第1章核酸的物理化学性质ppt课件

1、一、核酸的水解 核酸可被水解的位点有磷酸酯键和糖苷键，核酸可被水解的位点有磷酸酯键和糖苷键，其中糖苷键更易被水解。其中糖苷键更易被水解。 55端端3端端CGA核酸的酸水解 嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键对酸更不稳嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键对酸更不稳定，对酸最不稳定的是嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷定，对酸最不稳定的是嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷键。键。DNADNA在在pH1.6pH1.6于于3737对水透析可完全除去嘌呤碱；对水透析可完全除去嘌呤碱；在在pH2.8pH2.8于于100100加热加热1h1h，也可完全除去嘌呤碱。，也可完全除去嘌呤碱。 核酸的碱水解 RNA RNA的磷酸酯键易被碱水解，

2、产生核苷酸。的磷酸酯键易被碱水解，产生核苷酸。 DNADNA的磷酸酯键那么不易被碱水解。这是由于的磷酸酯键那么不易被碱水解。这是由于RNARNA的核糖上有的核糖上有2 2OHOH，在碱作用下构成磷酸三酯。，在碱作用下构成磷酸三酯。磷酸三酯极不稳定，随即水解，产生核苷磷酸三酯极不稳定，随即水解，产生核苷2 2，3 3环磷酸酯。该环磷酸酯继续水解产生环磷酸酯。该环磷酸酯继续水解产生2 2核苷核苷酸和酸和3 3核苷酸。核苷酸。 DNA DNA普通对碱稳定，假设在普通对碱稳定，假设在1mol/L NaOH1mol/L NaOH中加中加热至热至100 4h100 4h，可以得到小分子的寡聚脱氧核苷，可以

3、得到小分子的寡聚脱氧核苷酸。酸。核酸的酶水解 水解核酸的酶种类很多。非特异性水水解核酸的酶种类很多。非特异性水解磷酸二酯键的酶为磷酸二酯酶，如蛇毒解磷酸二酯键的酶为磷酸二酯酶，如蛇毒磷酸二酯酶和牛脾磷酸二酯酶。专注水解磷酸二酯酶和牛脾磷酸二酯酶。专注水解核酸的磷酸二酯酶称为核酸酶。另外还有核酸的磷酸二酯酶称为核酸酶。另外还有非特异水解糖苷键的糖苷酶。非特异水解糖苷键的糖苷酶。 核酸酶的分类按底物专注性分类：作用于按底物专注性分类：作用于RNA的称为的称为RNA酶酶ribonuclease，RNase；作用于；作用于DNA的称为的称为DNA酶酶deoxyribonuclease，DNase。按

4、对 底 物 作 用 的 方 式 可 分 为 核 酸 内 切 酶按 对 底 物 作 用 的 方 式 可 分 为 核 酸 内 切 酶endonuclease和核酸外切酶和核酸外切酶exonuclease。少数核酸酶既可内切又可外切。少数核酸酶既可内切又可外切。核酸酶的分类核酸外切酶有核酸外切酶有53方向切割的，也有方向切割的，也有35方向方向切割的，分别称为切割的，分别称为53外切酶和外切酶和35外切酶。外切酶。还有对特定核苷酸序列部位进展切割的。如还有对特定核苷酸序列部位进展切割的。如:限制限制性核酸内切酶性核酸内切酶 二、核酸的酸碱性质二、核酸的酸碱性质具有芳香环构造特点具有芳香环构造特点能发

5、生酮式能发生酮式/ /烯醇式、氨式烯醇式、氨式/ /亚氨式互变亚氨式互变嘌呤和嘧啶碱基都具有弱碱性嘌呤和嘧啶碱基都具有弱碱性 _ _主要是环内氨基的奉献主要是环内氨基的奉献1 1、碱基的解离、碱基的解离ONHNHOON-NHOCH3ONHNHOCH3ON-NHO19.5pK 19.9pK HHONH2NH+NHONH2NNHO-NH2NNH212.5pK 14.6pK HH 胞嘧啶中 尿嘧啶及胸腺嘧啶中NNH+NHNNH2NNNHNNH2NNN-NNH214.15pK HH29.8pK NNHNHNH+NH2ONNHNHNNH2ONN-NHNH+NH2ONN-N-NNH2OHHH13.2pK

6、29.6pK 312.4pK 鸟嘌呤和次黄嘌呤中质子那么结合到鸟嘌呤和次黄嘌呤中质子那么结合到N7N7上上2、核苷的解离、核苷的解离戊糖可加强碱基的酸性解离戊糖可加强碱基的酸性解离核糖中的羟基也可发生解离核糖中的羟基也可发生解离3.核苷酸的解离核苷酸的解离磷酸基使核苷酸具有很强的酸性磷酸基使核苷酸具有很强的酸性ROHOHOOPRO-OHOOPRO-O-OOP10.7 1.6pK HH25.96.5pK OHN-CH2OOOHOOPOHNCH2OOHN-CH2OOO-OOPOHNCH2OH11.5pK DNADNA等电点为等电点为4 44.54.5； RNARNA等电点为等电点为2 22.52.

7、5三、核酸的紫外吸收三、核酸的紫外吸收 碱基含有共轭双键碱基含有共轭双键 最大吸收峰最大吸收峰260nm左右左右核酸溶液紫外吸收以摩尔磷的吸光度表示，摩尔核酸溶液紫外吸收以摩尔磷的吸光度表示，摩尔磷即相当于摩尔核苷酸。磷即相当于摩尔核苷酸。30.98APWL（ ） ：摩尔吸光系数：摩尔吸光系数 A：吸收值：吸收值 W：每升溶液磷分量：每升溶液磷分量 L ：比色杯内径：比色杯内径 OD260的运用：的运用： 1. DNA或或RNA的定量的定量 OD260=1.0相当于相当于 50g/ml双链双链DNA 40g/ml单链单链DNA或或RNA 20g/ml寡核苷酸寡核苷酸 2.判别核酸样品的纯度判别

8、核酸样品的纯度 DNA纯品纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品纯品: OD260/OD280 = 2.0 含杂蛋白及苯酚，降低含杂蛋白及苯酚，降低 3.判别判别DNA能否变性能否变性四、核酸的变性、复性与杂交四、核酸的变性、复性与杂交( (一一) ) 核酸的变性核酸的变性denaturationdenaturation 1 1、DNADNA的变性：的变性： 在某些理化要素作用下，在某些理化要素作用下，DNADNA双链解开成两条单链的过程。双链解开成两条单链的过程。 某些理化要素破坏了氢键和碱基堆积力，某些理化要素破坏了氢键和碱基堆积力， 使核酸分子高级构造改动、理化性质及使核

9、酸分子高级构造改动、理化性质及 生物活性发生改动。生物活性发生改动。 不涉及磷酸二酯键断裂，一级构造不变不涉及磷酸二酯键断裂，一级构造不变2 2、变性的本质、变性的本质降解：核苷酸骨架上降解：核苷酸骨架上3，5 -磷酸二酯键的断裂磷酸二酯键的断裂DNADNA变性的本质是双链间氢键的断裂变性的本质是双链间氢键的断裂 高温普通高温普通7575 热变性热变性 强酸、碱强酸、碱 酸碱变性酸碱变性 甲醛甲醛AgaroseAgarose中中RNA RNA 尿素尿素PAGEPAGE中中DNA DNA 3 3、变性要素、变性要素 OD260 OD260增高增高 粘度下降粘度下降 比旋度下降比旋度下降 浮力密度

10、升高浮力密度升高 酸碱滴定曲线改动酸碱滴定曲线改动生物活性丧失生物活性丧失4、变性后理化性量变化、变性后理化性量变化RNA变性：从螺旋到线团之间的转变变性：从螺旋到线团之间的转变RNA的变性引起的性量变化没有的变性引起的性量变化没有DNA明显明显完全变性后核酸紫外吸收值添加：完全变性后核酸紫外吸收值添加：天然天然DNA 2540%、RNA 约约1.1%本质：碱基暴露本质：碱基暴露由于变性或降解引起紫外吸收添加的景由于变性或降解引起紫外吸收添加的景象称增色效应象称增色效应DNA变性变性5、DNA热变性的特征热变性的特征变性过程是变性过程是“跃变式的，而非渐变跃变式的，而非渐变解链曲线：延续加热解

11、链曲线：延续加热DNADNA，以温度，以温度对对A260A260作图，所得的曲线称为解链曲作图，所得的曲线称为解链曲线。线。指增色效应达指增色效应达50%时的温度时的温度普通普通DNA Tm 值在值在85 - 90 C之间之间 Tm：DNA变性时，变性时，OD260到达最大值的到达最大值的50%时的温度时的温度称为称为DNA的解链温度或融解的解链温度或融解温度温度(Tm)。大小与大小与G+C含量成正比。含量成正比。1 1DNADNA的均一性：的均一性：2 2G GC C含量：含量： 阅历公式：阅历公式： XG+C XG+CTmTm69.369.32.442.443 3介质中的离子强度：介质中的离子强度： Tm值大小与以下要素有关：值大小与以下要素有关：( (二二) )核酸的复性核酸的复性renaturationrenaturation 变性变性DNA在适当的条件下，两条彼此分开的在适当的条件下，两条彼此分开的单链重新缔合成双链单链重新缔合成双链复性。复性。热变性的热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火这一过程称为退火(annealing) 。DNA复性复性 分子量越大复性越难；分子量越大复性越难； 浓度越大，复性越容易；浓度越大，复性越容易； DNADNA复性也与它本身组成和构造有关复性也与它本身组成和构造有关 具有很多反复序列具有很多