分子生物学与生物化学实验操作设计与技能(9)

1、分子生物学与生物化学实验分子生物学与生物化学实验操作、设计与技能操作、设计与技能印迹技术和酶联免疫技术李 刚 副教授Northern Blot2Southern Blot1Western Blot3 酶联免疫吸附分析（ELISA）4Southern Blot原理与用途 原理：将待检测的DNADNA分子用分子用/ /不用限制性内切酶不用限制性内切酶消化消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记同位素或其它标记物标记的物标记的DNADNA或或RNARNA探针进行反

2、应探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它用自显影或其它合适的技术进行检测合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。 用途：检测样品中的检测样品中的DNADNA及其含量，了解基因的状及其含量，了解基因的状态态, 如是否有点突变、扩增重排等。 Southern Blot 操作步骤DNA 琼脂糖电泳琼脂糖电泳 印迹转移印迹转移 预杂交预杂交 杂交（变性探针）杂交（变性探针） 洗膜洗膜 放射自显影或显色放射自显影或显色。Southern BlotSouthern Blot操作步骤：操作步骤：转膜方法毛细管转移法毛细管转

3、移法（向上、向下）：DNA 片段由液流携带而从凝胶转移并聚集于固相支持物表面。液体通过毛细管作用抽吸过凝胶,借助于一叠干燥的吸水纸巾产生并维持毛细管作用。转移的速率取决于DNA片段的大小和凝胶中的琼脂糖的浓度，小片段小片段DNADNA（1kb400 bp50bp50bp固定固定真空条件下80C烘烤2h 70C烘烤1h,无需真空条件；真空条件下80C烘烤2h70C烘烤1h,无需真空条件；或者温和的碱性条件或者254nm紫外照射；潮湿的膜暴露于1.6kJ/m2; 干燥的膜暴露于160kJ/ m2商业产品商业产品HybondNGeneScreenHybond-N+；Zeta-Probe；Nytran

4、+；Gene-Screen Plus 转膜过程示意图探针标记技术 1 标记物：放射性放射性和非放射性非放射性两种 放射性：3232P P，35S。 非放射性：生物素生物素、地高辛地高辛、荧光素。 2、标记方法 （1）切口平移法 ：最经典。 （2 2）随机引物法：最常用。）随机引物法：最常用。 （3）末端标记法。 （4）单链DNA探针标记。 （5）寡核苷酸探针标记法。 放射性探针的标记方法 1、切口平移法：目前已经很少使用。 2、随机引物法：DNA聚合酶可沿单链模板起始DNA的合成。如果寡核苷酸的序列是随机的寡核苷酸的序列是随机的，它们就可在模板的多位点上与模板杂交。因此模板上每一核苷酸的互补物

5、将以同样的频率掺入产物。用一种用一种 3232P P标记的标记的dNTPdNTP及其他三种非标记及其他三种非标记dNTPdNTP作为前体作为前体合成标记合成标记DNADNA, 可产生比活为5108-5 109dpm/g的探针。 Southern Blot操作要点 一般Southern杂交每一个电泳通道需要每一个电泳通道需要10-30g10-30g的的DNADNA。 为保证消化完全消化完全，一般用2-4U的酶消化1g 的DNA。消化的消化的DNADNA浓度不宜太高，以浓度不宜太高，以0.5g /l 0.5g /l 为好为好，加入反应体系的酶体积不能超过1/10，DNA样品一定要消化完全。如果需要

6、两种酶消化DNA，而两种酶的反应条件可以一致，则两种酶可同时进行消化；如果反应条件不一致，则先用需要低离子强度的酶消化，然后补加盐类等物质调高反应体系的离子强度，再加第二种酶进行消化。 标记后的探针可以直接使用或过柱纯化后使用。由于由于 - -3232P P的半的半衰期只有衰期只有1414天，所以标记好的探针应尽快使用天，所以标记好的探针应尽快使用。探针的比活性最好大于109计数/分/l。 鲑鱼精鲑鱼精DNADNA的作用是封闭的作用是封闭NCNC膜上没有膜上没有DNADNA转移的位点，降低杂交转移的位点，降低杂交背景、提高杂交特异性。背景、提高杂交特异性。Southern Blot操作要点 在

7、洗膜的过程中，不断振摇，不断用放射性检测仪探测膜上的放射强度。实践证明，当放射强度指示数值较环境背当放射强度指示数值较环境背景高景高1-21-2倍时，是洗膜的终止点。倍时，是洗膜的终止点。上述洗膜过程无论在哪一步达到终点，都必须停止洗膜。 根据信号强弱决定曝光时间，一般在曝光时间，一般在1-31-3天时间。天时间。洗片时，先洗一张先洗一张X X光片光片，若感光偏弱，则再多加两天曝光时间，再洗第二张片子再洗第二张片子。 影响影响SouthernSouthern杂交实验的因素很多杂交实验的因素很多，主要有：DNA纯度、酶切效率、电泳分离效果、转移效率、探针比活性和洗膜终止点等。 Southern

8、Blot注意事项 1. 要取得好的转移和杂交效果，应根据DNA 分子的大小，适当调整变性时间。对于分子量较大的对于分子量较大的DNADNA片段（大于片段（大于15kb15kb），），可在变性前用可在变性前用0.2M HCl0.2M HCl预处理预处理10 min 10 min 使其脱嘌呤。使其脱嘌呤。 2. 转移用的膜要预先在双蒸水中浸泡使其湿透，否则会影响转移用的膜要预先在双蒸水中浸泡使其湿透，否则会影响转膜效果；不可用手触摸膜转膜效果；不可用手触摸膜，否则影响DNA的转移及与膜的结合。 3. 转移时，注意膜与凝胶及滤纸间不能留有气泡膜与凝胶及滤纸间不能留有气泡，以免影响转移效果。 4. 注

9、意同位素的安全同位素的安全使用。 5.进行Southern 杂交的探针一般用放射性物质标记或用地高辛标记。放射性标记灵敏度高，效果好；地高辛标记没有半衰放射性标记灵敏度高，效果好；地高辛标记没有半衰期，安全性好。期，安全性好。Southern Blot常见问题分析 1、DNA太少太少，杂交的敏感度不够高； 2、DNA太多太多，酶切不完全，杂交条带不完全； 3、使用太高电压电泳太高电压电泳：胶熔化或电泳条带没有完全 分开； 4、预杂交时封闭不完全封闭不完全：背景高，出现无法解释的 结果； 5、洗膜不充分洗膜不充分：背景高，出现无法解释的结果； 6、过度洗膜过度洗膜：特异性结合的核酸条带被洗掉；一

10、张同位素放射自显影的一张同位素放射自显影的Southern blotSouthern blot照片照片 一张地高辛显色的一张地高辛显色的Southern blotSouthern blot照片照片Southern blot操作视频操作视频Northern Blot 原理：在变性条件下将待检的RNARNA样品样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同同Southern BlotSouthern Blot相同的原理相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。 用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNAmRNA）及其含）及其含量。量。 Northern Blot操作过程R

11、NARNA提取提取 甲醛变性电泳甲醛变性电泳 印迹转移 预杂交 杂交（变性探针） 洗膜 放射自显影或化学发光Northern blot操作注意事项 1.基本注意事项和Southern blot相似; 2.获得高质量的获得高质量的RNARNA是做好Northern blot的 关键; 3.操作过程要小心、仔细，防止防止RNARNA样品的降样品的降 解解。Northern blot操作视频操作视频Western Blot 原理原理： 将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质蛋白质转移到硝酸纤维素或PVDF膜上，然后与能特异性识别待检蛋白的抗体特异性识别待检蛋白的抗体进行反应，洗涤去除

12、没有结合的特异性抗体后，加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗体，反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体，加入适合标记物的检测试剂进行加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等显色或发光等，观察有无有无特异性蛋白条带的出现，也可通过条带的密度大小条带的密度大小来进行特异性蛋白的半定量半定量。 Western blot操作过程 SDS-PAGESDS-PAGE电泳电泳 转膜（转膜（PVDFPVDF或硝酸纤维素膜）或硝酸纤维素膜） 封闭封闭 一抗一抗 洗涤洗涤 酶标二抗反应酶标二抗反应 洗洗涤涤 显色或化学发光显影。显色或化学发光显影。 SDSPAGE电泳示意图电泳后转膜，然后用特定的

13、抗体来检测靶蛋白Western blot analysis of the cleavage of Caspase-3. IM9/Bcl-2 Cells were treated with 20 M of gossypol for 4, 8 and 16 h. After treatment, cells were harvested and lysed in lysis buffer. 50ug of protein was loaded in each lane and the expression of actin was detected as a loading controlHour

14、s 0 4 8 16Western Blot实验注意的问题 （1） 蛋白质电泳： 常用常用SDS-PAGESDS-PAGE：单一亚基组成的蛋白质 非变性PAGE：多个不同亚基组成的蛋白质 Tris-Tricine胶电泳：用于分子量小于10kDa的多肽和蛋白的电泳，能够获得较好的分离效果。聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套！聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套！Western Blot实验注意的问题 （2）转膜： 戴手套戴手套，避免用手接触滤纸、凝胶和膜，因为手上的油脂会阻断转印。滤纸和膜的尺寸与凝胶大小一致！滤纸和膜的尺寸与凝胶大小一致！ 以适量的、凝胶和膜1530 min，如果是PVD

15、F膜，必须先用甲醇激活后浸泡。 方向正确方向正确：凝胶在阴极，膜在阳极。 排去滤纸、胶和膜间的气泡。排去滤纸、胶和膜间的气泡。 电转时间电转时间：100V 1-2h100V 1-2h,可根据蛋白分子量的大小灵活选择。 转移结束后，凝胶用考马氏亮兰染色用考马氏亮兰染色以确定转移效率。 膜用丽春红染色观察蛋白分子量标准的位置膜用丽春红染色观察蛋白分子量标准的位置。Western Blot实验注意的问题 （3）封闭： 用5脱脂奶粉或3BSA。 （含（含0.10.1Tween20 TBSTween20 TBS或或PBSPBS配制）配制） 时间：室温2h或4C过夜Western Blot实验注意的问题（

16、4）显色或显影： 显色：辣根过氧化物酶：底物为DAB。碱性磷酸酶：底物为BCIP/NBT。 化学发光显影：化学发光显影：最常用。辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶有不同的发光底物（商品化产品）注意：注意：化学发光前将膜用不含化学发光前将膜用不含Tween20Tween20的的TBSTBS或或PBSPBS洗涤一次，洗涤一次， 曝光的时间和显影的时间根据实际情况而定。曝光的时间和显影的时间根据实际情况而定。Western Blot实验注意的问题 （5）膜的再利用： 化学发光后的硝酸纤维素膜化学发光后的硝酸纤维素膜用Stripping Buffer洗涤后（洗涤Buffer: 62.5mm pH6.7 的Tr

17、is-HCI含2SDS和100mm的 2ME ），用不同的一抗进行杂交，检测其它用不同的一抗进行杂交，检测其它蛋白的表达情况。一张膜可以重复使用蛋白的表达情况。一张膜可以重复使用3 34 4次次。碱性磷酸酶显色的膜不能再进行杂交。碱性磷酸酶显色的膜不能再进行杂交。Western blot操作视频操作视频ELISA 原理： ELISAELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。标记

18、的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。行定性或定量分析。测定方法具有很高的敏感度很高的敏感度（pg-ng/ml水平），并且重复性好重复性好。 ELISA ELI

19、SA 常用的酶和底物常用的酶和底物辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶，底物为OPD, 深桔黄色 ，检测波长492 nm； 底物为TMB， 蓝绿色， 检测波长450 nm。 碱性磷酸酶碱性磷酸酶，底物为PNPP（对消基苯磷酸酯）,黄色， 检测波长405 nm。 ELISA各步骤的反应时间： 包被包被：242436h36h，蛋白浓度为15 ug/ml。 封闭：封闭：37C 2h2h 或4C过夜夜（3BSA）。 样本反应时间样本反应时间：37C 45 min-1 h45 min-1 h。 酶标抗体反应时间酶标抗体反应时间： 37C 45 min-1 h45 min-1 h。 显色时间：15 min(15

20、min(避光）避光）。 实验要设对照。实验要设对照。 可以一次包被多块板，冻存备用。可以一次包被多块板，冻存备用。ELISA的类型1. 间接法测抗体：间接法是检测抗体常用的方法间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗抗体抗体，检测检测与固相抗原结合的受检抗体受检抗体，故称为间接法。常用于临床血清中自身抗体的检测临床血清中自身抗体的检测，以及杂交瘤上清特异性杂交瘤上清特异性抗体的筛选抗体的筛选。如血清中PDCD5自身抗体的检测。方法：方法： 抗原包被 封闭 待检抗体 洗涤 酶标二抗 洗涤 显色反应 终止反应 ELISA Reader检测 OD值。ELISA的类型 2. 双抗体夹心法测

21、抗原： 是检测抗原最常用的方法是检测抗原最常用的方法。只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物。 常用的组合：常用的组合：单克隆抗体多克隆抗体单克隆抗体多克隆抗体 单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体 后一组合是两种单克隆抗体针对抗原上不同的相距较远的两个抗原决定簇，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。 用途：用途：测定二价或二价以上的大分子抗原测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用但不适用 于测定半抗原及小分子单价抗原于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形 成两位点夹心。例如各种细胞因子的检测各种细胞因子的检测。ELISA的类型 3. 竞争法测抗原： (1

22、)(1)抗体固相测抗原：抗体固相测抗原：小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。愈浅。方法：方法：抗体包被 封闭 同时加入待测抗原和酶标抗原 洗涤 酶底物 显色 ELISA reader检 测。ELISA的类型 3. 竞争法测抗原： （2）抗原固相测抗原：其原理是标本中的抗原和固相抗原与一

23、定量的标记过的抗体竞争结合。其原理是标本中的抗原和固相抗原与一定量的标记过的抗体竞争结合。标本中抗原含量愈多，结合在固相上的抗体愈少，最后的显色也愈浅。标本中抗原含量愈多，结合在固相上的抗体愈少，最后的显色也愈浅。方法: a: 抗原包被96孔板； b:封闭; c: 待测抗原与抗体反应一定时间； d: 加入96孔板； e: 洗涤； f：加入酶标二抗； g：洗涤； h：显色和检测。如临床血清样本的检测以及细胞培养上清的检测。如临床血清样本的检测以及细胞培养上清的检测。ELISA的类型 4. IgM4. IgM抗体的检测抗体的检测: :(1)(1)间接法间接法： 间接法间接法ELISAELISA一般仅适用于检测总抗体或一般仅适用于检测总抗体或IgGIgG抗体。抗体。如用抗原包被的间接法直接测定血清中的IgM抗体，因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体，后者将竞争结合固相抗原而使一部分IgM抗体不能结合到固相上，将出现假阴性结果。 因此，如果用抗如果用抗IgMIgM作为二抗，间接测作为二抗，间接测定定IgMIgM抗体，必须先将标本用抗体，必须先将标本用A A蛋白或抗蛋白或抗IgGIgG抗体