第1章蛋白质多肽ppt课件

1、 多肽和蛋白质多肽和蛋白质 第第 一一 章章 从从基因到蛋白基因到蛋白质质 本章内容本章内容l蛋白质根底知识蛋白质根底知识l多肽的化学生物学多肽的化学生物学l蛋白质化学合成蛋白质化学合成l蛋白质修饰和蛋白质药物蛋白质修饰和蛋白质药物一、什么是蛋白质一、什么是蛋白质?蛋白质蛋白质(protein)是由许多氨基酸是由许多氨基酸(amino acids)经过肽键经过肽键(peptide bond)相连构成的高相连构成的高分子含氮化合物。分子含氮化合物。1. 蛋白质是生物蛋白质是生物 体重要组成成分体重要组成成分分布广：一切器官、组织都含有蛋白质；细胞的分布广：一切器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部

2、分都含有蛋白质。各个部分都含有蛋白质。含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的人体干重的45，某些组织含量更高，例如脾、，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达肺及横纹肌等高达80。1 1作为生物催化剂酶作为生物催化剂酶2 2代谢调理作用代谢调理作用3 3免疫维护作用免疫维护作用4 4物质的转运和存储物质的转运和存储5 5运动与支持作用运动与支持作用6 6参与细胞间信息传送参与细胞间信息传送多肽和蛋白质根底知识多肽和蛋白质根底知识第第 一一 节节 组成蛋白质的元素主要有主要有C、H、O、N和和S。 有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、有些

3、蛋白质含有少量磷或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘碘 。 蛋蛋 白白 质质 的的 分分 子子 组组 成成1 1 氨基酸氨基酸 组成蛋白质的根本单位组成蛋白质的根本单位存在自然界中的氨基酸有存在自然界中的氨基酸有300余种，但余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种，且均种，且均属属 L-氨基酸甘氨酸除外。氨基酸甘氨酸除外。L-L-氨基酸的通式氨基酸的通式RC+NH3COO-H 非极性疏水性氨基酸非极性疏水性氨基酸 极性中性氨基酸极性中性氨基酸 酸性氨基酸酸性氨基酸 碱性氨基酸碱性氨基酸一氨基酸的分类一氨基酸的分类*

4、 * 20 20种氨基酸的英文称号、缩写符号及分类如下种氨基酸的英文称号、缩写符号及分类如下: :甘氨酸甘氨酸 glycine Gly G 5.97丙氨酸丙氨酸 alanine Ala A 6.00缬氨酸缬氨酸 valine Val V 5.96亮氨酸亮氨酸 leucine Leu L 5.98 leucine Leu L 5.98 异亮氨酸异亮氨酸 isoleucine Ile I 6.02 苯丙氨酸苯丙氨酸 phenylalanine Phe F 5.48脯氨酸脯氨酸 proline Pro P 6.30非极性疏水性氨基酸非极性疏水性氨基酸色氨酸色氨酸 tryptophan Try W 5

5、.89丝氨酸丝氨酸 serine Ser S 5.68酪氨酸酪氨酸 tyrosine Try Y 5.66 半胱氨酸半胱氨酸 cysteine Cys C 5.07 蛋氨酸蛋氨酸 methionine Met M 5.74天冬酰胺天冬酰胺 asparagine Asn N 5.41 谷氨酰胺谷氨酰胺 glutamine Gln Q 5.65 苏氨酸苏氨酸 threonine Thr T 5.602. 极性中性氨基酸极性中性氨基酸天冬氨酸天冬氨酸 aspartic acid Asp D 2.97谷氨酸谷氨酸 glutamic acid Glu E 3.22赖氨酸赖氨酸 lysine Lys K

6、9.74精氨酸精氨酸 arginine Arg R 10.76组氨酸组氨酸 histidine His H 7.593. 酸性氨基酸酸性氨基酸4. 碱性氨基酸碱性氨基酸几种特殊氨基酸几种特殊氨基酸 脯氨酸脯氨酸亚氨基酸亚氨基酸CH2CHCOO-NH2+CH2CH2CH2CHCOO-NH2+CH2CH2-OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-CH-COO-+NH3-OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-CH-COO-+NH3 半胱氨酸半胱氨酸 +胱氨酸胱氨酸二硫键二硫键-HH-OOC-CH-CH2-SH+NH3-OOC-CH-CH2-SH+NH3HS-CH2-CH-COO-+NH3H

7、S-CH2-CH-COO-+NH3二硫键与蛋白质折叠二硫键与蛋白质折叠二氨基酸的理化性质二氨基酸的理化性质1. 两性解离及等电点两性解离及等电点等电点等电点(isoelectric point, pI) 在某一在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的子，呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨值称为该氨基酸的等电点。基酸的等电点。pH=pI+OH-pHpI+H+OH-+H+pHpI氨基酸的兼性离子氨基酸的兼性离子 阳离子阳离子阴离子阴离子CHNH2COOHR CHNH2COOHR

8、CHNH3+COO-R CHNH3+COO-RCHNH2COO-R CHNH2COO-RCH COOHRNH3+CH COOHRNH3+色氨酸、酪氨酸色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在的最大吸收峰在 280 nm 附近。附近。大多数蛋白质含大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。的快速简便的方法。1mg/ml芳香族氨基酸的紫外吸收芳香族氨基酸的紫外吸收 肽键肽键(peptide bond)是由一个氨基酸是由一个氨基酸的的-羧基与另一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸

9、的-氨基脱氨基脱水缩合而构成的化学键。水缩合而构成的化学键。NH2-CH-CHOOH甘甘氨氨酸酸NH2-CH-CHOOH甘甘氨氨酸酸NH-CH-CHOHO OH甘甘氨氨酸酸+-HOH甘氨酰甘氨酸甘氨酰甘氨酸肽键NH2-CH-C-N-CH-COOHHHHONH2-CH-C-N-CH-COOHHHHO* * 肽是由氨基酸经过肽键缩合而构成的化肽是由氨基酸经过肽键缩合而构成的化合物。合物。* * 两分子氨基酸缩合构成二肽，三分子氨两分子氨基酸缩合构成二肽，三分子氨基酸缩合那么构成三肽基酸缩合那么构成三肽* * 肽链中的氨基酸分子由于脱水缩合而基团肽链中的氨基酸分子由于脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸

10、残基不全，被称为氨基酸残基(residue)(residue)。* * 由由1515个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽(oligopeptide)(oligopeptide)，由更多的氨基酸相连构成，由更多的氨基酸相连构成的肽称多肽的肽称多肽(polypeptide)(polypeptide)。N 末端：多肽链中有自在氨基的一端末端：多肽链中有自在氨基的一端C 末端：多肽链中有自在羧基的一端末端：多肽链中有自在羧基的一端多肽链有两端多肽链有两端* 多肽链多肽链(polypeptide chain)是指许多氨基是指许多氨基酸之间以肽键衔接而成的一种构造。酸之间以肽键

11、衔接而成的一种构造。N末端末端C末端末端牛核糖核酸酶牛核糖核酸酶豌豆豌豆 defensin 1 三维构造三维构造NC常用的蛋白质信息网站常用的蛋白质信息网站Expert Protein Analysis Systemexpasy.ch/Protein Data Bank / 体内许多激素属寡肽或多肽 神经肽神经肽(neuropeptide)二二 几种生物活性肽几种生物活性肽单纯蛋白质单纯蛋白质结合蛋白质结合蛋白质 = = 蛋白质部分蛋白质部分 + + 非蛋白质部分非蛋白质部分纤维状蛋白质纤维状蛋白质球状蛋白质球状蛋白质 肽的分类肽的分类高级高级构造构造3.1 3

12、.1 蛋白质的一级构造蛋白质的一级构造主要的化学键主要的化学键肽键，有些蛋白质还包括二硫键。肽键，有些蛋白质还包括二硫键。 一级构造是蛋白质空间构象和特异生物学一级构造是蛋白质空间构象和特异生物学功能的根底。功能的根底。3.2 蛋白质的二级构造蛋白质的二级构造定义定义 主要的化学键：主要的化学键： 氢键氢键 - -螺旋螺旋 ( ( -helix ) -helix ) - -折叠折叠 ( ( -pleated sheet )-pleated sheet ) - -转角转角 ( ( -turn )-turn ) 无规卷曲无规卷曲 ( random coil ) ( random coil ) 二二

13、 - -螺旋螺旋目目 录录三三- -折叠折叠钙结合蛋白中结合钙离子的模体钙结合蛋白中结合钙离子的模体 Beta Helices 3.3 蛋白质的三级构造蛋白质的三级构造疏水键、离子键、氢键和疏水键、离子键、氢键和 Van der Waals力等。力等。 主要的化学键主要的化学键整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置,即肽链中一切原子在三维空间的排布位置。即肽链中一切原子在三维空间的排布位置。一一 定义定义 N 端端 C端端亚基之间的结合力主要是疏水作用，其次亚基之间的结合力主要是疏水作用，其次是氢键和离子键。是氢键和离子键。有些蛋白质分子含有二条或多条多肽

14、链，有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完好的三级构造，称为蛋白每一条多肽链都有完好的三级构造，称为蛋白质的亚基质的亚基 (subunit) (subunit)。 一级一级 二级二级 三级三级 四级四级 卷曲螺旋卷曲螺旋(coiled coil)一一级构造是空间构象的根底一一级构造是空间构象的根底 3.5 蛋白质一级构造与功能的关系蛋白质一级构造与功能的关系 牛核糖核酸酶的牛核糖核酸酶的一级构造一级构造 天然形状，天然形状，有催化活性有催化活性 尿素、尿素、 -巯基乙醇巯基乙醇 去除尿素、去除尿素、-巯基乙醇巯基乙醇非折叠形状，无活性非折叠形状，无活性 N-val his le

15、u thr pro glu glu C(146) HbS 肽链肽链HbA 肽肽 链链N-val his leu thr pro val glu C(146) Hb与与Mb一样能可逆地与一样能可逆地与O2结合，结合， Hb与与O2结合后称为氧合结合后称为氧合Hb。氧合。氧合Hb占总占总Hb的百的百分数称百分饱和度随分数称百分饱和度随O2浓度变化而改动。浓度变化而改动。PrPc-螺旋螺旋PrPsc-折叠折叠正常正常疯牛病疯牛病4 蛋白质的分别和纯化蛋白质的分别和纯化一透析及超滤法一透析及超滤法* 透析透析(dialysis) 利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物

16、分开的方法。合物分开的方法。* * 超滤法超滤法 运用正压或离心力使蛋白质溶液透过有运用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，到达浓缩蛋白质一定截留分子量的超滤膜，到达浓缩蛋白质溶液的目的。溶液的目的。二丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀二丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀 *运用丙酮沉淀时，必需在运用丙酮沉淀时，必需在04低温下进展，低温下进展，丙酮用量普通丙酮用量普通10倍于蛋白质溶液体积。蛋白倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立刻分别。除了丙酮以质被丙酮沉淀后，应立刻分别。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。外，也可用乙醇沉淀。 *盐析盐析(salt precipitation)是将硫酸铵

17、、硫酸钠是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等参与蛋白质溶液，使蛋白质外表或氯化钠等参与蛋白质溶液，使蛋白质外表电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。沉淀。 * * 免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并构成抗原抗体体识别相应的抗原蛋白，并构成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分别获得抗原蛋白。别获得抗原蛋白。 三电泳三电泳pI层析层析(chromatography)(chromatogr

18、aphy)分别蛋白质的原理分别蛋白质的原理待分别蛋白质溶液流动相经过一个固态物待分别蛋白质溶液流动相经过一个固态物质固定相时，根据溶液中待分别的蛋白质质固定相时，根据溶液中待分别的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分别的颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分别的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而到达分别蛋白质的目的流经固定相而到达分别蛋白质的目的 。五超速离心五超速离心* * 超速离心法超速离心法(ultracentrifugation)(ultracentrifugation)既可以用来既可以用来分别纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质

19、分别纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。的分子量。 5 多肽链中氨基酸序列分析多肽链中氨基酸序列分析分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基把肽链水解成片段，分别进展分析把肽链水解成片段，分别进展分析测定各肽段的氨基酸陈列顺序，普通采用测定各肽段的氨基酸陈列顺序，普通采用Edman降解法降解法普通需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸普通需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合陈列对比，最终得出完好肽链中氨顺序，然后经过组合陈列对比，最终得出完好肽链中氨基

20、酸顺序的结果。基酸顺序的结果。异硫氰酸苯酯异硫氰酸苯酯 二级构造测定二级构造测定通常采用圆二色光谱通常采用圆二色光谱(circular dichroism，CD)测测定溶液形状下的蛋白质二级构造含量。定溶液形状下的蛋白质二级构造含量。 -螺旋螺旋的的CD峰有峰有222 nm处的负峰、处的负峰、208nm处的负峰和处的负峰和198 nm处的正峰三个成分；而处的正峰三个成分；而-折叠的折叠的CD谱不谱不很固定。很固定。 多肽的化学生物学多肽的化学生物学第第 二二 节节l多肽的化学生物学多肽的化学生物学l蛋白质化学合成蛋白质化学合成l蛋白质修饰和蛋白质药物蛋白质修饰和蛋白质药物2.1 多肽的化学合成

21、多肽的化学合成1. 肽键构成原理和维护基肽键构成原理和维护基 原理：多肽的合成就是构成肽键的过程，即一个氨基原理：多肽的合成就是构成肽键的过程，即一个氨基 酸酸AA氨基亲核进攻另一个氨基酸被活化的氨基亲核进攻另一个氨基酸被活化的 羧基部分，构成肽键。羧基部分，构成肽键。 氨基酸的活性基团必需进展维护。氨基酸的活性基团必需进展维护。 肽键构成步骤肽键构成步骤R1PGOHOH2NR1OHONH活化活化PGR1NH OXR2OHOH2NPGNHR1OHNR2OHO2. 化学合成多肽的开展历程化学合成多肽的开展历程l早期：液相合成早期：液相合成l 1901，德国化学家，德国化学家Fischer合成了合

22、成了Gly-Glyl 20世纪中期，合成活性肽，如催产素、胰岛素。世纪中期，合成活性肽，如催产素、胰岛素。l l 1963年，年，Merrifield提出了固相合成提出了固相合成SPPS，1984年诺贝尔奖。在年诺贝尔奖。在1966年发明了第一台自动的年发明了第一台自动的固相肽合成仪。固相肽合成仪。 3. 液相多肽合成液相多肽合成步骤：步骤：多肽的多肽的C端氨基酸经过端氨基酸经过linker键连到树脂上；键连到树脂上；脱除氨基上的暂时维护基；脱除氨基上的暂时维护基；与下一个氨基酸缩合；与下一个氨基酸缩合；反复进展脱维护和缩合两个步骤；反复进展脱维护和缩合两个步骤；脱除半永久性维护基；脱除半永久

23、性维护基； 4. 固相多肽合成固相多肽合成NHOROHYNHOROY去维护去维护H2NORONHOR2OHYR2ONHHNYORO 固相多肽合成过程固相多肽合成过程根据维护战略不同分为根据维护战略不同分为Boc和和Fmoc方法方法Boc叔丁氧羰基叔丁氧羰基 30%-50%三氟乙酸三氟乙酸 强酸强酸 很少运用很少运用 Fmoc9-芴甲氧羰基芴甲氧羰基 20%哌啶哌啶 弱弱酸酸 方便方便 类型类型 脱除维护基条件脱除维护基条件 裂解条件裂解条件 自动化合成自动化合成l环合方式：环合方式：l 主链头主链头- -尾环合，侧链尾环合，侧链- -侧链环合侧链环合l 侧链侧链- -头环合，尾头环合，尾- -

24、侧链环合侧链环合l 固相液相方法均可，但反响较慢。固相液相方法均可，但反响较慢。 5. 环肽合成环肽合成2.2 肽模拟物肽模拟物l以酰胺类似物或二级构造类似物替代多肽的模拟物。以酰胺类似物或二级构造类似物替代多肽的模拟物。l e.g. NH 用氧原子用氧原子 O ，硫原子，硫原子 S ，取代或是对其进展烷基化修饰。取代或是对其进展烷基化修饰。 l2. 功能模拟物：作用于多肽受体的非肽类小分子，是功能模拟物：作用于多肽受体的非肽类小分子，是天然多肽的构造类似物。天然多肽的构造类似物。l3. 非肽类化合物：有新型的肽母核，但包含多肽发扬非肽类化合物：有新型的肽母核，但包含多肽发扬作用所必需的关键功

25、能基团。作用所必需的关键功能基团。 类肽类肽l定义：以定义：以N-取代甘氨酸为构建的单元化合物。取代甘氨酸为构建的单元化合物。l 优点：比肽的构象柔性高，不会被蛋白酶优点：比肽的构象柔性高，不会被蛋白酶水解，具有更高的代谢稳定性，提高生物利用度水解，具有更高的代谢稳定性，提高生物利用度及生物活性及生物活性 。R3OHNOR2R1HNO肽肽类肽类肽NHONR1NR2ONR32.4 多肽的运用和肽类药物多肽的运用和肽类药物多肽多肽+优点：比药物更容易在细胞内表达，可用于预测药物作优点：比药物更容易在细胞内表达，可用于预测药物作 用位点，确认靶标。用位点，确认靶标。 合成可与靶蛋白特定功能位点序列一

26、样的多肽，作为合成可与靶蛋白特定功能位点序列一样的多肽，作为检测平台，然后测定小分子置换多肽配体或阻止配体结合检测平台，然后测定小分子置换多肽配体或阻止配体结合才干。才干。2.2 蛋白质化学合成蛋白质化学合成生物表达方法的局限：生物表达方法的局限：只含只含20中天然氨基酸，非天然氨基酸难以引入；中天然氨基酸，非天然氨基酸难以引入；翻译后修饰困难，不易准确控制；翻译后修饰困难，不易准确控制；大于大于30 kDa的蛋白质表达不容易；的蛋白质表达不容易；细胞中表达有毒蛋白或膜蛋白困难。细胞中表达有毒蛋白或膜蛋白困难。2.2.1 蛋白质的化学全合成蛋白质的化学全合成1. 开展历程开展历程 固相多肽合成

27、实际中指能合成固相多肽合成实际中指能合成50-60个氨基酸个氨基酸的肽链。的肽链。衔接反响衔接反响Target Protein 多肽的侧链官能团需求维护。多肽的侧链官能团需求维护。 局限局限 C端氨基酸在活化的过程中容易消旋，最端氨基酸在活化的过程中容易消旋，最后脱维护步骤能够严重影响产率。后脱维护步骤能够严重影响产率。2. 自然化学衔接自然化学衔接(Native chemical ligation, NCL)反响机理反响机理外加硫醇与多肽硫酯发生酯交换；外加硫醇与多肽硫酯发生酯交换；新构成的硫酯与新构成的硫酯与N N端端CysCys侧链上的巯基发生酯交换，侧链上的巯基发生酯交换，构成硫酯中间

28、体；构成硫酯中间体；S-NS-N的酰基转移，生成以的酰基转移，生成以CysCys为衔接点的多肽。为衔接点的多肽。多肽硫酯是制备的关键，限制是多肽硫酯是制备的关键，限制是Cys Cys Boc法制备硫酯法制备硫酯l目前最有效方法；目前最有效方法；l但产率低，反响条件猛烈，危险。但产率低，反响条件猛烈，危险。3. NCL的运用和实例的运用和实例lHIV1蛋白酶的合成蛋白酶的合成l 抗抗HIV疗法的一个靶向目的，由疗法的一个靶向目的，由2条含条含99的氨基酸的的氨基酸的多肽组成的聚体。多肽组成的聚体。l HIV1蛋白酶发生变构或失活蛋白酶发生变构或失活l l 无活性的病毒颗粒无活性的病毒颗粒l l

29、HIV1蛋白酶是病毒复制必需酶蛋白酶是病毒复制必需酶 HIV1蛋白酶的合成过程蛋白酶的合成过程A1-A40B42-B99A42-A99B1-b40A1-A40A42-A99B1-b40B42-B99A1-A40A42-A99B1-b40B42-B99GlnA41Gln-(Gly)4GlnB41CysA41CysB41GlnA41arylSarylSarylSarylSGlnB41+Cys-(Gly)4Cys-(Gly)4 生物学的方法生物学的方法 内含肽内含肽表达蛋白衔接表达蛋白衔接express protein ligation,EPLexpress protein ligation,EPL

30、优点：优点：一、可在蛋白质中引入数量不限的非天然氨基酸；一、可在蛋白质中引入数量不限的非天然氨基酸；二、能实现大范围的蛋白修饰。二、能实现大范围的蛋白修饰。 1. 开展历程开展历程1蛋白质半合成的提出蛋白质半合成的提出天然蛋白天然蛋白 水解切断水解切断 片段片段 合成蛋白质合成蛋白质2化学性衔接方法：化学性衔接方法：Kent ，处理了维护的问题，需求引入，处理了维护的问题，需求引入N端端Cys 或或C端硫酯，重组蛋白制备问题。端硫酯，重组蛋白制备问题。3蛋白质剪接技术的发明和运用蛋白质剪接技术的发明和运用内含肽内含肽Intein是一段随功能蛋白一是一段随功能蛋白一同表达，并在表达后可进展自剪接

31、的多同表达，并在表达后可进展自剪接的多肽。它兼有蛋白酶和蛋白衔接酶的特性，肽。它兼有蛋白酶和蛋白衔接酶的特性，与内含子与内含子RNA程度自剪切的作用方程度自剪切的作用方式类似。式类似。 什么是内含肽？什么是内含肽？ 1994 1994年年perlerperler报道了第一个存在报道了第一个存在于啤酒酵母于啤酒酵母VAM1VAM1基因的内含肽后，基因的内含肽后，已鉴定出已鉴定出400400多种多种蛋白质剪接过程蛋白质剪接过程 第第1步：剪接是由步：剪接是由N末端的半胱氨酸的末端的半胱氨酸的N S或是或是N-O的酰的酰基迁移，将基迁移，将N端外显肽端外显肽1衔接到内含肽衔接到内含肽N端端Cys的巯

32、基上构的巯基上构成硫酯；成硫酯； 第第2步：发生转酯化反响：外显肽步：发生转酯化反响：外显肽2的的N端半胱氨酸残基巯端半胱氨酸残基巯基攻击硫酯，构成一个分支状的酯或硫酯中间物；基攻击硫酯，构成一个分支状的酯或硫酯中间物； 第第3步：是肽键的断裂伴随着内含肽步：是肽键的断裂伴随着内含肽C末端琥珀酰胺的构成，末端琥珀酰胺的构成，使内含肽释放出来。接着放生使内含肽释放出来。接着放生S N或或S-O酰基转移，构成酰基转移，构成一个稳定的酰胺键，从而构成一个成熟的外显肽。一个稳定的酰胺键，从而构成一个成熟的外显肽。 蛋白质剪接机理蛋白质剪接机理1: 酰酰基基转转移移3: 琥珀琥珀酰酰胺中胺中间间体体Ch

33、ong et al. (2019) J. Biol Chem. 271:22159内含肽内含肽外显肽外显肽2外显肽外显肽1亚酰胺亚酰胺内含肽的运用内含肽的运用消费环肽和蛋白消费环肽和蛋白蛋白质纯化蛋白质纯化位点特异性蛋白修饰位点特异性蛋白修饰分子间蛋白质互作分子间蛋白质互作蛋白衔接蛋白衔接IPLIPL2. 2. 表达蛋白衔接表达蛋白衔接EPL)EPL)l始于始于2019年，利用蛋白质剪接技术。年，利用蛋白质剪接技术。l硫酯是硫酯是NCL和和EPL的活性关键基团的活性关键基团,蛋白硫酯经过蛋白硫酯经过重组表达获得。重组表达获得。l利用蛋白剪接制备硫酯。利用蛋白剪接制备硫酯。HSHN蛋白剪接制备硫

34、酯蛋白剪接制备硫酯NHO多肽多肽内含肽内含肽CBDOSO多肽多肽H2N内含肽内含肽HNCBDORSHSRO多肽多肽硫酯硫酯HSH2N内含肽内含肽HNCBDOHNHSHN表达蛋白衔接表示图表达蛋白衔接表示图NHO多肽多肽1内含肽内含肽CBDOSO多肽多肽1H2N内含肽内含肽HNCBDORSHO多肽多肽1SRO多肽多肽1HS多肽多肽2HSNH2多肽多肽2NCL3. EPL的运用实例的运用实例1 1 蛋白质翻译后修饰蛋白质翻译后修饰 糖基化、磷酸化、酯化例子：例子：Muir利用利用EPL用于泛素化组蛋白用于泛素化组蛋白H2B的合成的合成H2B(118-125)泛素泛素(1-75)OSRH2B(118

35、-125)泛素泛素(1-75)H2B(1-116)H2B(1-116)H2B(118-125)泛素泛素(1-75)脱硫脱硫(2) (2) 引入非天然氨基酸引入非天然氨基酸4 蛋白质固定化用于生物芯片研讨蛋白质固定化用于生物芯片研讨 几种蛋白纯化方法几种蛋白纯化方法Intein System5 内含肽介导的蛋白质纯化内含肽介导的蛋白质纯化 C 端交融端交融 N 端交融端交融 优点优点l运用亲和层析的方法得到无亲和标签的蛋白，运用亲和层析的方法得到无亲和标签的蛋白，l 防止运用昂贵的蛋白酶切除亲和标签；防止运用昂贵的蛋白酶切除亲和标签；l可得到无甲硫氨酸和载体氨基酸残基的蛋白质。可得到无甲硫氨酸和

36、载体氨基酸残基的蛋白质。TRENDS in Biochemical Sciences Vol.27 No.3 2019 70 70年代年代GranGran首首先在一种非洲植物先在一种非洲植物发现一种由发现一种由2929个氨个氨基酸的环肽基酸的环肽Kalata Kalata B1B1后，人们相继从后，人们相继从微生物、动植物中微生物、动植物中发现了环形的肽和发现了环形的肽和蛋白。蛋白。 N-内含肽内含肽 C-内含肽内含肽 2.3 蛋白质修饰和蛋白质药物蛋白质修饰和蛋白质药物2.3.1 2.3.1 蛋白质修饰蛋白质修饰 定义：经过化学手段改动蛋白质分子的化学定义：经过化学手段改动蛋白质分子的化学构

37、造，从而在目的蛋白上引入特定的化学基团，构造，从而在目的蛋白上引入特定的化学基团，改动其化学功能和生物性质，以便研讨蛋白质的改动其化学功能和生物性质，以便研讨蛋白质的构造和功能关系，并定向的改造蛋白质的性质和构造和功能关系，并定向的改造蛋白质的性质和功能。功能。 类型：类型： 基于天然氨基酸侧链官能团的修饰基于天然氨基酸侧链官能团的修饰 基于非天然活性基团的修饰基于非天然活性基团的修饰1 1基于天然氨基酸侧链官能团的修饰基于天然氨基酸侧链官能团的修饰l酪氨酸、赖氨酸、色氨酸、半胱氨酸、组氨酸酪氨酸、赖氨酸、色氨酸、半胱氨酸、组氨酸lN端位点的选择性修饰端位点的选择性修饰lC端位点的选择性修饰端

38、位点的选择性修饰l特殊序列的蛋白质修饰特殊序列的蛋白质修饰 特殊序列的蛋白质修饰Cys CysCys CysPro GlySHSHSHSHCO2HOHOOAsAsSSSSCO2HOHOOAsAsSSSSCCPGCC序列序列双砷荧光染料双砷荧光染料 2 2基于非天然活性基团的正交方法基于非天然活性基团的正交方法l酮基官能化修饰：酮基酮基官能化修饰：酮基+烷氧基烷氧基 腙或胯腙或胯lStaudinger衔接修饰：叠氮化合物和三苯基磷化合物作用衔接修饰：叠氮化合物和三苯基磷化合物作用生成酰胺键，反响中脱去一份子氮气构成磷的亚氨基化合生成酰胺键，反响中脱去一份子氮气构成磷的亚氨基化合物。物。lClic

39、k反响修饰：叠氮和炔发生环加成反响。反响修饰：叠氮和炔发生环加成反响。腙腙蛋白质蛋白质N3NH染料染料OCu离子离子+蛋白质蛋白质染料染料蛋白质蛋白质N3生物素生物素+糖复合物糖复合物蛋白质蛋白质生物素生物素糖复合物糖复合物2.3.2 2.3.2 蛋白质药物蛋白质药物 疾病疾病 蛋白质蛋白质 目前运用心脏病、糖尿病、本身免疫病等很多方面。目前运用心脏病、糖尿病、本身免疫病等很多方面。l蛋白质药物可分为多肽和基因工程药物、单克隆蛋白质药物可分为多肽和基因工程药物、单克隆抗体和基因工程抗体、重组疫苗。抗体和基因工程抗体、重组疫苗。l优点：优点：l 与以往的小分子药物相比，蛋白质药物具与以往的小分子

40、药物相比，蛋白质药物具有高活性、特异性强、低毒性、生物功能明确、有高活性、特异性强、低毒性、生物功能明确、有利于临床运用的特点。由于其本钱低、胜利率有利于临床运用的特点。由于其本钱低、胜利率高、平安可靠，已成为医药产品中的重要组成部高、平安可靠，已成为医药产品中的重要组成部分。分。l 1982年美国年美国Likky公司首先将重组胰岛素投放公司首先将重组胰岛素投放市场，标志着第一个重组蛋白质药物的诞生。市场，标志着第一个重组蛋白质药物的诞生。 A. 生物体内分别生物体内分别:主要是动物组织、天然微生物、主要是动物组织、天然微生物、植物。植物。 B. 重组重组DNA技术、分子克隆技术、细胞工程技术，技术、分子克隆技术、细胞工程技术，在细菌、哺乳动物等培育细胞中得到。在细菌、哺乳动物等培育细胞中得到。 缺陷：分别步骤困难，纯度不高。缺陷：分别步骤困难，纯度不高。 优点：容易分别优点：容易分别. .1 1蛋白质药物的来源蛋白质药物的来源 乳腺生物反响器乳腺生物反响器 动物：绵羊、山羊、猪、牛技术程度曾经达商业化消费要求的有约30种以上正在进展临床实验的有约15-20种。约120种以上的药用蛋白正在进展转基因动物消费的开发利用动物乳腺生物反响器消费重组蛋白的优点利用动物乳腺生物