失巢凋亡与中医药抗肿瘤研究进展

1、失巢凋亡与中医药抗肿瘤研究进展*通讯作者简介：沈克平，男，主任医师，硕士生导师，主要从事消化道肿瘤研究。地址：上海市宛平南路725号，龙华医院肿瘤五科 邮编200032 电话153 E-mail：沈克平，刘威，胡兵（上海中医药大学附属龙华医院肿瘤五科， 200032)摘要：失巢凋亡是细胞脱离胞外基质或与胞外基质不结合而发生的一种凋亡。失巢凋亡耐受是转移细胞的基本特性，可使肿瘤细胞在脱离与基质粘附状态时仍能存活。细胞失巢凋亡主要有死亡受体途径及线粒体途径。参与失巢凋亡的信号转导通路主要有磷脂酰肌醇3激酶AKT（PI3-k/AKT）通路和丝裂原活化蛋白激酶（MPAK）通

2、路。近期发现癌基因 TrkB、抑癌基因PTEN也参与失巢凋亡调控。目前研究发现部分中药抗肿瘤的作用机制之一是抑制肿瘤细胞锚着不依赖性增殖，促进肿瘤细胞失巢凋亡。关键词： 失巢凋亡；肿瘤转移；信号转导；中医药基金资助：国家自然科学基金（30873258），上海市浦东新区中医领军型人才项目（PWZ2008-20-104）Anoikis and anti-cancer effects of Chinese herbsShen-keping, Liu-wei, Hu-bing5th Department of Oncology, Longhua Hospital, Shanghai Universit

3、y of Traditional Chinese Medicine,Abstract: Anoikis is a form of apoptosis induced by detachment of adherent cells from the extracellular matrix or inappropriate cell-matrix interactions. Resistance to anoikis is a hallmark of metastatic cancer cells which leads to cancer cells evading anoikis and t

4、hereby survive after detachment from their primary site, and metastasizing to distant organs. Both death receptor-mediated extrinsic pathway and mitochondrial-mediated intrinsic pathway contribute to anoikis. Phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt signal pathway and mitogen-activated protein kinas

5、e (MAPK) signal are major regulator of anoikis. In addition, oncogene TrkB and tumor suppressor gene PTEN may also contribute to anoikis regulation. Some studies suggested some anti-cancer Chinese herbs or components may inhibit anchoring-independent cancer cell growth and induces anoikis. Key words

6、: Anoikis, metastasis, signal transduction, Chinese herbProject supported by the National Natural Science Foundation of China (30873258) andTCM Leading Talents Project of Shanghai Pu-dong New Area(PWZ2008-20-104)细胞凋亡（Apoptosis）是机体生长、分化、发育及病理过程中，由细胞基因调控的自发死亡过程，又称程序性细胞死亡（programmed cell death）。正常上皮或内皮

7、细胞具有粘附依赖性，其存活依赖于细胞间和细胞与基质间的信号传递，即锚定依赖，一旦脱离细胞基质粘附，失去胞间联系即发生凋亡，这种形式的细胞死亡被命名为“anoikis”，中文译为“失巢凋亡”1。失巢凋亡具有重要的生理意义，细胞脱离基质粘附状态发生失巢凋亡，对机体发育和组织自身平衡起重要作用。失巢凋亡耐受或抑制与恶性肿瘤细胞转移和存活密切相关2。本文就失巢凋亡的分子机制，涉及的主要细胞信号转导通路及中药对肿瘤细胞失巢凋亡的影响阐述如下。1 .失巢凋亡分子机制1.1死亡受体途径失巢凋亡一部分是通过细胞死亡受体途径激活半胱氨酸蛋白酶调节的3-5。在死亡受体途径当中，细胞外配体（如Fas-L、TRAIL

8、等）结合导致死亡受体（如FAS、TRAIL-R等）寡聚化，活化FAS相关死亡域蛋白（FAS-Associated Death Domain，FADD），进而募集caspase-8形成死亡信号诱导复合物（death inducing signalling complex，DISC），活化caspase-8可激活caspase-3、caspase-7等凋亡执行蛋白，导致细胞凋亡6。死亡受体途径也可为非受体依赖型，Stupack等7研究表明非结合的整合素可以介导caspase-8外膜活化而非受体依赖。与正常细胞相比，恶性肿瘤细胞在脱离细胞质基质后尽管能够上调FAS及配体，但却不能活化caspase激

9、活死亡受体途径，并可能与上调内源性的caspase-8抑制剂FLIP(FADD-like interleukin-1 beta-converting enzyme-inhibitory protein)相关。1.2 线粒体途径线粒体途径激活caspase也是另一个主要的细胞死亡路径，它在失巢凋亡/抵抗过程中也起着重要作用。该途径是由线粒体损伤开始的，接着会释放细胞色素C，与促使凋亡蛋白活化因子（Apaf-1）和caspase-9形成凋亡复合体(apoptosome) 活化caspase-9，活化的caspase-9进而激活caspase-3等凋亡执行蛋白引发细胞凋亡8。细胞凋亡受Bcl-2家族

10、的促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白调控，Bcl-2家族蛋白分为三个亚家族，第一个亚家族包括Bcl-2，Bcl-XL,和Bcl-w，可以介导抗凋亡；剩余两个亚家族在自然状态下则是促细胞凋亡的，主要包括Bax、Bak、Box及Bim、Bid。Bak或Bax的活化都是细胞凋亡内源性通路的起始因素9；Bax和Bak以单体形式存在于胞浆，当接受死亡信号时Bax发生构象上的变化，插入线粒体外膜形成小孔，透明化的线粒体外膜则会允许细胞色素C等因子的释放。在凋亡过程当中，促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白能异二聚体化，影响相互的功能，二者之间的平衡状态决定细胞对凋亡的敏感性10。研究发现肠内皮细胞发生失巢凋亡与Bcl-XL下调有关

11、，Ras转染可使Bax降低和Bcl-XL下调失败，使细胞不能释放Omi/HtrA2，从而耐受失巢凋亡11。2. 失巢凋亡信号转导 肿瘤细胞失巢凋亡受磷脂酰肌醇3激酶- AKT (phosphatidylinositol 3-kinases，PI3K/AKT)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen -activated protein kinase，MAPK) 信号转导通路的调控。2.1 PI3-KAKT信号通路PI3K是一个复杂的大家族，根据其结构可分为3类：I、型，型PI3K又分为IA和IB两个亚型，PI3K上游受受体酪氨酸激酶和Ras蛋白等调控12， PI3K可将PI(4)P和PI(4,5)

12、P磷酸化生成PI(3,4)P2和PI(3,4,5)P3，并依赖它们向下游传递信号，PKB是PI3K通路下游主要信号转导分子；PKB是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，与PKA、PKC同源，由病毒癌基因v-akt对应的原癌基因c-akt编码，亦称Akt；激活的PKB能使促凋亡蛋白BAD和caspase-9磷酸化而失活，有抗失巢凋亡作用13。胰岛素和胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor1，IGF1）是AKt的主要激活剂，IGFs能够保护血清饥饿鼠成纤维肝细胞和人乳腺癌细胞MDA-436A免于失巢凋亡 14。2.2 MAPK信号通路丝裂原活化的蛋白激酶(MAPK)是一组可被

13、多种信号激活的丝苏氨酸激酶，MAPK家族包括p38 MAPK、ERK5、ERK 以及JNK4个亚族，可参与细胞的多种生物活性，如调节基因转录、诱导细胞凋亡、调节细胞周期等。p38 MAPK、JNK、ERK三条通路与肿瘤细胞凋亡关系密切。在肿瘤细胞中，活化的p38可增强c- myc表达、磷酸化p53、参与Fas Fasl及线粒体途径介导的凋亡15。JNK信号转导通路参与多种凋亡反应，研究表明JNK通路介导肿瘤细胞凋亡的机制是通过磷酸化Bcl-2和Bcl - xL，促进线粒体释放细胞色素 C，激活Caspase 级联反应，导致细胞凋亡16。ERK通路是目前研究的最为透彻的MAPK通路，其激酶可被依

14、赖于高浓度钙离子的Ras激活，而其靶基因就包括c-myc 等， ERK诱导肿瘤细胞凋亡的机制还包括：下调Bc1-2 、上调Bax，作用于Caspase家族等17。 3 .肿瘤相关基因与失巢凋亡抑癌基因PTEN是最近发现的一个具有双重特异性磷酸酶活性的抑癌基因，其编码蛋白可参与整合蛋白介导的信号转导通路，表达增加可使PIP3脱磷酸失活，从而抑制PIP3-AKTPKB细胞生存信号途径，也可依赖其磷酸酶活性抑制FAK的磷酸化使细胞凋亡。研究了多种肿瘤细胞如乳腺癌、膀胱癌等发现18-19，PTEN表达下降或缺失可使细胞AKTPKB磷酸化水平保持在较高水平且能改变癌细胞对化疗药物的敏感性，磷酸化的PKB

15、能使促凋亡蛋白(BAD)和胱冬肽酶-9(easpase-9)磷酸化而失活，具有抗凋亡作用。TrkB是由酪氨酸激酶原癌基因编码的一种NTs神经生长因子家族(neurotrophins，NTs)成员之一，与BDNF具有特异性的高亲和力。BDNF和TrkB结合后,可以引起其磷酸化并激活胞内的酪氨酸激酶信号通路，从而诱导细胞逃逸凋亡20。研究人员发现，Trkb的下游可以通过改变细胞内部和其他的形式来抗失巢凋亡和其他形式的细胞死亡，如Trkb激活PI3Ks，活化AKT/PKB，最终抑制caspases，阻止失巢凋亡的发生。4. 中药对肿瘤细胞失巢凋亡的影响徐则丰等人21-22用不同浓度的姜黄素分别处理结

16、肠癌SW-480细胞、SW-620细胞、采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP切口末端标记法检测结肠癌细胞失巢凋亡，结果发现姜黄素能有效地抑制结肠癌细胞锚着不依赖性增殖，促进结肠癌细胞失巢凋亡。亦有研究报道23青蒿琥酯对乳腺癌MCF-7细胞有同样的增值抑制，促进凋亡的作用。李莹等研究证实白藜芦醇及葡萄籽提取物均有诱导胃癌细胞HGC-27、BGC-823失巢凋亡的作用24。此外有报道称掌叶半夏提取物有效部位对体外培养的宫颈癌细胞有明显促凋亡作用25。广泛临床与实验研究证实中医药具有一定程度的抗肿瘤作用，其机制可能涉及调节机体免疫，抑制肿瘤细胞增殖、促肿瘤细胞凋亡等多个方面；中药干预肿瘤细胞失巢凋

17、亡，抑制肿瘤转移将可能是一个新的突破口。虽然近年进行了一些研究，但由于失巢凋亡主要是体外研究，尚存在一些问题，如中药复方有效成份的确定、提取，以及对细胞的作用方式等；虽然有中药血清的作用方式，但由于中药血清中的中药含量偏低，加之血清本身对肿瘤细胞生长有一定作用，因此建立一系列有效的方法模式，是中医药干预肿瘤细胞失巢凋亡研究，深化分子机制研究亟待解决的问题。REFERENCES：1 Frisch SM, Screaton RA. Anoikis mechanisms. Curr Opin cell Biol, 2001,13(5):555-562.2 Chiarugi P, Giannoni E

18、. Anoikis: a necessary death program for anchorage-dependent cells. Biochem Pharmacol,2008, 76(11):1352-1364. 3 Mawji IA, Simpson CD, Gronda M et al. A chemical screen identies anisomycin as an anoikis sensitizer that functions by decreasing FLIP protein synthesis. Cancer Res,2007, 67 (17):8307-8315

19、.4 Mawji IA, Simpson CD, Hurren R et al. Critical role for Fas-associated death domain-like interleukin-1-converting enzyme-like inhibitory protein in anoikis resistance and distant tumor formation. J Natl Cancer Inst, 2007, 99(10):811-822.5 Bozzo C, Sabbatini M, Tiberio R et al. Activation of caspa

20、se-8 triggers anoikis in human neuroblastoma cells. Neurosci Res,2006, 56 (2):145-153.6 Takeda K, Hayakawa Y, Smyth MJ, et al. Involvement of tumor necrosis factor-related apoptosis - inducing ligand in surveillance of tumor metastasis by liver natural killer cells. Nat Med, 2001, 7 (1):94-100.7 Stu

21、pack DG, Puente XS, Boutsaboualoy S, et al. Apoptosis of adherent cells by recruit- ment of caspase-8 to unligated integrins. J Cell Biol, 2001,155 (3):459-470.8 Eeva J, Nuutinen U, Ropponen A, et al. Feedback regulation of mitochondria by caspase-9 in the B cell receptor-mediated apoptosis. Scand J

22、 Immunol,2009,70(6):574-583.9 Wei MC, Zong WX, Cheng EH, et al. Proapoptotic BAX and BAK: a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death. Science, 2001, 292 (5517) :727730.10 Danial NN. BCL-2 family proteins: critical checkpoints of apoptotic cell death. Clin Cancer Res. 2007; 13 (24):72

23、547263.11 Liu Z, Li H, Derouet M,et al. Oncogenic Ras inhibits anoikis of intestinal epithelial cells by preventing the release of a mitochondrial pro-apoptotic protein Omi/HtrA2 into the cytoplasm. J Biol Chem, 2006,281(21):1473814747.12 El-Naggar S, Liu Y, Dean DC. Mutation of the Rb1 pathway lead

24、s to overexpression of mTor, constitutive phosphorylation of Akt on serine 473, resistance to anoikis, and a block in c-Raf activation. Mol Cell Biol, 2009, 29(21):5710-5717.13 Gilmore AP, Metcalfe AD, Romer LH, et al. Integrin-mediated survival signals regulates the apoptotic function of Bax throug

25、h its conformation and subcellular localization. J Cell Biol, 2000, 149 (2) :431-446.14 Sachdev D, Zhang X, Matise I,et al. The type I insulin-like growth factor receptor regulates cancer metastasis independently of primary tumor growth by promoting invasion and survival.Oncogene,2009 Oct 19. Epub a

26、head of print15 Owens TW, Valentijn AJ, Upton JP,et al. Apoptosis commitment and activation of mitochondrial Bax during anoikis is regulated by p38MAPK. Cell Death Differ, 2009,16(11):1551-1562.16 Zhang Y, Rivera Rosado LA, Moon SY, Zhang B. Silencing of D4-GDI inhibits growth and invasive behavior

27、in MDA-MB-231 cells by activation of Rac-dependent p38 and JNK signaling. J Biol Chem, 2009,284(19):12956-12965. 17 Galante JM, Mortenson MM, Bowles TL,et al. ERK/BCL-2 pathway in the resistance of pancreatic cancer to anoikis. J Surg Res, 2009,152(1):18-2518 Vitolo MI, Weiss MB, Szmacinski M,et al.

28、Deletion of PTEN promotes tumorigenic signaling, resistance to anoikis, and altered response to chemotherapeutic agents in human mammary epithelial cells. Cancer Res ,2009,69(21):8275-8283. 19 GUO Yong-lian, ZHOU Si-wei SW, Ye Zhang-qun, et al.Induction of Anoikis by phosphatase activity-dependent P

29、ETN in human bladder transitional carcinoma cells BIU-87. Hua Zhong Ke Ji Da Xue Xue Bao, 2008,37(5):614-617.Chinese with abstract in English.郭永连，周四维，叶章群，等. 抑癌基因PTEN依赖其磷酸酶活性诱导人膀胱癌细胞BIU-87失巢凋亡机制,华中科技大学学报, 2008; 37(5):614-617.20 Thiele CJ, Li Z, McKee AE. On Trk-the TrkB signal transduction pathway is

30、 an increasingly important target in cancer biology.Clin Cancer Res, 2009, 15(19):5962-5967.21 XU Ze-feng, FAN Yu, DING Jia-yi. Effects of curcumin on anoikis resistance of human colon cancer cell SW-480 .Zhong Guo Zhong Yi Ji Chu Yi Xue Za Zi, 2006, 12(3):187-189. Chinese with abstract in English.许则丰, 范钰, 丁佳逸. 姜黄素对结肠癌SW-480细胞抗失巢凋亡的影响. 中国中医基础医学杂志,2006,12(3):187-189.22 FAN Yu, ZHANG You-li, XU Ze-feng. Inhibition of curcumin on the invasion of human colon cancer cell line sw620 in vivo. Jiang Su D