细胞和显微技术学实验ppt课件

1、细胞与显微技术学实验细胞与显微技术学实验河南师范大学河南师范大学生命科学实验教学中心生命科学实验教学中心实验一实验一特殊显微镜的运用及其察看特殊显微镜的运用及其察看模块一、细胞的形状构造模块一、细胞的形状构造察看与各种显微镜技术察看与各种显微镜技术一、实验目的：一、实验目的：1了解暗视野显微镜、相差显微镜任务了解暗视野显微镜、相差显微镜任务原理原理2掌握视野显微镜、相差显微镜和运用掌握视野显微镜、相差显微镜和运用方法。方法。 二、实验用品二、实验用品 和实验资料和实验资料 暗视野显微镜、倒置显微镜、相差显微暗视野显微镜、倒置显微镜、相差显微镜、黑纸片、剪刀、圆规、镜油、镜、黑纸片、剪刀、圆规、

2、镜油、 口腔黏膜口腔黏膜上皮细胞、活细胞暂时装片。上皮细胞、活细胞暂时装片。三、实验原理与方法三、实验原理与方法 1、暗视野显微镜、暗视野显微镜 1.1 原理和构造特点原理和构造特点 普通光学显微镜的的照明光线直接进入视普通光学显微镜的的照明光线直接进入视野，视野亮堂野，视野亮堂,活细胞不经染色很难看清细胞活细胞不经染色很难看清细胞内部构造。而暗视野显微镜那么利用特殊的聚内部构造。而暗视野显微镜那么利用特殊的聚光器实现斜射照明，给样品照明的光不直接穿光器实现斜射照明，给样品照明的光不直接穿过物镜，而是由样品反射或折射后再进入物镜过物镜，而是由样品反射或折射后再进入物镜图图 2-9，因此，整个视

3、野是暗的，而样品，因此，整个视野是暗的，而样品是亮堂的。在暗视野显微镜中由于样品与背景是亮堂的。在暗视野显微镜中由于样品与背景之间的反差增大，可以明晰地察看到在明视野之间的反差增大，可以明晰地察看到在明视野显微镜中不易看清的活菌体等透明的微小颗粒。显微镜中不易看清的活菌体等透明的微小颗粒。暗视野法主要用于察看活细胞。暗视野法主要用于察看活细胞。 1.2 制造中央遮光板制造中央遮光板 普通显微镜只需聚光器是可以装配的，支架的普通显微镜只需聚光器是可以装配的，支架的口径适于安装暗视野聚光器，即可改装成暗视野显口径适于安装暗视野聚光器，即可改装成暗视野显微镜。在无暗视野聚光器时，可用厚黑纸片制造一微

4、镜。在无暗视野聚光器时，可用厚黑纸片制造一个中央遮光板，放在普通显微镜的聚光器下方的滤个中央遮光板，放在普通显微镜的聚光器下方的滤光片框上，也能得到暗视野效果。光片框上，也能得到暗视野效果。保管好各自制造的中央遮光板，以便在后面的实验保管好各自制造的中央遮光板，以便在后面的实验中运用。中运用。 1.3 运用方法运用方法 1把暗视野聚光器装在显微镜的聚光器支架上。把暗视野聚光器装在显微镜的聚光器支架上。 2选用强的光源，但又要防止直射光线进入物镜，所以普通选用强的光源，但又要防止直射光线进入物镜，所以普通用显微镜灯照明。用显微镜灯照明。 3在聚光器和标本片之间要加一滴香柏油，目的是不使照明在聚光

5、器和标本片之间要加一滴香柏油，目的是不使照明光线于聚光镜上面进展全反射，达不到被检物体，而得不到暗光线于聚光镜上面进展全反射，达不到被检物体，而得不到暗视野照明。视野照明。 4升降集光器，将集光镜的焦点对准被检物体，即以圆锥光升降集光器，将集光镜的焦点对准被检物体，即以圆锥光束的顶点照射被检物。假设聚光器能程度挪动并附有中心调理束的顶点照射被检物。假设聚光器能程度挪动并附有中心调理安装，那么应首先进展中心调理，使聚光器的光轴与显微镜的安装，那么应首先进展中心调理，使聚光器的光轴与显微镜的光轴严厉位于不断线上。光轴严厉位于不断线上。 4升降集光器，将集光镜的焦点对准被检物体，即以圆锥升降集光器，

6、将集光镜的焦点对准被检物体，即以圆锥光束的顶点照射被检物。假设聚光器能程度挪动并附有中心光束的顶点照射被检物。假设聚光器能程度挪动并附有中心调理安装，那么应首先进展中心调理，使聚光器的光轴与显调理安装，那么应首先进展中心调理，使聚光器的光轴与显微镜的光轴严厉位于不断线上。微镜的光轴严厉位于不断线上。 5选用与聚光器相应的物镜，调理焦距选用与聚光器相应的物镜，调理焦距(操作方法与普通操作方法与普通显微镜一样显微镜一样)，找到所需察看的物像。，找到所需察看的物像。 四察看四察看 察看示教台上暗视野显微镜下的活细胞。在黑暗察看示教台上暗视野显微镜下的活细胞。在黑暗的背景里，可见细胞、细胞核和细胞器的

7、衍射光图像。的背景里，可见细胞、细胞核和细胞器的衍射光图像。2、相差显微镜、相差显微镜 2.1 原理和构造特点原理和构造特点 光波有振幅亮度、波长颜色及相位光波有振幅亮度、波长颜色及相位(指在某一时指在某一时间上光的动摇所能到达的位置间上光的动摇所能到达的位置)的不同。当光经过物体时，如的不同。当光经过物体时，如波长和振幅发生变化，人们的眼睛才干察看到，这就是普通波长和振幅发生变化，人们的眼睛才干察看到，这就是普通显微镜下可以察看到染色标本的道理。而活细胞和未经染色显微镜下可以察看到染色标本的道理。而活细胞和未经染色的生物标本，因细胞各部微细构造的折射率和厚度略有不同，的生物标本，因细胞各部微

8、细构造的折射率和厚度略有不同，光波经过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位有变化光波经过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位有变化(相应相应发生的差别即相差发生的差别即相差)，而这种微小的变化，人眼是无法加以鉴，而这种微小的变化，人眼是无法加以鉴别的，故在普通显微镜下难以察看到。相差显微镜可以改动别的，故在普通显微镜下难以察看到。相差显微镜可以改动直射光或衍射光的相位，并且利用光的衍射和干涉景象，把直射光或衍射光的相位，并且利用光的衍射和干涉景象，把相差变成振幅差相差变成振幅差(明暗差明暗差)，同时它还吸收部分直射光线，以增，同时它还吸收部分直射光线，以增大其明暗的反差。因此可用以察看活细胞或未染

9、色标本。大其明暗的反差。因此可用以察看活细胞或未染色标本。相差显微镜相差显微镜(图图23)与普通显微镜的主要不同之处是：用环与普通显微镜的主要不同之处是：用环状光阑替代可变光阑，用带相板的物镜状光阑替代可变光阑，用带相板的物镜(通常标有通常标有PH的标志的标志)替代普通物镜，并带有一个合轴用的望远镜。环状光阑是由替代普通物镜，并带有一个合轴用的望远镜。环状光阑是由大小不同的环状孔构成的光阑，它们的直径和孔宽是与不同大小不同的环状孔构成的光阑，它们的直径和孔宽是与不同的物镜相匹配的。其作用是将直射光所构成的像从一些衍射的物镜相匹配的。其作用是将直射光所构成的像从一些衍射旁像中分出来。相板安装在物

10、镜的后焦面处，相板装有吸收旁像中分出来。相板安装在物镜的后焦面处，相板装有吸收光线的吸收膜和推迟相位的相位膜。它除能推迟直射光线或光线的吸收膜和推迟相位的相位膜。它除能推迟直射光线或衍射光的相位以外，还有吸收光使亮度发生变化的作用。调衍射光的相位以外，还有吸收光使亮度发生变化的作用。调轴望远镜是用来进展合铀调理的。相差显微镜在运用时，聚轴望远镜是用来进展合铀调理的。相差显微镜在运用时，聚光镜下面环光镜下面环f状光阑的中心与物镜光轴要完全在不断线上，状光阑的中心与物镜光轴要完全在不断线上，必需调理光阑的亮环和相板的环状圈重合对齐，才干发扬相必需调理光阑的亮环和相板的环状圈重合对齐，才干发扬相差显

11、微镜的效能。否那么直射光或衍射光的光路紊乱，应被差显微镜的效能。否那么直射光或衍射光的光路紊乱，应被吸收的光不能吸收，该推迟相位的光波不能推迟，就失去了吸收的光不能吸收，该推迟相位的光波不能推迟，就失去了相差显微镜的作用。相差显微镜的作用。 相差显微镜的光路相差显微镜的光路2.2 运用方法运用方法 相差安装为多功能系列显微镜中的附属装相差安装为多功能系列显微镜中的附属装 置与普通显微镜配合运用。置与普通显微镜配合运用。1相差安装的互换安装相差安装的互换安装 卸下普通显微镜运用的聚光器，将卸下普通显微镜运用的聚光器，将环状光阑装在聚光器支架上，把绿色滤光片放在上面，它可环状光阑装在聚光器支架上，

12、把绿色滤光片放在上面，它可吸收红色和蓝色光，使波长范围小的单色光线进展照明，并吸收红色和蓝色光，使波长范围小的单色光线进展照明，并有吸热作用，能使相差察看获得良好的效果。再从转换器上有吸热作用，能使相差察看获得良好的效果。再从转换器上旋下普通物镜，换上相差物镜。旋下普通物镜，换上相差物镜。 2调焦调焦 翻开光源，旋转集光器转盘，将翻开光源，旋转集光器转盘，将“o对准标示孔，对准标示孔，使普通聚光器部分进入光路。先运用低倍相差物镜，按普通使普通聚光器部分进入光路。先运用低倍相差物镜，按普通显微镜操作方法进展对光和调焦。显微镜操作方法进展对光和调焦。 旋转环状光阑，使光阑的旋转环状光阑，使光阑的直

13、径和孔宽与所运用的相差物镜相顺应，如相差物镜为直径和孔宽与所运用的相差物镜相顺应，如相差物镜为40 x时运用时运用x40标示孔的光阑。标示孔的光阑。 3合铀调整合铀调整 拔出目镜，插入合铀望远镜，一边从望远镜内内拔出目镜，插入合铀望远镜，一边从望远镜内内察看，并用左手固定其外筒；一边用右手转动望远镜内筒使其下察看，并用左手固定其外筒；一边用右手转动望远镜内筒使其下降，当对准焦点就能看到环状光阑的亮环和相板的黑环，此时可降，当对准焦点就能看到环状光阑的亮环和相板的黑环，此时可将望远镜固定住。再升降集光器并调理其下的螺旋使亮环的大小将望远镜固定住。再升降集光器并调理其下的螺旋使亮环的大小与黑环一致

14、，然后左右前后调理环状光阑聚光器上的调理钮，使与黑环一致，然后左右前后调理环状光阑聚光器上的调理钮，使两环完全重合。合抽调整终了，抽出望远镜，换回目镜，按常规两环完全重合。合抽调整终了，抽出望远镜，换回目镜，按常规要领进展察看。在改换不同倍率的相差物镜时，每一次都要运用要领进展察看。在改换不同倍率的相差物镜时，每一次都要运用相匹配的环状光阑和重新合抽调整。相匹配的环状光阑和重新合抽调整。 2.3 察看察看 在相差显微镜下察看活细胞，可清楚地分辨细胞的形在相差显微镜下察看活细胞，可清楚地分辨细胞的形状，细胞核、核仁以及胞质中存在的颗粒状构造。状，细胞核、核仁以及胞质中存在的颗粒状构造。四、实验结

15、果四、实验结果 五、实验报告五、实验报告1 1为什么暗视野显微镜不可以提高分辨率？为什么暗视野显微镜不可以提高分辨率？2 2为什么说倒置相差显微镜是察看培育活为什么说倒置相差显微镜是察看培育活细胞的最有效显细胞的最有效显 微镜微镜? ? 3 3绘出绘出3 34 4个相差显微镜下口腔粘膜细胞个相差显微镜下口腔粘膜细胞图。图。 六、六、 本卷须知本卷须知1 1视场光阑与聚光器的孔径光阑必需全视场光阑与聚光器的孔径光阑必需全部开大，而且光源要强。因环状光阑遮掉大部开大，而且光源要强。因环状光阑遮掉大部分光，物镜相板上共轭面又吸收大部分光。部分光，物镜相板上共轭面又吸收大部分光。2 2不同型号的光学部

16、件不能互换运用。不同型号的光学部件不能互换运用。3 3载玻片、盖玻片的厚度应遵照规范，载玻片、盖玻片的厚度应遵照规范，不能过薄或过厚。不能过薄或过厚。 实验二实验二荧光显微镜的运用及其察看荧光显微镜的运用及其察看模块一、细胞的形状构造模块一、细胞的形状构造察看与各种显微镜技术察看与各种显微镜技术一、实验目的一、实验目的了解荧光显微镜的构造、原理及运用方法。了解荧光显微镜的构造、原理及运用方法。 二、荧光显微镜的原理：二、荧光显微镜的原理： 一些物质在遭到人眼所看不到的高能紫外一些物质在遭到人眼所看不到的高能紫外线激发照射时，会产生比原激发波长较长的可线激发照射时，会产生比原激发波长较长的可见光

17、。人们把这种光叫做荧光。这种景象叫做见光。人们把这种光叫做荧光。这种景象叫做荧光景象。有两种荧光景象：一种是受激发光荧光景象。有两种荧光景象：一种是受激发光照射时，物质本身能发荧光，叫做自体荧光。照射时，物质本身能发荧光，叫做自体荧光。另一种是物质要先经过荧光色素染色，才会产另一种是物质要先经过荧光色素染色，才会产生荧光景象。这后一种被称为继发荧光，在生生荧光景象。这后一种被称为继发荧光，在生物学中大部分的丈量都是继发荧光。不同的荧物学中大部分的丈量都是继发荧光。不同的荧光物质所需求的激发光的波长不尽一样。而且光物质所需求的激发光的波长不尽一样。而且受激后所产生的荧光光波也不一样。受激后所产生

18、的荧光光波也不一样。 用荧光显微镜，可以察看到普通显微镜看不见的无色用荧光显微镜，可以察看到普通显微镜看不见的无色透明的组织或细胞。普通是先将这些标本用荧光色素染色，透明的组织或细胞。普通是先将这些标本用荧光色素染色，再将标本放在荧光显微镜下，用紫外光线照射激发，使标再将标本放在荧光显微镜下，用紫外光线照射激发，使标本发出荧光可见光然后经过显微镜，察看标本的荧光本发出荧光可见光然后经过显微镜，察看标本的荧光图象。由此可见，荧光显微镜的光源不是作为照明用的，图象。由此可见，荧光显微镜的光源不是作为照明用的，而是作为激发光，去激发荧光色素产生荧光。而是作为激发光，去激发荧光色素产生荧光。 三、实验

19、资料：三、实验资料： 洋葱内表皮细胞、大葱叶肉细胞洋葱内表皮细胞、大葱叶肉细胞四、实验方法：四、实验方法： 1、自发荧光：、自发荧光：1取大葱叶肉细胞于载片取大葱叶肉细胞于载片2加生理盐水一滴加生理盐水一滴3加盖玻片，吸去多余水分加盖玻片，吸去多余水分4察看察看 2、激发荧光：、激发荧光：1取洋葱内表皮细胞于载取洋葱内表皮细胞于载片片2加一滴溴化乙锭加一滴溴化乙锭1：1000，染，染1015分钟分钟3吸去染液，加生理盐水一滴吸去染液，加生理盐水一滴4加盖玻片，吸去多余水分，察看加盖玻片，吸去多余水分，察看五、实验报告：五、实验报告：1 1、表达荧光显微镜与普通光学显微镜的区别、表达荧光显微镜与

20、普通光学显微镜的区别 ？ 2 2、绘图示荧光显微镜下大葱叶肉细胞和洋葱内、绘图示荧光显微镜下大葱叶肉细胞和洋葱内表皮细胞。表皮细胞。 高倍镜下叶绿体和线粒体六、本卷须知：六、本卷须知： 1 1、 荧光显微镜的运用和自我维护。荧光显微镜的运用和自我维护。 2 2、 凡凡DNADNA特异性染料均有较强的致癌性，特异性染料均有较强的致癌性，不与皮肤不与皮肤 直接接触。万一染液接触皮肤，须立直接接触。万一染液接触皮肤，须立刻用清水洗刻用清水洗 干净。干净。 3 3、 实验台的清理。实验台的清理。实验三实验三DNA的的Feulgen染色法染色法模块二、细胞化学技模块二、细胞化学技术与免疫荧光染色术与免疫

21、荧光染色一、实验目的 掌握掌握Feulgen反响的根本原理反响的根本原理二、实验资料 小鼠的肝细胞小鼠的肝细胞 了解了解DNA在细胞内的分布在细胞内的分布三、实验原理Feulgen反响的根本原理： 稀HCl水解DNA，破坏嘌呤和脱氧核糖间的配糖键，并在脱氧核糖C1端构成游离的醛基，醛基和Schiff试剂结合，构成紫红色的化合物。因此在有DNA的部位，就会呈现除紫红色阳性反响。四、实验步骤取固定的小鼠肝细胞，涂片，取固定的小鼠肝细胞，涂片，450C450C烘烤烘烤30min;30min;复水复水1min1min；冷冷1 mol/L 1 mol/L 盐酸盐酸(40C )(40C )过一下过一下;

22、;1 mol/L 1 mol/L 盐酸盐酸 600C 600C 水解水解8-10 min;8-10 min;蒸馏水稍洗；蒸馏水稍洗；置置SchiffSchiff试剂中室温染色试剂中室温染色30min30min左右；左右；分色漂洗，亚硫酸盐溶液洗分色漂洗，亚硫酸盐溶液洗3 3次，总时间为次，总时间为6 min;6 min;自来水冲洗自来水冲洗1min1min；显微镜察看。显微镜察看。五、总结与思索 简述简述Feulgen反响的原理。反响的原理。 本实验的关键步骤及本卷须知。本实验的关键步骤及本卷须知。 比较各种方法显示细胞核的异同。比较各种方法显示细胞核的异同。实验四实验四高碘酸高碘酸-希夫反响

23、希夫反响PAS反响反响模块二、细胞化学技模块二、细胞化学技术与免疫荧光染色术与免疫荧光染色一、实验目的 掌握掌握PAS反响的根本原理反响的根本原理二、实验资料 小鼠的肝细胞小鼠的肝细胞 了解糖类在细胞内的分布了解糖类在细胞内的分布三、实验原理PAS反响的根本原理：反响的根本原理： 利用强氧化剂使多糖产利用强氧化剂使多糖产生游离的醛基，醛基和生游离的醛基，醛基和Schiff试剂结合，构成紫红试剂结合，构成紫红色的化合物。因此在有多色的化合物。因此在有多糖的部位，就会呈现除紫糖的部位，就会呈现除紫红色阳性反响。红色阳性反响。四、实验步骤取固定的小鼠肝细胞，涂片，取固定的小鼠肝细胞，涂片，450C4

24、50C烘烤烘烤30min30min；复水复水1min1min；氧化，入氧化，入 Lillies Lillies 氧化剂氧化氧化剂氧化10 min10 min；水洗，流水洗水洗，流水洗10 min10 min；蒸馏水稍洗；蒸馏水稍洗；置置SchiffSchiff试剂中室温染色试剂中室温染色30min30min左右；左右；分色漂洗，亚硫酸盐溶液洗分色漂洗，亚硫酸盐溶液洗3 3次，总时间为次，总时间为3 min;3 min;自来水冲洗自来水冲洗1min1min；显微镜察看。显微镜察看。五、总结与思索 简述简述PAS反响的原理及意义。反响的原理及意义。 本实验的关键步骤及本卷须知。本实验的关键步骤及本

25、卷须知。 画出糖类在细胞中的分布。画出糖类在细胞中的分布。实验五实验五 RNA显示方法与制片技术显示方法与制片技术模块二、细胞化学技模块二、细胞化学技术与免疫荧光染色术与免疫荧光染色一、实验目的：一、实验目的： 学会显示学会显示RNARNA的细胞化学方法，了解的细胞化学方法，了解RNARNA在细在细胞内分布。胞内分布。 二、实验原理：二、实验原理： 甲基绿甲基绿哌洛宁对哌洛宁对DNADNA和和RNARNA有选择性有选择性的染色效果。碱性的甲基绿的染色效果。碱性的甲基绿- -哌洛宁混合染料哌洛宁混合染料处置细胞后，由于处置细胞后，由于DNADNA、RNARNA对染料具有的亲和对染料具有的亲和力不

26、同，力不同， 而使这两种染料对两类核酸具有了而使这两种染料对两类核酸具有了选择性。选择性。 DNA DNA被甲基绿染成绿色，被甲基绿染成绿色，RNARNA被哌洛被哌洛宁染成红色，宁染成红色， 这样就能使细胞中两种核酸分这样就能使细胞中两种核酸分布显示出来。布显示出来。 三、器材与试剂三、器材与试剂 1、 器材：显微镜、载玻片、盖玻片、烧片、培器材：显微镜、载玻片、盖玻片、烧片、培育皿、吸管、镊子、刀片或切片机、分液漏斗育皿、吸管、镊子、刀片或切片机、分液漏斗等等.2、Unna试剂：试剂： 1) 甲基绿的精制：先配制甲基绿的精制：先配制2甲基绿水溶液，甲基绿水溶液，置于分液漏斗置于分液漏斗 中中 ，然后加氯仿洗涤数次，然后加氯仿洗涤数次，弃除氯仿，反复多次直至氯仿层中不显紫色，弃除氯仿，反复多次直至氯仿层中不显紫色，水层备用。水层备用。 2派罗宁的精制：先配制派罗宁的精制：先配制5水溶液，置于分水溶液，置于分液漏斗中，用液漏斗中，用 氯仿洗涤数次，待氯仿不显红色为止，弃除氯仿洗涤数次，待氯仿不显红色为止，弃除氯仿水层备用。氯仿水层备用。 3) 0.2mol/L醋酸缓冲液，醋酸缓冲液，pH4.8 (0.2mol/L醋酸醋酸 40ml+0.2mol/L醋酸醋酸60ml)。 4) 甲基绿甲基绿派罗宁溶液：派罗宁溶液：1ml2甲基绿水溶甲基绿水