含目的产物的初始物料的特点l物料中杂质种类和性质物料中杂质种

4、类和性质l目的产物特性目的产物特性l产品质量要求产品质量要求l与传统方式相似与传统方式相似,重组蛋白的分离纯化也是利用其物重组蛋白的分离纯化也是利用其物理和化学性质的差异理和化学性质的差异,在进行任何一种蛋白质纯化工在进行任何一种蛋白质纯化工艺设计之前艺设计之前,都需要尽可能多地先对提纯的体系都需要尽可能多地先对提纯的体系,目目标蛋白和杂质的性质进行了解。标蛋白和杂质的性质进行了解。如目标蛋白质的相如目标蛋白质的相对分子质量、等电点、疏水性、带电性、碳氢链或对分子质量、等电点、疏水性、带电性、碳氢链或自由巯基存在情况等。另外还需对影响目标蛋白活自由巯基存在情况等。另外还需对影响目标蛋白活性的因

5、素有了解性的因素有了解,如温度、如温度、H、有机溶剂、蛋白变、有机溶剂、蛋白变性剂、重金属离子、机械剪切力等性剂、重金属离子、机械剪切力等,以保证纯化后的以保证纯化后的蛋白活性。蛋白活性。l当前蛋白质的纯化主要是依靠色谱（层析技术）和当前蛋白质的纯化主要是依靠色谱（层析技术）和电泳技术。电泳技术。由于重组蛋白在组织和细胞中仍以复杂由于重组蛋白在组织和细胞中仍以复杂混合物的形式存在混合物的形式存在,因此到目前为止还没有一个单独因此到目前为止还没有一个单独或一整套现成的方法把任何一种蛋白质从复杂的混或一整套现成的方法把任何一种蛋白质从复杂的混合物中分离出来合物中分离出来,而只能依据目标蛋白的物理化

6、学性而只能依据目标蛋白的物理化学性质摸索和选择一套综合上述方法的适当分离程序质摸索和选择一套综合上述方法的适当分离程序,以以获得较高纯度的制品。获得较高纯度的制品。（二）、分离纯化的基本过程（二）、分离纯化的基本过程l细胞破碎细胞破碎l固液分离固液分离l浓缩与初步纯化浓缩与初步纯化l高度纯化直至得到纯品高度纯化直至得到纯品l成品加工成品加工（三）、细胞的破碎方法（三）、细胞的破碎方法l物理破碎法物理破碎法：高压匀浆法、高速珠磨法、超声高压匀浆法、高速珠磨法、超声破碎法、高压挤压法破碎法、高压挤压法l化学破碎法：化学破碎法：渗透冲击、增溶法、脂溶法渗透冲击、增溶法、脂溶法l生物破碎法：生物破碎法

7、：酶溶法酶溶法（四）、固液分离（四）、固液分离l沉淀：沉淀：盐沉淀、有机溶剂沉淀、等电点沉淀、热盐沉淀、有机溶剂沉淀、等电点沉淀、热变性沉淀变性沉淀l离心：离心：高速离心和超速离心高速离心和超速离心l膜过滤：膜过滤：微滤、超滤和反渗透微滤、超滤和反渗透l双水相萃取双水相萃取 （五）、重组蛋白质的分离纯化（五）、重组蛋白质的分离纯化l分离纯化主要依赖分离纯化主要依赖色谱层析分离色谱层析分离方法。分为离子交换方法。分为离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色谱、凝胶过滤色色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色谱、凝胶过滤色谱及高压液相色谱等谱及高压液相色谱等l色谱技术是医药生物技术下游过程精制阶段的常用

8、手色谱技术是医药生物技术下游过程精制阶段的常用手段，其优点是该法具有多种多样的分离机制、设备简段，其优点是该法具有多种多样的分离机制、设备简单、便于自动化控制和分离过程中无发热等有害效应单、便于自动化控制和分离过程中无发热等有害效应2011-10-3011基因工程下游技术离子交换层析离子交换层析l离子交换层析离子交换层析(ion exchange chromatography，IEC）是是以蛋白质分子净电荷和表面电荷分布以蛋白质分子净电荷和表面电荷分布为分离基础的。具体就是利用蛋白质带电性的为分离基础的。具体就是利用蛋白质带电性的差异差异,在离子吸附剂上静电吸附能力不同在离子吸附剂上静电吸附能

9、力不同,用不用不同的同的pH/离子强度洗脱液洗脱离子强度洗脱液洗脱,从而使蛋白质分从而使蛋白质分离的柱层析方法。离的柱层析方法。l离子交换色谱分辨率高、容量大、操作容易，离子交换色谱分辨率高、容量大、操作容易，为多肽、蛋白质、核酸和许多发酵产物分离纯为多肽、蛋白质、核酸和许多发酵产物分离纯化的一种重要方法化的一种重要方法l离子交换离子交换又分为：又分为：阳离子交换剂和阴离子阳离子交换剂和阴离子疏水层析疏水层析l疏水层析疏水层析(hydrophobic interaction chromatography，HIC）是利用蛋白质表面的疏水区域与固定相上疏是利用蛋白质表面的疏水区域与固定相上疏水性基

10、团相互作用力的差异，对蛋白质组分进行分水性基团相互作用力的差异，对蛋白质组分进行分离的层析方法离的层析方法l广泛应用于蛋白质类大分子的分离以及蛋白质结构广泛应用于蛋白质类大分子的分离以及蛋白质结构和折叠机制的研究等和折叠机制的研究等l在高盐浓度时，蛋白质与固定相疏水缔合；盐在高盐浓度时，蛋白质与固定相疏水缔合；盐浓度降低时蛋白质疏水作用减弱，目的蛋白质浓度降低时蛋白质疏水作用减弱，目的蛋白质被逐步洗脱下来被逐步洗脱下来l疏水色谱回收率较高，蛋白质与固定相的疏水疏水色谱回收率较高，蛋白质与固定相的疏水作用力较弱，蛋白质变性的可能性小，蛋白质作用力较弱，蛋白质变性的可能性小，蛋白质活性在层析分离过

11、程中不易丧失活性在层析分离过程中不易丧失亲和层析亲和层析l亲和层析亲和层析(affinity chromatography，AC）是利是利用固定化配体与目的蛋白质之间非常特异的生用固定化配体与目的蛋白质之间非常特异的生物亲和力进行吸附，这种结合既是特异的，又物亲和力进行吸附，这种结合既是特异的，又是可逆的，改变条件可以使这种结合解除是可逆的，改变条件可以使这种结合解除l亲和色谱亲和色谱是分离纯化蛋白质、酶等生物大分子是分离纯化蛋白质、酶等生物大分子最为特异而有效的层析技术，分离过程简单、最为特异而有效的层析技术，分离过程简单、快速，具有很高的分辨率，在生物分离中有广快速，具有很高的分辨率，在生

12、物分离中有广泛的应用。同时也可用于某些生物大分子结构泛的应用。同时也可用于某些生物大分子结构和功能的研究和功能的研究凝胶过滤层析凝胶过滤层析l凝胶过滤层析凝胶过滤层析(gel filtration chromatography）又称为凝胶排阻层析、分子筛层析，是以多孔又称为凝胶排阻层析、分子筛层析，是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小对溶液中各性凝胶填料为固定相，按分子大小对溶液中各组分进行分离的液相层析方法。填料有一定大组分进行分离的液相层析方法。填料有一定大小范围的孔径，大分子进不去先洗脱，小分子小范围的孔径，大分子进不去先洗脱，小分子进入孔径而后被阻滞，不同的蛋白质根据它们进入孔径而后

13、被阻滞，不同的蛋白质根据它们大小和形状的不同在层析柱中被分离大小和形状的不同在层析柱中被分离l优点：设备简单、操作方便、样品回收率高、优点：设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好、不改变样品生物学活性等实验重复性好、不改变样品生物学活性等l缺点：分辨率较低，尤其是相对分子质量相近缺点：分辨率较低，尤其是相对分子质量相近的分子之间的分子之间l广泛用于蛋白质广泛用于蛋白质(酶）、核酸、多糖等生物大酶）、核酸、多糖等生物大分子的分离纯化分子的分离纯化l用于蛋白质相对分子质量的测定、脱盐、样品用于蛋白质相对分子质量的测定、脱盐、样品浓缩等浓缩等（六）、非蛋白质类杂质的去除（六）、非蛋白质类杂质

14、的去除lDNA的去除的去除：离子交换离子交换层析、层析、亲和层析亲和层析、疏水疏水层析层析l热原质的去除热原质的去除：最好的方法是防止产生热原质最好的方法是防止产生热原质，阴离子交换层析法阴离子交换层析法，疏水层析法疏水层析法，亲和层析法亲和层析法（多黏菌素（多黏菌素B B）l病毒的去除：色谱分离、紫外线照射和过滤病毒的去除：色谱分离、紫外线照射和过滤l根据产物表达形式来选择根据产物表达形式来选择l根据分离单元之间的衔接选择根据分离单元之间的衔接选择l根据分离纯化工艺的要求来选择根据分离纯化工艺的要求来选择（七（七 ）、选择分离纯化方法的依据）、选择分离纯化方法的依据7.1 根据产物表达形式来

15、选择根据产物表达形式来选择l分泌型表达产物分泌型表达产物：浓缩处理浓缩处理（沉淀和超滤）沉淀和超滤）l可溶性表达产物：可溶性表达产物：亲和层析，离子交换亲和层析，离子交换l周质表达产物：周质表达产物：低浓度溶菌酶处理后，采用渗低浓度溶菌酶处理后，采用渗透压休克的方法透压休克的方法l包涵体：包涵体：对蛋白质分离纯化有两方面的影响，对蛋白质分离纯化有两方面的影响，一是它可以很容易地与胞内可溶性蛋白杂质分一是它可以很容易地与胞内可溶性蛋白杂质分离，蛋白纯化较容易完成；另一方面产物经过离，蛋白纯化较容易完成；另一方面产物经过了一个变性复性过程，较易形成产物的错误折了一个变性复性过程，较易形成产物的错误

16、折叠和聚合体叠和聚合体 l选择不同机制的分离单元组成一套分离纯化工选择不同机制的分离单元组成一套分离纯化工艺，尽早采用高效分离手段，将含量最多的杂艺，尽早采用高效分离手段，将含量最多的杂质先分离去除，将最昂贵、最费时的分离单元质先分离去除，将最昂贵、最费时的分离单元放在最后阶段放在最后阶段7.2 根据分离单元之间的衔接选择根据分离单元之间的衔接选择l先运用非特异、低分辨的操作单元，如沉淀、先运用非特异、低分辨的操作单元，如沉淀、超滤和吸附等，尽快缩小样品体积，提高产物超滤和吸附等，尽快缩小样品体积，提高产物浓度，去除最主要的杂质浓度，去除最主要的杂质l随后采用高分辨率的操作单元，如离子交换色随

17、后采用高分辨率的操作单元，如离子交换色谱和亲和色谱谱和亲和色谱l最后选用分离规模小、分离速度慢的操作单元最后选用分离规模小、分离速度慢的操作单元如凝胶排阻色谱，可以提高分离效果如凝胶排阻色谱，可以提高分离效果色谱分离次序的选择色谱分离次序的选择l经盐析得到的液体不适宜于离子交换层析，可经盐析得到的液体不适宜于离子交换层析，可直接应用疏水层析直接应用疏水层析l离子交换色谱之后进行疏水层析比较合适离子交换色谱之后进行疏水层析比较合适l亲和层析多放在第二步以后亲和层析多放在第二步以后l凝胶过滤色谱放在最后一步凝胶过滤色谱放在最后一步l要具有良好的稳定性和重复性要具有良好的稳定性和重复性l要尽可能减少

18、组成工艺的步骤要尽可能减少组成工艺的步骤l组成工艺的各技术或步骤之间要能相互适应和组成工艺的各技术或步骤之间要能相互适应和协调，工艺与设备也能相互适应，从而减少步协调，工艺与设备也能相互适应，从而减少步骤之间对物料的处理和条件调整骤之间对物料的处理和条件调整7.3 根据根据分离纯化工艺的要求来选择分离纯化工艺的要求来选择 l在工艺过程中要尽可能少用试剂，以免增加分在工艺过程中要尽可能少用试剂，以免增加分离纯化步骤，或干扰产品质量离纯化步骤，或干扰产品质量l工艺时间要尽可能短（生物活性收率会降低）工艺时间要尽可能短（生物活性收率会降低）l工艺和技术必须高效，收率高，易操作，对设工艺和技术必须高效，收率高，易操作，对设备要求低，能耗低备要求低，能耗低l具有较高的安全性具有较高的安全性（八）、产品的保存（八）、产品的保存l目的产物失活受多种理化因素的影响，保存