酶联免疫吸附试验（操作）

1、动物检疫检验技术专业教学资源库酶联免疫吸附试验（操作）酶联免疫吸附试验（操作）酶联免疫吸附试验动物检疫检验技术专业教学资源库一、目的要求一、目的要求掌握ELISA的基本操作步骤，了解猪群猪瘟抗体监测的意义。酶联免疫吸附试验动物检疫检验技术专业教学资源库二、仪器材料二、仪器材料酶联检测仪、酶标板、微量加样器(配带滴头)、猪瘟病毒、酶标SPA、猪瘟阳性血清、猪瘟阴性血清、待检血清、pH9.6碳酸盐缓冲液、洗涤液（PBS-T）、BSA(牛血清白蛋白)、封闭液、稀释液、底物溶液、30%H2O2、2mol/L H2SO4溶液、邻苯二胺（OPD）。酶联免疫吸附试验动物检疫检验技术专业教学资源库二、仪器材料

2、二、仪器材料酶联免疫吸附试验动物检疫检验技术专业教学资源库三、方法与步骤三、方法与步骤PPA-ELISAPPA-ELISA检测猪瘟抗体效价检测猪瘟抗体效价1包被包被 用pH9.6碳酸盐缓冲液稀释猪瘟病毒抗原至1g/ml，以微量加样器每孔加样100l，置湿盒内37包被23h。2洗涤洗涤 用洗涤液（PBS-T）将反应板洗涤三次，每次5min，甩干。酶联免疫吸附试验动物检疫检验技术专业教学资源库三、方法与步骤三、方法与步骤3封闭封闭 以微量加样器在每孔内加封闭液200l，置湿盒内37封闭3h。4洗涤洗涤 重复第2步。5加待检血清加待检血清 以微量加样器在每孔内加100l稀释液，然后在酶标板的第1孔加

3、100l待检血清，以微量加样器反复吹吸几次混匀后，吸100l加至第2孔，依次倍比稀释至第12孔，剩余的100l弃去，置湿盒内37作用2h。酶联免疫吸附试验动物检疫检验技术专业教学资源库三、方法与步骤三、方法与步骤6洗涤洗涤 重复第2步7加酶标加酶标SPA 以稀释液将酶标SPA稀释至工作浓度，以微量加样器每孔加100l，置湿盒内37作用2h。8洗涤洗涤 重复第2步。9加底物溶液显色加底物溶液显色 每孔加入新配制的底物溶液100l，37避光显色10min。酶联免疫吸附试验动物检疫检验技术专业教学资源库三、方法与步骤三、方法与步骤10终止反应终止反应 加2mol/LH2SO4溶液终止反应，每孔50l

4、。11结果判定结果判定 以酶标仪检测样品的A490，检测之前，先以空白孔调零，当P/N2.1即判为阳性。注意：每块ELISA板均需在最后一排的后3孔设立阳性对照、阴性对照和空白对照。酶联免疫吸附试验动物检疫检验技术专业教学资源库结果判定：结果判定： 定性检测定性检测酶联免疫吸附试验动物检疫检验技术专业教学资源库结果判定：结果判定：定量检测定量检测酶联免疫吸附试验动物检疫检验技术专业教学资源库附：常用试剂的配制1.包被液(0.05molpH9.6碳酸盐缓冲液)：Na2CO3 1.59g NaHCO3 2.93g 蒸馏水 1000ml。2.缓冲液（0.01molpH7.4 PBS）：NaCl 8.0g；KH2PO4 0.2g；Na2HPO4 2.9g；KCl 0.2g；蒸馏水 1000ml。3.洗涤液（0.01molpH7.4PBS-吐温20）：Tween-20 0.5ml；0.01M pH7.4 PBS；1000ml。酶联免疫吸附试验动物检疫检验技术专业教学资源库4.封闭液（1%BSA-PBS-T）：BSA 1.0g；PBS-T 100ml。5.底物缓冲液（pH5.0磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液）：柠檬酸 4.6656g；Na2HPO4 7.2988g；蒸馏水 1000ml。6.底物溶液（临用前新鲜配制，配后立即使用）：邻苯二胺(OPD) 40mg；30%