第18章-生殖毒性研究

1、李相军李相军1350431142813504311428年份年份 事件事件作者作者1932193219351935194819481950195019561956196319631966196619711971维生素维生素A A缺乏可使猴胚胎畸形缺乏可使猴胚胎畸形X X射线照射使大鼠胚胎发生各种畸形射线照射使大鼠胚胎发生各种畸形氮芥导致大鼠胚胎畸形氮芥导致大鼠胚胎畸形可的松致小鼠胚胎畸形可的松致小鼠胚胎畸形反应停（反应停（ThalidomideThalidomide）事件）事件美国药物安全委员会美国药物安全委员会美国美国FDA FDA 人用药生殖安全评价准则人用药生殖安全评价准则WHOWHO规

2、定新药应有生殖毒性研究规定新药应有生殖毒性研究HaleHaleGobGobHarriuHarriuBaxterBaxter先天愚型先天愚型海豹肢畸形海豹肢畸形 生殖毒性研究（生殖毒性研究（Reproductive toxicity Reproductive toxicity studystudy）是药物非临床安全性评价的重要内容，）是药物非临床安全性评价的重要内容，它与急性毒性、长期毒性、遗传毒性等毒理学它与急性毒性、长期毒性、遗传毒性等毒理学研究有着密切的联系，是药物进入临床研究及研究有着密切的联系，是药物进入临床研究及上市的重要环节。上市的重要环节。 生殖毒性研究在限定临床研究受试者范围、

3、生殖毒性研究在限定临床研究受试者范围、降低临床研究受试者和药品上市后使用人群的降低临床研究受试者和药品上市后使用人群的用药风险方面发挥重要作用。用药风险方面发挥重要作用。分期分期研究内容研究内容检测方法检测方法交配前到怀交配前到怀孕孕成年雄性成年雄性/ /雌性动物的生殖功能；配子雌性动物的生殖功能；配子的发育和成熟；交配行为及生育力的发育和成熟；交配行为及生育力一般生殖毒一般生殖毒性试验性试验怀孕到着床怀孕到着床成年雄性成年雄性/ /雌性动物的生殖功能；着床雌性动物的生殖功能；着床前的发育和着床前的发育和着床着床到硬腭着床到硬腭闭合闭合成年雄性成年雄性/ /雌性动物的生殖功能；胚胎雌性动物的生

4、殖功能；胚胎发和大部分器官形成发和大部分器官形成致畸试验致畸试验硬腭闭合到硬腭闭合到怀孕末期怀孕末期成年雌性动物的生殖功能；胚胎生长发成年雌性动物的生殖功能；胚胎生长发育以及器官发育和生长育以及器官发育和生长出生到断奶出生到断奶成年雌性动物的生殖功能；婴儿在宫外成年雌性动物的生殖功能；婴儿在宫外生活的适应性；断奶前的发育和生长生活的适应性；断奶前的发育和生长围产期试验围产期试验断奶到性成断奶到性成熟熟断奶前的发育和生长；独立生活的能力；断奶前的发育和生长；独立生活的能力；完全达到性成熟完全达到性成熟避孕药、性激素、性功能障碍药、促精子生成药、致突变试验避孕药、性激素、性功能障碍药、促精子生成药

5、、致突变试验阳性或有毒作用的新药，必须进行生殖毒性试验。阳性或有毒作用的新药，必须进行生殖毒性试验。 生殖是机体繁衍种族的生理过程，包括生殖细胞的发生殖是机体繁衍种族的生理过程，包括生殖细胞的发育形成、交配、受精、植入、胚胎形成和发育、分娩和哺育形成、交配、受精、植入、胚胎形成和发育、分娩和哺乳等过程。每一个环节均可能是化学物质毒性作用的靶部乳等过程。每一个环节均可能是化学物质毒性作用的靶部位，机体接触化学物质后干扰了其生理过程，使生殖过程位，机体接触化学物质后干扰了其生理过程，使生殖过程的功能出现缺陷和损害，此即化学物质的的功能出现缺陷和损害，此即化学物质的。 ：（：（1 1）对化学物质的毒

6、性作用）对化学物质的毒性作用敏感，一定剂量下，其他系统尚未出现损害之前，生殖过敏感，一定剂量下，其他系统尚未出现损害之前，生殖过程中的某个环节或功能已经出现障碍；（程中的某个环节或功能已经出现障碍；（2 2）化学物质毒性）化学物质毒性作用对其损害更为深远，不仅表现在接触化学物的机体本作用对其损害更为深远，不仅表现在接触化学物的机体本身，还可影响后代。身，还可影响后代。 从胚胎学和病理学发展出来的一个分支学科，是研从胚胎学和病理学发展出来的一个分支学科，是研究胚胎发育时期，由各种内外因子引起结构和功能异常的先究胚胎发育时期，由各种内外因子引起结构和功能异常的先天性畸形的科学。天性畸形的科学。 药

7、物接触胚胎发生期后引起药物接触胚胎发生期后引起永久性结构或功能异常的性质。永久性结构或功能异常的性质。 某些药物在一定剂量仅某些药物在一定剂量仅对胚胎或胎儿有毒性作用而对母体没有毒性作用，此作用对胚胎或胎儿有毒性作用而对母体没有毒性作用，此作用被称为胚胎毒性。胚胎毒性表现为胚胎死亡、胚胎生长迟被称为胚胎毒性。胚胎毒性表现为胚胎死亡、胚胎生长迟缓、畸形和功能不全。缓、畸形和功能不全。 指药物引起怀孕动物的毒效指药物引起怀孕动物的毒效应，如体重不增或减轻等，最严重的是死亡。应，如体重不增或减轻等，最严重的是死亡。 永久性结构异常或功能异常的永久性结构异常或功能异常的胎儿和新生儿。通常不包括显微镜下

8、细微结构的异常胎儿和新生儿。通常不包括显微镜下细微结构的异常, , 生生化代谢性缺陷。单纯功能异常化代谢性缺陷。单纯功能异常( (如精神缺陷、智力缺陷如精神缺陷、智力缺陷), ), 也不包括分娩过程中各种因素造成的缺陷。也不包括分娩过程中各种因素造成的缺陷。 为一种药物对母体的半数为一种药物对母体的半数致死量与最小致畸量的比值，是表示一种化学物质的致畸致死量与最小致畸量的比值，是表示一种化学物质的致畸强度指标。建议致畸指数在强度指标。建议致畸指数在10以下定为不致畸，以下定为不致畸，10 100为为致畸，致畸，100以上为强致畸。以上为强致畸。 指任何解剖学的和功能的指任何解剖学的和功能的异常

9、。既包括形态结构的异常异常。既包括形态结构的异常( (大体的和细微的大体的和细微的) )，也包，也包括功能、代谢、行为的异常。括功能、代谢、行为的异常。 一般生殖毒性试验（一般生殖毒性试验（reproductive toxicity test）是研究药物对整个生殖过程的影响。包括生殖细胞是研究药物对整个生殖过程的影响。包括生殖细胞（精子、卵细胞）的发生，卵细胞受精、着床胚胎（精子、卵细胞）的发生，卵细胞受精、着床胚胎形成，胚胎发育阶段的影响并作出评价。形成，胚胎发育阶段的影响并作出评价。 至少一种动物，一般为大鼠或小鼠，每组雄性至少一种动物，一般为大鼠或小鼠，每组雄性动物动物10只，雌性动物至

10、少只，雌性动物至少20只。只。 给药组设高、中、低三个剂量；高剂量应能产生给药组设高、中、低三个剂量；高剂量应能产生轻微毒性反应，如体重增长缓慢等，但不应出现严轻微毒性反应，如体重增长缓慢等，但不应出现严重中毒或死亡。重中毒或死亡。 给药途径应尽量接近临床。给药途径应尽量接近临床。 雄性动物交配前给药雄性动物交配前给药60 80天，雌性动物交配天，雌性动物交配连续给药连续给药14天。交配后继续给药至大多数器官发生天。交配后继续给药至大多数器官发生期（大鼠期（大鼠/小鼠为孕后小鼠为孕后13天）。天）。 1. 雄性与雌性动物同笼交配后，每日检查小鼠阴道中有无雄性与雌性动物同笼交配后，每日检查小鼠阴

11、道中有无阴栓，大鼠则检查精子，以检查到阴栓或精子的当日作阴栓，大鼠则检查精子，以检查到阴栓或精子的当日作为妊娠第为妊娠第0天。天。2. 雌鼠于妊娠第雌鼠于妊娠第13天解剖观察，以确定妊娠、胎儿的吸收天解剖观察，以确定妊娠、胎儿的吸收和死亡情况，并记录母鼠的一般状况、体重变化和胎盘和死亡情况，并记录母鼠的一般状况、体重变化和胎盘重量，以确定子宫内的活胎数，对活胎进行性别鉴定、重量，以确定子宫内的活胎数，对活胎进行性别鉴定、体重和身长的测量以及外表和内脏器官的形态学观察，体重和身长的测量以及外表和内脏器官的形态学观察，对骨骼进行茜红素染色后进行检查，必要时进行组织学对骨骼进行茜红素染色后进行检查，

12、必要时进行组织学和组织化学的详细检查。和组织化学的详细检查。 3. 大鼠于孕期第大鼠于孕期第20天处死（小鼠天处死（小鼠18天）。剖腹取天）。剖腹取出子宫及卵巢，辨认和记录活胎数，早死胎数、出子宫及卵巢，辨认和记录活胎数，早死胎数、晚死胎数、吸收胎数和黄体数，对活胎仔应辨晚死胎数、吸收胎数和黄体数，对活胎仔应辨别性别、称重，测量身长及尾长，仔细检查活别性别、称重，测量身长及尾长，仔细检查活胎仔的外观有无畸形，将每只母鼠的胎仔的外观有无畸形，将每只母鼠的2/3活胎活胎仔剥去皮肤和内脏，经脱水透吸及茜红素染色仔剥去皮肤和内脏，经脱水透吸及茜红素染色后，检查骨骼畸形，将后，检查骨骼畸形，将1/3活胎

13、仔浸入活胎仔浸入Bouin氏氏溶液中固定，供检查内脏畸形。溶液中固定，供检查内脏畸形。 100 %畸胎率畸胎率% =畸胎总数畸胎总数活胎仔总数活胎仔总数活胎仔平均畸形数活胎仔平均畸形数 =畸形总数畸形总数活胎仔总数活胎仔总数100 %母体畸胎出现率母体畸胎出现率% =出现畸胎母体数出现畸胎母体数妊娠母体总数妊娠母体总数 凡受试物能引起生殖机能障碍，干扰配子的形成或使生凡受试物能引起生殖机能障碍，干扰配子的形成或使生殖细胞受损，其结果除可影响受精卵或孕卵的着床而导致殖细胞受损，其结果除可影响受精卵或孕卵的着床而导致不孕外，尚可影响胚胎的发生及胎仔的发育，如胚胎死亡不孕外，尚可影响胚胎的发生及胎仔

14、的发育，如胚胎死亡导致自然流产、胎仔发育迟缓以及胎仔畸形。如果对母体导致自然流产、胎仔发育迟缓以及胎仔畸形。如果对母体造成不良影响，出现妊娠、分娩和乳汁分泌的异常，亦可造成不良影响，出现妊娠、分娩和乳汁分泌的异常，亦可出现胎仔出生后发育异常。出现胎仔出生后发育异常。 本试验检测药物对整个生殖过程的毒性作用，通过繁殖本试验检测药物对整个生殖过程的毒性作用，通过繁殖试验可以了解药物对试验动物的性腺功能、交配能力、受试验可以了解药物对试验动物的性腺功能、交配能力、受孕能力、妊娠过程、分娩、哺乳及对后代生长发育的影响。孕能力、妊娠过程、分娩、哺乳及对后代生长发育的影响。 一般倾向于二代繁殖试验。一般倾

15、向于二代繁殖试验。 大鼠，至少设三个剂量级和一个对照组。每组大鼠，至少设三个剂量级和一个对照组。每组动物应至少能产仔动物应至少能产仔20窝；窝；F0代有生育能力的雄鼠至代有生育能力的雄鼠至少少10只，以后各代每组也应至少有只，以后各代每组也应至少有10只雄鼠。只雄鼠。 高、中、低三个剂量；高剂量应有毒性作用，高、中、低三个剂量；高剂量应有毒性作用，但不能引起但不能引起10%以上动物死亡，且超过人体预期接以上动物死亡，且超过人体预期接触水平。低剂量应不产生可观察到的有害作用。触水平。低剂量应不产生可观察到的有害作用。 以人体可能接触的方式染毒。以人体可能接触的方式染毒。 仅对仅对F0及及F1代动

16、物染毒。代动物染毒。 F0代动物自离乳起（代动物自离乳起（6 w之前）开始染毒，直到之前）开始染毒，直到F1代代离乳；离乳；F1代动物离乳（约代动物离乳（约30 d）后，部分动物（用来继续）后，部分动物（用来继续繁殖的动物）每天染毒，直到繁殖的动物）每天染毒，直到F2代离乳后代离乳后30天。天。 F0代给药至少代给药至少100天后，开始交配，产生天后，开始交配，产生F1代。代。 F1代给药至少数代给药至少数120天后，开始交配，产生天后，开始交配，产生F2代。代。 包括动物一般状态、体重、进食量及死亡情况；着重观察包括动物一般状态、体重、进食量及死亡情况；着重观察受孕率、妊娠率、出生存活率、产

17、仔总数及平均仔重等与生殖受孕率、妊娠率、出生存活率、产仔总数及平均仔重等与生殖机能有关指标。机能有关指标。 计算下述生殖指数：计算下述生殖指数：100 %1. 生育力指数：生育力指数： 受孕率受孕率% =妊娠雌鼠数妊娠雌鼠数交配雌鼠数交配雌鼠数100 %2. 受孕指数：受孕指数： 正常妊娠率正常妊娠率% =活产雌鼠数活产雌鼠数妊娠雌鼠数妊娠雌鼠数100 %3. 存活力指数：出生存活率存活力指数：出生存活率% =生后生后4 d 存活仔存活仔数数出生时活仔数出生时活仔数100 %4. 哺育指数：哺育指数： 哺育存活率哺育存活率% =生后生后21 d 存活仔数存活仔数出生后出生后4 d 存活数存活数

18、 母体在孕期受到可通过胎盘屏障的药物作用母体在孕期受到可通过胎盘屏障的药物作用,影响影响胚胎的器官发育胚胎的器官发育,导致结构和机能的缺陷导致结构和机能的缺陷,出现胎仔畸出现胎仔畸形。因此在受孕动物的胚胎着床后，并已开始进入形。因此在受孕动物的胚胎着床后，并已开始进入细胞及器官分化期时，可检出该物质对胎仔的致畸细胞及器官分化期时，可检出该物质对胎仔的致畸作用。作用。 致畸试验（致畸试验（teratogenic test）为鉴定动物致畸物）为鉴定动物致畸物的标准方法。不仅能检测到药物的致畸性，也可得的标准方法。不仅能检测到药物的致畸性，也可得到有关药物致胚胎死亡及生长迟缓的资料。到有关药物致胚胎

19、死亡及生长迟缓的资料。 要求选用对药物敏感性高而自发畸形率低的动物，常用大要求选用对药物敏感性高而自发畸形率低的动物，常用大鼠、小鼠和兔。一般至少采用鼠、小鼠和兔。一般至少采用2种动物，一种为啮齿类，另一种动物，一种为啮齿类，另一种要求非啮齿类（狗和猴）。种要求非啮齿类（狗和猴）。 未交配过的雌鼠，鼠龄未交配过的雌鼠，鼠龄3 m以下，体重以下，体重200 - 250 g，做阴道，做阴道分泌物涂片检查，若发现白色分泌物较多，镜下发现有核上皮分泌物涂片检查，若发现白色分泌物较多，镜下发现有核上皮细胞，则提示大鼠处于动情前期。此时，将其与雄鼠按细胞，则提示大鼠处于动情前期。此时，将其与雄鼠按2 1

20、或或3 2同笼过夜，次日检查是否受孕。同笼过夜，次日检查是否受孕。 检查是否受孕。（检查是否受孕。（1）检查阴栓：阴栓是雄鼠精囊与凝固腺）检查阴栓：阴栓是雄鼠精囊与凝固腺分泌液在雌鼠阴道凝结而成的白色块状物，形似米粒。大鼠阴分泌液在雌鼠阴道凝结而成的白色块状物，形似米粒。大鼠阴栓易脱落，小鼠阴栓不易脱落。（栓易脱落，小鼠阴栓不易脱落。（2）阴道涂片检查精子。）阴道涂片检查精子。 阴栓或精子检出当日记为孕阴栓或精子检出当日记为孕0天，次日为孕第天，次日为孕第1天。天。 分高、中、低三个剂量组；阴性对照组；阳性对照组。分高、中、低三个剂量组；阴性对照组；阳性对照组。 （1）高剂量应有母体毒性反应，

21、或为最大给药量；低）高剂量应有母体毒性反应，或为最大给药量；低剂量组应为母体和胚胎毒性反应剂量。剂量组应为母体和胚胎毒性反应剂量。 （2） 以以 LD50 的的 1/3 1/5 为高剂量组；以为高剂量组；以 LD50 的的 1/30 1/100 为低剂量。为低剂量。 （3） 以人实际接触量做为低剂量组，并以其倍数（以人实际接触量做为低剂量组，并以其倍数（10倍）做为高剂量。倍）做为高剂量。 大鼠、小鼠大鼠、小鼠 15 20 只；兔只；兔 8 10 只；狗和猴只；狗和猴 3 4 只。只。 给药途径根据药物的性质及人类可能的接触方式定，多给药途径根据药物的性质及人类可能的接触方式定，多为灌胃和腹腔

22、注射。为灌胃和腹腔注射。 给药时间选在胚胎对致畸物的易感期（器官形成期）。给药时间选在胚胎对致畸物的易感期（器官形成期）。 1 每只实验动物在试验期间的受精日期、给每只实验动物在试验期间的受精日期、给药日期和剂量、体重等基本指标。药日期和剂量、体重等基本指标。 2 对母体的观察：每天检查有无中毒症状，对母体的观察：每天检查有无中毒症状，对有流产或早产征兆者（阴道出血）及时处死对有流产或早产征兆者（阴道出血）及时处死检查。检查。 3 对胎仔的观察对胎仔的观察A 活仔外形的检查活仔外形的检查B 胎仔内脏检查胎仔内脏检查C 对胎仔骨骼检查对胎仔骨骼检查部位部位 畸畸 形形头颅头颅鼻鼻眼眼耳耳腭腭颌和

23、唇颌和唇肢肢趾趾脊柱脊柱腹部腹部尾尾肛门肛门脑突出，露脑，颅脊柱裂，单纯性脑膜膨出脑突出，露脑，颅脊柱裂，单纯性脑膜膨出单鼻孔，鼻孔扩张单鼻孔，鼻孔扩张小眼，无眼，开眼，眼异位小眼，无眼，开眼，眼异位无耳，小耳，耳异位无耳，小耳，耳异位腭裂腭裂颌小，无颌，无口，唇裂颌小，无颌，无口，唇裂短肢，畸形足短肢，畸形足多趾，少趾，缺趾，并趾多趾，少趾，缺趾，并趾脊柱膜膨出，脊柱骨缺失，脊柱侧凸脊柱膜膨出，脊柱骨缺失，脊柱侧凸脐疝脐疝短尾，卷尾，角形尾，螺旋尾，无尾短尾，卷尾，角形尾，螺旋尾，无尾肛门闭锁肛门闭锁（外观畸形）（外观畸形）部位部位 畸畸 形形颅顶骨颅顶骨枕骨枕骨颈椎骨颈椎骨胸骨胸骨肋骨肋骨

24、腰椎腰椎四肢骨四肢骨盘骨盘骨尾椎骨尾椎骨缺损，骨化迟缓缺损，骨化迟缓缺损，骨化迟缓缺损，骨化迟缓缺损，骨化迟缓缺损，骨化迟缓缺损，错位，骨化迟缓缺损，错位，骨化迟缓多肋，少肋，短肋，分叉肋，波状肋，融合肋多肋，少肋，短肋，分叉肋，波状肋，融合肋缺失，分裂，变形缺失，分裂，变形多骨，缺失多骨，缺失缺失缺失缺失，椎弓不连续，融合缺失，椎弓不连续，融合部位部位 畸畸 形形头头腭腭口腔口腔眼眼心血管心血管肺肺膈膈肠肠肝肝肾肾生殖器生殖器膀胱膀胱脑积水，脑室扩大脑积水，脑室扩大腭裂腭裂短舌，分叉舌短舌，分叉舌少眼，小眼，无眼少眼，小眼，无眼右位心，室中隔缺损，单房室心，主动脉弓横位右位心，室中隔缺损，单

25、房室心，主动脉弓横位气管食管瘘，肺倒位，少叶气管食管瘘，肺倒位，少叶横膈缺损，并引起腹内脏疝或内脏侧位横膈缺损，并引起腹内脏疝或内脏侧位肠疝肠疝肝异位，少叶肝异位，少叶马蹄肾，肾积水，肾积水，肾缺失，肾异位马蹄肾，肾积水，肾积水，肾缺失，肾异位子宫缺失，睾丸缺失或隐睾，睾丸发育不全（单子宫缺失，睾丸缺失或隐睾，睾丸发育不全（单侧侧/ /双侧），两性畸形双侧），两性畸形缺失缺失常见畸形及部位常见畸形及部位（内脏畸形）（内脏畸形） 1 对母体动物评定：对母体动物评定： 100 %100 %母体畸胎出现率（母体畸胎出现率（%）=妊娠母体数妊娠母体数交配率交配率% =已交配动物数已交配动物数实验动物数实验动物数死亡率死亡率% =死亡动物数死亡动物数实