荧光和化学发光分析法ppt课件

1、嘉兴学院嘉兴学院仪器分析仪器分析第二章第二章 荧光和化学发光分析法荧光和化学发光分析法*Stokes 用分光计察看到：荧光的波长比入射光的波长略微长些五颜六色雨后路面上水珠油膜呈现* 基态分子吸收能量基态分子吸收能量( (电能、电能、热能、化学能或光能等热能、化学能或光能等) )，电，电子由基态跃迁到激发态，当子由基态跃迁到激发态，当电子由激发态前往基态时，电子由激发态前往基态时，以发射电磁辐射以发射电磁辐射( (即光即光) )的方的方式释放能量。式释放能量。 分子发光：分子发光：分子分子 +电能电能化学能化学能光能光能生物活性参生物活性参与化学发光与化学发光 电致发光电致发光化学发光化学发光

2、光致发光光致发光生物发光生物发光荧光荧光磷光磷光*分子发光：分子发光：M +能能量量M*M +hv光致发光：光致发光：M + hvM*M +hv光*2.1 2.1 荧光分析法荧光分析法2.1.1 2.1.1 荧光分析法根本概念荧光分析法根本概念2.1.2 2.1.2 荧光强度及影响要素荧光强度及影响要素2.1.3 2.1.3 仪器安装仪器安装2.1.4 2.1.4 定量分析方法定量分析方法2.1.5 2.1.5 荧光分析测定方法、特点和运用荧光分析测定方法、特点和运用*A A 分子的激发态分子的激发态分子激发态和三线激发态分子激发态和三线激发态激发态：激发态： 基态分子吸收能量后，价层电子跃迁

3、到高能基态分子吸收能量后，价层电子跃迁到高能级的分子轨道上称为电子激发态级的分子轨道上称为电子激发态 。是分子的亚稳。是分子的亚稳定形状。定形状。基态：基态： 在正常形状下，分子处于最低能级的分子轨在正常形状下，分子处于最低能级的分子轨道上称为基态。是分子的稳定形状。道上称为基态。是分子的稳定形状。2.1.1 2.1.1 荧光分析法根本概念荧光分析法根本概念2.1.1.1 荧光及其产生*l 电子自旋多重度电子自旋多重度 电子从基态跃迁到激发态，分子中的电子电子从基态跃迁到激发态，分子中的电子可以处在不同的自旋形状可以处在不同的自旋形状, ,常用电子自旋多重度常用电子自旋多重度来描画。来描画。M

4、 = 2S + 1S是电子的总自旋量子数，各电子自旋量子数的代数和。是电子的总自旋量子数，各电子自旋量子数的代数和。2.1.1.1 荧光及其产生* 单重态单重态M=1：电子自旋都配对的分子的电：电子自旋都配对的分子的电子态称为单重态，用子态称为单重态，用“S表示。表示。 三重态三重态M=3：分子中的电子对的电子自旋：分子中的电子对的电子自旋平行的电子态称为三重态，用平行的电子态称为三重态，用“T表示。表示。S2 T2 S1 T1 S0 ( (洪特规那么洪特规那么) ) M = 2S + 1M自旋多重度自旋多重度S总自旋量子数总自旋量子数2.1.1.1 荧光及其产生*2022-4-25S2S1S

5、0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越内转换振动弛豫能量l 2l 2l 1l 1l 3l 3 外转换l l 2 2T2内转换振动弛豫分子荧光和磷光发射过程* 电子处于激发态是不稳定形状，前往基态时，经过辐射跃迁(发光)和非辐射跃迁(热)等方式失去能量。传送途径传送途径辐射跃迁辐射跃迁荧光荧光磷光磷光内转换内转换系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫非辐射跃迁非辐射跃迁延迟荧光延迟荧光外转换外转换前往速度快的途径，发生几率大前往速度快的途径，发生几率大!B B 分子去激发过程及荧光的产生分子去激发过程及荧光的产生2.1.1.1 荧光及其产生*S2S0ehv1. 振动弛豫：同一电子能级内

6、以热能量交换振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换方式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发方式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动时间生振动时间10 -11 10 -13 s。1 1、非辐射跃迁、非辐射跃迁2.1.1.1 荧光及其产生*S2S0S1ehv2. 内转换：一样多重度的电子能级中内转换：一样多重度的电子能级中, 相等能相等能级间的非辐射能级交换。发生内转换的时间级间的非辐射能级交换。发生内转换的时间10-12 s。2.1.1.1 荧光及其产生*S2S0S1T1ehv3. 系间跨越：不同多重态在有重叠的转动能级系间跨越：不同多重态在有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。电子自旋改

7、动，跃迁禁阻，经过间的非辐射跃迁。电子自旋改动，跃迁禁阻，经过自旋自旋-轨道耦合等跃迁。轨道耦合等跃迁。2.1.1.1 荧光及其产生*4. 外转换：激发态分子与溶剂或其他分外转换：激发态分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而损失能量回到基态的非子之间产生相互作用而损失能量回到基态的非辐射跃迁。辐射跃迁。 外转换使荧光或磷光减弱或外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭。猝灭。2.1.1.1 荧光及其产生*S2S0S1T11. 荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级能级基态各振动能级，发射时间约为基态各振动能级，发射时间约为10-710-9 s 。 发射荧光的

8、能量比分子吸收的能量小，波长长。发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长。 ehvhv2 2、辐射跃迁、辐射跃迁2.1.1.1 荧光及其产生*2. 磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级动能级基态各振动能级。发光时间：基态各振动能级。发光时间：10-410s 。S2S0S1T1hvehvS0 激发态激发态振动弛豫振动弛豫内转换内转换系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫 T1 S0 2.1.1.1 荧光及其产生*1 1、荧光激发光谱、荧光激发光谱 固定荧光丈量固定荧光丈量波长，改动激发光波长，改动激发光的波长，丈量不同的波长，丈量不同波长波长exex激发光

9、照激发光照射下荧光强度的变射下荧光强度的变化，记录荧光强度化，记录荧光强度F F与激发光波长的与激发光波长的关系曲线。关系曲线。200260320380440500560620荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱磷光光谱磷光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱2.1.1.2 荧光激发光谱曲线和发射光谱曲线*2 2、荧光发射光谱、荧光发射光谱 200260320380440500560620荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱磷光光谱磷光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱 固定激发光波长固定激发光波长和强度

10、，记录在不同和强度，记录在不同波长波长emem下所发射的下所发射的荧光强度所得关系曲荧光强度所得关系曲线即不同波长下荧光线即不同波长下荧光强度的分布。强度的分布。发射光谱的外形与激发波长无关。发射光谱的外形与激发波长无关。2.1.1.2 荧光激发光谱曲线和发射光谱曲线*l 荧光发射光谱与吸收光谱成镜像关系荧光发射光谱与吸收光谱成镜像关系 2.1.1.2 荧光激发光谱曲线和发射光谱曲线l 吸收光谱的外形阐明了分子第一激发单重态的振动能级；发射光谱阐明分子基态的振动能级构造。l 基态与激发态两者的振动能级构造类似，激发与去激发组成相反的两个过程。*u 分子产生荧光必需具备的条件分子产生荧光必需具备

11、的条件1. 具有适宜的构造：通常是含有苯环和稠环的刚具有适宜的构造：通常是含有苯环和稠环的刚性构造的有机分子；性构造的有机分子；2. 具有一定的荧光量子产率。具有一定的荧光量子产率。2.1.1.3 荧光效率*=发射荧光的分子数发射荧光的分子数激发分子总数激发分子总数2.1.1.3 荧光效率荧光量子产率荧光量子产率： 衡量荧光物质发光才干。衡量荧光物质发光才干。 它表示激发分子发射出荧光它表示激发分子发射出荧光(或磷光或磷光) 的比例。的比例。* 荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，可用各过程的速率常数来表示荧光量子产率：ffiiKKK 荧光发射过程的荧光发射过程的速率常数，取决速

12、率常数，取决于分子构造。于分子构造。各种非辐射跃迁过程的速各种非辐射跃迁过程的速率常数之和。取决于分子率常数之和。取决于分子所处的化学环境，同时也所处的化学环境，同时也与化学构造有关。与化学构造有关。2.1.1.3 荧光效率* 荧光分子与其他分子相互作用引起荧光强度降低甚荧光分子与其他分子相互作用引起荧光强度降低甚至荧光消逝的景象为荧光猝灭，又称荧光熄灭。至荧光消逝的景象为荧光猝灭，又称荧光熄灭。1 1、 碰撞猝灭碰撞猝灭-动态猝灭动态猝灭 M* + Q M + Q + 热量热量激发态分子激发态分子猝灭剂猝灭剂2.1.1.4 猝灭*2 2、 生成化合物的猝灭生成化合物的猝灭-静态猝灭静态猝灭

13、M + Q M Q 基态的荧光物质与猝灭剂反响生成非荧光的基态的荧光物质与猝灭剂反响生成非荧光的化合物，导致荧光的猝灭。化合物，导致荧光的猝灭。2.1.1.4 猝灭3 3、 能量转移能量转移 M* + Q M + Q* 激发态的分子与猝灭剂作用，能量发生转移激发态的分子与猝灭剂作用，能量发生转移，猝灭剂被激发。，猝灭剂被激发。*5 5、 自猝灭自猝灭 荧光物质的浓度较大时，激发态分子之间碰撞较多，在荧光物质的浓度较大时，激发态分子之间碰撞较多，在碰撞中引起能量损失，产生自熄，使荧光强度减小。碰撞中引起能量损失，产生自熄，使荧光强度减小。2.1.1.4 猝灭4 4、 氧的猝灭氧的猝灭 氧对溶液荧

14、光产生猝灭作用的缘由比较复氧对溶液荧光产生猝灭作用的缘由比较复杂，能够包含着多种机理。杂，能够包含着多种机理。 *2.1.2 荧光强度及影响要素荧光强度及影响要素2.1.2.1 荧光强度与溶液浓度的关系2.1.2.2 有机物的荧光与其构造的关系2.1.2.3 金属离子螯合物的荧光2.1.2.4 实验条件对荧光强度的影响*Epsilon大写，小写，是第五个希腊字母。汉字读音：艾普西龙朗伯-比尔定律0fbc*303. 2IKIP15*A A 跃迁的类型跃迁的类型l* 是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型，具是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型，具有有* 共轭双键的分子才干发射较强的荧光。共轭双键的分子

15、才干发射较强的荧光。2.1.2.2 有机物的荧光与其构造的关系荧光的产生是分子先阅历* 或n * 激发，然后经振动弛豫或其他非辐射跃迁再发生* 或* n 而得到荧光。*B B 共轭效应共轭效应化合物化合物量子产率量子产率F ex（nm） em（nm） 苯苯萘萘蒽蒽丁省丁省2052863653902.1.2.2 有机物的荧光与其构造的关系0.110.280.360.52278321404480*C C 分子共平面效应分子共平面效应芴芴 = 1联苯联苯 = 0.2荧光分子的共平面性添加，那么共轭体系大，荧光分子的共平面性添加，那么共轭体系大，有利于有利于* 跃迁。跃迁。2.1.2.2 有机物的荧光

16、与其构造的关系*荧光黄荧光黄 = 0.92酚酞酚酞 = 02.1.2.2 有机物的荧光与其构造的关系*D D 取代基效应取代基效应1. 给电子取代基加强荧光给电子取代基加强荧光-NH2，-NHR ，-NR2，-OH， -OR ，-CN产生产生 p 共轭共轭2. 吸电子取代基减弱荧光吸电子取代基减弱荧光-C=O， -COOH ，-NO2摩尔吸光系数小，荧光发射弱，系间跨跃较大，摩尔吸光系数小，荧光发射弱，系间跨跃较大，同样使荧光减弱。同样使荧光减弱。 2.1.2.2 有机物的荧光与其构造的关系*D D 取代基效应取代基效应2.1.2.2 有机物的荧光与其构造的关系A A 跃迁的类型跃迁的类型B

17、B 共轭效应共轭效应C C 分子共平面效应分子共平面效应*2.1.2.3 金属离子螯合物的荧光2 2螯合物中金属离子的发光螯合物中金属离子的发光1 1螯合物中配位体的发光螯合物中配位体的发光*2.1.2.3 金属离子螯合物的荧光1 1螯合物中配位体的发光螯合物中配位体的发光 不少有机化合物虽然具有共轭双键，但由于不是刚性构造，分子处于非同一平面，因此不发生荧光。假设这些化合物和金属离子构成螯合物，随着分子的刚性加强，平面构造的增大，常会发生荧光。 如8-羟基喹啉本身有很弱的荧光，但其金属螯合物具有很强的荧光。*2.1.2.3 金属离子螯合物的荧光 这类发光过程通常是螯合物首先经过配位体的跃迁激

18、发，接着配位体把能量转给金属离子，导致dd 跃迁和ff跃迁，最终发射的是dd跃迁和ff跃迁光谱。2 2螯合物中金属离子的发光螯合物中金属离子的发光*2 2、溶剂、溶剂3 3、溶液黏度和温度、溶液黏度和温度 4 4、溶液的、溶液的PHPH值值2.1.2.4 实验条件对荧光强度的影响1 1、激发光源、激发光源*2.1.2.4 实验条件对荧光强度的影响1 1、激发光源、激发光源激发光强度激发光强度I0I0大，荧光强度增大，灵敏度增高。大，荧光强度增大，灵敏度增高。2 2、溶剂、溶剂 主要表现为溶剂的极性、氢键、配位键的构成对主要表现为溶剂的极性、氢键、配位键的构成对化合物的荧光发生变化。化合物的荧光

19、发生变化。 * *跃迁类型：溶剂极性增大，跃迁能量降跃迁类型：溶剂极性增大，跃迁能量降低，发生红移，荧光加强。低，发生红移，荧光加强。 氢键、配位键的构成主要影响荧光分子的存氢键、配位键的构成主要影响荧光分子的存在型体、电离形状，荧光强度和外形均发生很大变化在型体、电离形状，荧光强度和外形均发生很大变化。*3 3、溶液黏度和温度、溶液黏度和温度 黏度大，温度低，可减小碰撞引起的荧光熄灭，黏度大，温度低，可减小碰撞引起的荧光熄灭，荧光强度增大。荧光强度增大。温度升高，外转换的几率添加，荧光强度降低。温度升高，外转换的几率添加，荧光强度降低。4 4、溶液的、溶液的PHPH值值不同不同PH值下，荧光

20、分子存在方式不同。值下，荧光分子存在方式不同。2.1.2.4 实验条件对荧光强度的影响*2.1.3 2.1.3 仪器安装仪器安装Cary Eclipse 荧光分光光度计荧光分光光度计荧光、磷光化学荧光、磷光化学/生物发光生物发光美国瓦里安技术中国美国瓦里安技术中国*一、荧光分光光度计构造流程一、荧光分光光度计构造流程 2.1.3 仪器安装仪器安装光源光源样品池样品池激发激发单色器单色器检测器检测器数据处置数据处置仪器控制仪器控制发射发射单色器单色器组成：激发光源、样品池、双单色器、检测器、显组成：激发光源、样品池、双单色器、检测器、显示系统。示系统。特殊点：两个单色器，光源与检测器通常成直角。

21、特殊点：两个单色器，光源与检测器通常成直角。*1 1、激发光源、激发光源 汞灯、碘钨灯、氙弧灯、激光等汞灯、碘钨灯、氙弧灯、激光等。2 2、样品池、样品池 I0ItIf样品池四面透光。样品池四面透光。2.1.3 仪器安装仪器安装*4 4、检测器、检测器 普通采用硒光电池。普通采用硒光电池。 检测器的方向与激发光的方向成直角，以消检测器的方向与激发光的方向成直角，以消除样品池中透射光和杂散光的干扰。除样品池中透射光和杂散光的干扰。 3 3、单色器、单色器 激发单色器：激发单色器：选择激发光波长，用以分别出所需用的激发光。选择激发光波长，用以分别出所需用的激发光。发射单色器：发射单色器：选择荧光发

22、射波长，用以滤去杂散光、瑞利光、选择荧光发射波长，用以滤去杂散光、瑞利光、拉曼光和杂质所发射的荧光。拉曼光和杂质所发射的荧光。 2.1.3 仪器安装仪器安装*二、磷光分光光度计构造流程二、磷光分光光度计构造流程 光源样品池激发单色器检测器数据处置仪器控制发射单色器斩波器磷光镜利用荧光和磷光发射利用荧光和磷光发射寿命的差别寿命的差别通常情况下，样品池需求放在盛液氮的石英杜瓦瓶内，通常情况下，样品池需求放在盛液氮的石英杜瓦瓶内，来测定低温磷光。来测定低温磷光。*2 2、定量方法、定量方法 1 1、定量根据、定量根据 2.1.4 定量分析方法定量分析方法*1 1、定量根据、定量根据 荧光强度荧光强度

23、 If If 正比于吸收的光强度正比于吸收的光强度 Ia Ia 和荧光量子产率和荧光量子产率 ：faII 001 10bCatIIII由朗伯由朗伯- -比耳定律得：比耳定律得：2.303001 101bCbCfIIIe 荧光强度荧光强度 If ：2.1.4 定量分析方法定量分析方法*对于稀溶液，当对于稀溶液，当 2.303bC 0.05时：时：02.303ffIIbC If -荧光强度荧光强度I0 -入射光强度入射光强度f -荧光量子产率荧光量子产率b - 吸收光程吸收光程 - 摩尔吸光系数摩尔吸光系数C - 物质浓度物质浓度fIKC2.1.4 定量分析方法定量分析方法*2 2、定量方法、定量

24、方法 规范曲线法：规范曲线法：FCsFxCx2.1.4 定量分析方法定量分析方法*A A 无机化合物的荧光分析无机化合物的荧光分析如如MgMg、AlAl、CaCa等，本身不发射荧光，但与有机试剂可构成等，本身不发射荧光，但与有机试剂可构成荧光配合物进展定量测定；荧光配合物进展定量测定； 直接法：如直接法：如8-8-羟基喹啉与羟基喹啉与AlAl离子反响生成荧光配合物离子反响生成荧光配合物 安息香，水杨醛缩邻氨基苯酚，黄酮醇，安息香，水杨醛缩邻氨基苯酚，黄酮醇， 二苯乙醇酮二苯乙醇酮 2.1.5 荧光分析测定方法、特点和运荧光分析测定方法、特点和运用用*荧光熄灭法*B B 有机化合物的荧光分析有机化合物的荧光分析本身发射荧光的，如罗丹明本身发射荧光的，如罗丹明B B、荧光素等可直接测定；、荧光素等可直接测定；不发射荧光的物质可经过处置后成为发射荧光的物质进展不发射荧光的物质可经过处置后成为发射荧光的物质进展测定；测定；*C C：蛋白质的荧光分析：蛋白质的荧光分析蛋白质的根本构造，有的氨基酸本身可以发荧光，蛋白质的根本构造，有的氨基酸本身可以发荧光，例如：酪氨酸，色氨酸，苯丙氨酸例如：酪氨酸，色氨酸，苯丙氨