全血胆碱脂酶测定

1、全血胆碱酯酶活性的测定全血胆碱酯酶活性的测定三氯化铁比色法三氯化铁比色法实验目的实验目的掌握全血掌握全血ChE活性测定的意义活性测定的意义掌握全血掌握全血ChE活性测定原理、方法活性测定原理、方法方方 法法Asch-DTNB比色法（比色法（GBZ52）三氯化铁比色法三氯化铁比色法溴麝香草酚蓝（溴麝香草酚蓝（BTB）比色法）比色法纸片法纸片法Biocheck法（便携式分析仪）法（便携式分析仪）三氯化铁比色法三氯化铁比色法原理原理乙酰胆碱乙酰胆碱胆碱酯酶胆碱酯酶胆碱胆碱+ +乙酸乙酸碱性羟胺碱性羟胺乙酰羟胺乙酰羟胺HClHClFeClFeCl3 3羟肟酸铁羟肟酸铁( (棕红色络合物棕红色络合物)

2、)三氯化铁比色法三氯化铁比色法原理原理血液中胆碱酯酶可使乙酰胆碱水解生成胆碱和乙酸，终止反应后，剩余的乙酰胆碱与碱性羟胺作用生成乙酰羟胺，然后在酸性环境中与三氯化铁反应生成棕红色羟肟酸铁络合物。其颜色深浅与乙酰胆碱的量成正比，在520nm进行比色定量，从而推算出胆碱脂酶活性。 实验器材一次性注射器一次性注射器(1ml) 12个，采血用；个，采血用；微量移液器（微量移液器（20l）；分光光度计；）；分光光度计；玻璃比色杯玻璃比色杯(每组至少每组至少3个个)；擦镜纸；擦镜纸；恒温水浴箱（恒温水浴箱（370.5 ）移液管移液管(0.2ml，1ml，5ml)；试管；漏斗；容量瓶试管；漏斗；容量瓶 试剂

3、试剂均为分析纯，水为蒸镏水或去离子水。试剂均为分析纯，水为蒸镏水或去离子水。 1磷酸盐缓冲溶液，磷酸盐缓冲溶液，pH=7.2 准确称取磷准确称取磷酸氢二钠酸氢二钠(Na2HP0412H2O)16.72g和磷酸二氢钾和磷酸二氢钾(KH2PO4)2.72g，用水溶解并稀释到，用水溶解并稀释到1000ml，置置4冰箱中保存。冰箱中保存。 2碱性羟胺溶液碱性羟胺溶液 临用时将临用时将139 g/L的盐酸的盐酸羟胺溶液与羟胺溶液与140 g/L的氢氧化钠溶液等体积混的氢氧化钠溶液等体积混合。合。 3盐酸溶液盐酸溶液1+2 浓盐酸浓盐酸l份加水份加水2份混合。份混合。 试剂 4三氯化铁溶液三氯化铁溶液 (

4、100 g/L) 称取称取10g三氯化三氯化铁铁(FeCl36 H2O )，加浓盐酸，加浓盐酸0.84ml，溶解后再，溶解后再加水至加水至100ml，贮存于棕色瓶中。，贮存于棕色瓶中。 5氯化乙酰胆碱标准溶液氯化乙酰胆碱标准溶液 (1)标准贮备液：精确称取氯化乙酰胆碱标准贮备液：精确称取氯化乙酰胆碱1.2716g，用，用pH=7.2的磷酸盐缓冲液溶解并稀的磷酸盐缓冲液溶解并稀释至释至100ml。此溶液。此溶液1ml含含70 mol乙酰胆碱。乙酰胆碱。置置4冰箱内保存。冰箱内保存。 (2)标准应用液：取标准贮备液用磷酸盐缓标准应用液：取标准贮备液用磷酸盐缓冲液稀释冲液稀释10倍。此液倍。此液1m

5、l含含7 mol乙酰胆碱，乙酰胆碱，于临用前配制。于临用前配制。分析步骤分析步骤1. 乙酰胆碱标准曲线的绘制乙酰胆碱标准曲线的绘制 2. 样品测定样品测定1.乙酰胆碱标准曲线的绘制乙酰胆碱标准曲线的绘制（1）取六只）取六只具塞具塞试管，配制不同浓度的乙酰胆碱溶液试管，配制不同浓度的乙酰胆碱溶液管号管号123456乙酰胆碱标准应乙酰胆碱标准应用液（用液（ml）00.20.40.60.81.0磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液（ml）21.81.61.41.21.0乙酰胆碱含量乙酰胆碱含量（mol）01.42.84.25.67.0（2）各管加碱性羟胺）各管加碱性羟胺4ml，立即振摇，立即振摇2 min（3）

6、各管加）各管加1 2盐酸溶液盐酸溶液2ml，振摇，振摇2 min（4）各管加）各管加10%三氯化铁溶液三氯化铁溶液2ml，摇匀，过滤，摇匀，过滤（5）测吸光度）测吸光度:=520nm，参比管，参比管-第第1管管（6）绘制标准曲线）绘制标准曲线2.样品测定样品测定A管（样品管）管（样品管）B管（对照管）管（对照管）0.98ml 磷酸缓冲液磷酸缓冲液0.98ml 磷酸缓冲液磷酸缓冲液20 l 血血20 l 血血37水浴水浴 5min碱性羟胺碱性羟胺4ml, 振振3min乙酰胆碱标准应用液乙酰胆碱标准应用液1ml乙酰胆碱标准应用液乙酰胆碱标准应用液1ml37水浴水浴 30min（准确计时）（准确计时

7、）碱性羟胺碱性羟胺4ml,振振3min 1 2盐酸溶液盐酸溶液2ml, 摇摇1min 10%三氯化铁溶液三氯化铁溶液2ml 摇匀、过滤、比色摇匀、过滤、比色计计 算算1.被水解被水解 的乙酰胆碱吸光度的乙酰胆碱吸光度= 对照管吸光度（对照管吸光度（B管）管） 样品管吸光度（样品管吸光度（A管）管）2.对照标准曲线，得出被水解的乙酰胆碱对照标准曲线，得出被水解的乙酰胆碱( mol ) -即即0.02ml血经血经37 ，30min反应条件下的反应条件下的 胆碱酯酶胆碱酯酶活性绝对值活性绝对值C C3.胆碱酯酶胆碱酯酶活性相对值（活性相对值（% %）浙江地区健康人浙江地区健康人胆碱酯酶活性绝对值胆碱酯酶活性绝对值男：男：3.22 3.22 0.336 0.336 mol 女：女：3.19 3.19 0.398 0.398 mol 100值健康人碱酯酶活性绝对值样品胆碱酯酶活性绝对注意事项注意事项采血前先准备好试管，加入采血前先准备好试管，加入磷缓磷缓采血时严格采血时严格消毒消毒，用过的棉球、刺针集，用过的棉球、刺针集中放置中放置准确控制水浴准确控制水浴温