酶联免疫分析法

1、会计学1酶联免疫分析法酶联免疫分析法n1971年第一届国际免疫学会议 将免疫学与微生物学分开发展成一门独立的学科。境稳定的一种生理性功能。第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述n具备上述两种特性的物质为完全抗原，仅具有 免 疫 反 应 性 的 物 质 被 称 为 半 抗 原（hapten）。第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述反应，这种反应具有高特异性（即专一性）和可逆性。第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述衡常数（亲和常数）。Kkk21AbAgAg-Ab第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述用已知抗体检测某些药物、激素等各种半抗原物质。第一节第一节 酶联免

2、疫分析概述酶联免疫分析概述免疫分析标记免疫分析放射免疫分析法化学发光免疫分析法电化学免疫分析法荧光免疫分析法酶联免疫分析法竞争性酶联免疫分析非竞争性酶联免疫分析均相酶联免疫分析非均相酶联免疫分析非标记免疫分析沉淀反应、凝集反应、免疫电泳、免疫扩散第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述酶酶来源来源EC编号编号辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶辣根辣根1.11.1.7酸性磷酸酶酸性磷酸酶动植物动植物3.1.3.2碱性磷酸酶碱性磷酸酶牛肠牛肠3.1.3.1-D-

3、半乳糖苷酶半乳糖苷酶大肠杆菌大肠杆菌3.2.1.23葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶曲霉菌曲霉菌1.1.3.4脲酶脲酶Jack豆豆3.5.1.5青霉素酶青霉素酶3.5.2.6过氧化氢酶过氧化氢酶肝肝1.11.1.6葡萄糖淀粉酶葡萄糖淀粉酶根霉菌根霉菌3.2.1.3碳酸苷酶碳酸苷酶牛红细胞牛红细胞4.2.1.1乙酰胆碱酶乙酰胆碱酶3.1.1.7葡萄糖葡萄糖-6-磷酸脱氢酶磷酸脱氢酶肠系膜明串细菌肠系膜明串细菌1.1.1.49溶菌酶溶菌酶鸡卵白鸡卵白3.2.1.17苹果酸脱氢酶苹果酸脱氢酶猪心线粒体猪心线粒体1.1.1.49无机焦磷酸酶无机焦磷酸酶大肠杆菌大肠杆菌3.6.1.1荧光素酶荧光素酶发光生物发光

4、生物1.3.12.7丙酮酸激酶丙酮酸激酶哺乳动物组织哺乳动物组织2.7.1.40酶联免疫分析常用酶酶联免疫分析常用酶第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述（purpurogallinHRP1位。n用于标记的HRP比活性应大于250U/mg。第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述n用作标记的AP比活力应大于1000U/mg。第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述n葡萄糖氧化酶在4下可稳定存在612个月。第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述例；加入酶反应底物，底物被酶催化为有色产物，产物量与标本中受检物的量相关，用分光

5、光度法进行定量。g。*( )( )gbgbggbAAAAFBAAA第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法n一般蛋白质的包被浓度为0.120g/ml。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法列于表7-2。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法编编号号吐温吐温20/%组成组成稀稀释释液液10.05PBS 0.01mol/L，pH 7.42PBS 0.05mol/L，pH 7.43PBS 0.05mol/L，pH 7.4，含，含EDTA 10mmol/L4PBS 0.

6、05mol/L，pH 6.9，含，含EDTA 10mmol/L洗洗涤涤液液10.1PBS 0.01mol/L，pH 7.22PBS 0.01mol/L，pH 8.03Tris-HCl缓冲液缓冲液0.01mol/L，pH 8.0，NaCl 0.15mol/L表表7-2 常用的抗体稀释液和洗涤液常用的抗体稀释液和洗涤液第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法nTMB的，第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法-和溴麝香草酚蓝（21

7、）等。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法NH2+ HCCHOONH2+CCNHHNCCNHHNCCNHHN+图图7-2 戊二醛一步法反应原理戊二醛一步法反应原理一步法一步法 将戊二醛将戊二醛直接直接加入加入酶与抗体的混合物酶与抗体的混合物中，反应后即得酶标记中，反应后即得酶标记抗体。抗体。 该法操作该法操作简便简便、有效有效，重复性好重复性好。 缺点是交联反应是缺点是交联反应是随机随机的，酶与酶、抗体与抗的，酶与酶、抗体与抗体之间有可能交联。体之间有可能交联。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法HCCHOONH2+

8、CCNOHHCCNHHNNH2图图7-3 戊二醛二步法反应原理戊二醛二步法反应原理两步法两步法 先将先将酶与戊二醛酶与戊二醛作用作用，透析透析除去多余的除去多余的戊二醛后，再与戊二醛后，再与抗体抗体作作用而形成酶标抗体；用而形成酶标抗体；或或先将抗体与戊二醛作用先将抗体与戊二醛作用，再与酶联结。，再与酶联结。 两步法的产物中绝大部两步法的产物中绝大部分的酶与蛋白质是以分的酶与蛋白质是以1:1的比例结合的，的比例结合的，有助于有助于本底的改善本底的改善。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法n图7-4 过碘酸盐氧化法第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法第二节第二节 酶联

9、免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法图图7-5 双抗体夹心法双抗体夹心法第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法图图7-6 间接法间接法第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法图图7-7 竞争法竞争法第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法图图7-8 异种动物抗体夹心法异种动物抗体夹心法第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法和IgG连接起来。n最后让酶与抗酶抗

10、体结合，通过对底物的作用而揭示在固相载体上待测抗原的存在。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法。n因为制备抗酶抗体必须在动物中进行，故抗酶抗体法多适用于检测动物中的抗体。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法图图7-9 抗酶抗体法抗酶抗体法第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法光度。n选择吸光度为1的稀释度作为酶标抗体最适浓度。图图7-10 酶标抗体浓度的选择酶标抗体浓度的选择第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法n的饱和包被浓度。图图7-11 抗原包被量和抗原包被量和ELISA反应的关系反应的关系 第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附

11、分析法包被质量浓度（包被质量浓度（mg/mlmg/ml）ELISAELISA测定结果（测定结果（A A492492SDSD）（n n=4=4）4 41.0981.0980.06280.06281 1* *1.0111.0110.03020.03020.50.50.9690.9690.08760.08760.250.250.7920.7920.10230.1023第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法时，IgG量为0.62mg/ml；0.94表示酶、戊二醛结合后，A280nm增加约6。403/0.4nmmg mLA酶量（）62. 09

12、4. 0)42. 0(/IgG403280nmnmAAmLmg）量（第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法结果。）结合物溶液量（）每毫升溶液中的酶量（）结合物中酶量（mLmLmgmg/%100%）标志时加入的酶量（）结合物中酶量（酶结合率mgmgHRPHRP/HRPHRP/160000IgGIgG/IgGIgG/40000mg mLmg mLmg mLmg mL（）分子量（）（摩尔比）（）分子量（）第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法n采用放大系统是提高ELISA灵敏度的主要途径。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法ELISAn生物素-亲和素标记体系有灵

13、活多变的运用方式，可以适应不同的分析设计。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法蛋白，灵敏度放大两个数量级。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法体、酶结合物、底物和各种浓缩的稀释液、缓冲液等。n这些试剂在冰箱中可保存半年以上，因此实验室中只需要用蒸馏水稀释全套试剂即可。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法nELISA测定125SerIL-2中青霉噻唑蛋白的结果如下（见表7-4）：第二节第二节 酶联免疫吸附分

14、析法酶联免疫吸附分析法表表7-4 ELISA实验测定实验测定125SerIL-2*中青霉噻唑蛋白中青霉噻唑蛋白第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法指每摩尔反应物辐射出光子的量。第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析+D*C B+AhvC*C 第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析、。 第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析 第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析 图图7-12 吖啶酯氧化反应过程吖啶酯氧化反应过程第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析 第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免

15、疫分析 图图7-13 光泽精的氧化反应光泽精的氧化反应第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析。 第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析 第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析 图图7-14 鲁米诺、异鲁米诺及其某些衍生物的结构式鲁米诺、异鲁米诺及其某些衍生物的结构式第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析 图图7-15 鲁米诺化学发光反应过程鲁米诺化学发光反应过程第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析 第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析 图图7-16 咯吩碱的化学发光反应咯吩碱的化学发光反应第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析获化学能

16、，使荧光体处于激发态，退激至基态时，放出光子。 第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析疫测定过程。 第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析 第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析n光反应。 第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析 第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析n某些酸类衍生物尤其是对碘酸、苯甲酸等的增强效果更佳，可使其发光强度提高1000倍，且延长发光持续时间。 第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析度大，持续时间长，发光稳定，故生物发光分析灵敏度高，容易测定。第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析 n越广泛地引起人们的重视。 第

17、三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析 第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析 第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析max=490nm，从而可以进行生物发光酶联免疫检测。 第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析n以邻苯三酚-H2O2为底物测定登革热型病毒b、伤寒杆菌、细菌内毒素等物质。 第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析 第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析 第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析么要求？HRP的常用底物有哪些？AP的常用底物有哪些？-D-半乳糖苷酶的常用底物有哪些？青霉素酶的常用底物有哪些？ 思考题思考题些？化学发光酶联免疫分析常用的发光增强剂有哪些？17、最常用于生物发光酶联免疫分析的生物发光反应有哪些？ 思考题思考题第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法和IgG连接起来。n最后让酶与抗酶抗体结合，通过对底物的作用而揭示在固相载体上待测抗原的存在。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法光度。n选择吸光度为1的稀释度作为酶标抗体最适浓度。图图7-10 酶标抗体浓度的选择酶标抗