微生物可谓一种精巧的机器

1、緒   言 微生物可謂一種精巧的機器，經演化而達其生存與繁殖之目標。野生型的細菌或酵母細胞經天擇而能密切地適應環境並與其他物種競爭，但並不會碰巧適於製造人類所要的物質。現代工業微生物學所要篩選的是一些畸形的微生物。這些經過遺傳育種後的微生物能夠生產大量的正常代謝物（其量之多，對野生型微生物的能源和營養而言是無比的負擔），甚至製造出本來無法生產的物質。人類在一百多年前以純株培養的方式，分離出能製造有用物質的細菌和真菌，才開始有可能選出適用於特定需要的菌株，這是控制及改良利用微生物的起步。 至於有目標的培育特殊的工業用菌種，則等到人們對微生物遺傳學有了一些了解以後，才成為可能。

2、首先是發現某些突變的機制：亦即遺傳訊息的基本單位基因突然改變成為新的形式。而早在1927年，就已經可以在實驗室要用X射線誘發出突變；1945年以後，發現各種強力的誘變性輻射線和化學誘變劑，更為微生物學家提供一套有效的工具，來改變菌種的遺傳成分。1940年代中期遺傳學方面的進展，使人們能夠重組兩種或兩種以上微生物的基因，而改組它們的遺傳訊息：細菌可以用一種奇妙的交配方式，甚至只是交換裸露的DNA，就進行有性繁殖。而在真菌中也發現了新穎的遺傳系統。對這些過程的進一步了解，促使微生物遺傳學和分子生物學至今仍繼續地蓬勃發展。 第二次世界大戰之後的幾年，醱酵工業的生產規模和生產量都因抗生素的工業生產而起

3、了重要的變化。青黴素早在戰時就已經製造了，之後又持續開發許多對抗各種細菌性和真菌性疾病的新抗生素。而後新的醱酵方法，讓微生物生產其他的純化學物質，如胺基酸（蛋白質的成分）和核 苷酸（核酸的成分）。這些化學物質無法經濟地用野生型菌生產。它們的工業生產仰賴遺傳的操縱，於是新的醱酵工業乃與微生物遺傳學這門新科學平行發展起來。可是，在相當長的一段時間裏，遺傳科學對工業微生物的遺傳育種，只是偶而有一些貢獻，而不是經常有貢獻。這曾使一些學術界的遺傳學家很懊惱。 1973年，有關重組DNA（recombinant DNA）和分子複殖（molecular cloning）的實驗宣布以後，情況有了急劇的變化。新

4、發展出來的這種技術原則上能把任何來源的基因轉移到各種微生物中。這些遺傳工程技術是揭示基因結構和功能的有力實驗工具。它們在工業微生物上也有無限的潛力，不僅能培育生產人體胰島素或生長激素這些嶄新的醱酵產品的工業菌株，也能有計畫地發展更適於生產傳統醱酵產品的新菌株。遺傳工程已經吸引住工業界的管理家和企業家們的想像力，但它只是過去35年中建立起來的微生物遺傳學整個大廈的一塊拱頂石而已；它雖然最令人興奮，但也只是工業微生物遺傳育種規劃上的許多方向之一。細菌的營養：     各種細菌的生理功能差別很大，因而各自的營養需要也不一致。有些細菌可利用二氧化碳、碳酸鹽等無機

5、物作為碳源，以無機氮、硝酸鹽為氮源，稱為自養菌；有些細菌則必須以有機碳化合物作為碳源和能源，以有機含氮營養物為氮源（少數可利用無機氮化物），稱為異養菌。異養菌必須依賴其他生物提供所需營養物質才能生活，所以是寄生性的，致病菌屬於異養菌。     細菌細胞的化學組成和其他生物細胞大體相同，還含有一些細菌特有的化學物質，如汰聚糖、磷壁酸、二氨基庚二酸、比啶二梭酸等。細菌細胞的化學成分反映出它們生長的主要物質需要。其所需營養物質為水、氮源、碳源、無機鹽和生長因子等。     (1)水：水是細菌細胞的主要組成部分。細菌的吸收

6、、滲透、分泌和排洩都以水為媒介，各種生化反應也都必需有水才能進行。     (2)氮源：細菌細胞中的蛋白質和核酸，是主要的含氮化合物，這些化合物在菌體內不斷 被利用、消耗和更新，因此必需從周圍環境中攝取含氮物質加以利用。各種細菌所需要的氮源很不相同。致病菌必須從有機氮化物中攝取氮，如蛋白質、各種氨基酸等。     (3)碳源：含碳化合物有兩種營養功能，一方面作為碳源用於合成菌體的糖類、脂類和氨基酸等，同時也作為能源。致病菌主要以糖為碳源，有機酸、氨基酸亦可為碳源。     (

7、4)無機鹽類：細菌所需無機鹽中有鉀、鈉、鈣、鎂、硫、磷、鐵等。它們除參與構成菌體成分外，尚可維持滲透壓、調節氫離子濃度，以及激活或組成細菌的黴類。其中磷含量較多，可參與組成核酸、磷脂、某些輔黴以及ATP係統的能量基質。     (5)生長因子：許多細菌除以上各種營養物質外，還需要一些生長因子。生長因子是一類需要量很少的有機化合物，主要是B族維生素，多屬輔黴或輔基的成分，如硫胺素、核黃素、泛酸、比多醇、煙酸等。此外少數細菌還需要X因子和V因子（均可從血液中獲得）。X因子可能是氯化高鐵血紅素，V因子是輔黴I(NAD)，二者都是細胞呼吸所需要的物質。 細菌生長

8、繁殖的條件：     (1)營養物質：細菌生長繁殖所需營養物質已如前述。此外，尚需其他一些條件。     (2)酸鹼度：大多數細菌最適酸鹼度為pH7.27.6，此時黴活性較強，生長旺盛。個別細菌在鹼性環境中生長良好，如霍亂弧菌。     (3)溫度：不同種類的細菌，其最適生長溫度相差較大。多數為嗜溫菌（在1540°C）均能生長）。寄生在人體的細菌即以宿主體溫(37°C)為適宜生長的溫度，因此實驗室採用37°C培養細菌。   &

9、#160; (4)氣體：與細菌生長有關的氣體主要是氧氣和二氧化碳。二氧化碳在細菌代謝過程中很重要，它與有機酸結合後生成多一個梭基的酸，對細菌的中間代謝有著重要作用，如:丙酮酸梭化為草醋酸(CH3COCOOH2COCOOH)，然後參與三梭酸循環，並可進而轉化為氨基酸、漂呤、嘧啶等。一般細菌在代謝中產生的二氧化碳即可滿足其需要。氧是培養細菌的一個重要因素，但對氧的需要因菌種不同而異。     專性需氧菌(Aerobe)：必須在有氧條件下生長，因為它們在進行氧化時，是以分子氧為受氫體，如結核桿菌、霍亂弧菌等。    &#

10、160;專性厭氧菌(Anaerobe)：不能利用分子氧為受氫體，相反分子氧對它們有明顯的毒性，所以只能生活在無氧環境中，如破傷風桿菌、肉毒桿菌等。     兼性厭氧菌(Facultive anaerobe)，在有氧和無氧時都能生活，多數致病菌屬此。 能量代謝：     細菌的生命活動需要能量，這些能量主要通過生物氧化獲得。細菌的氧化方式主要是脫氫和失去電子。細菌的生物氧化類型，根據受氫體的性質而分為呼吸(Respiration)和發酵(Fermentation)。     呼

11、吸是以無機物為受氫體的生物氧化過程，其中以分子氧為受氫體的稱為需氧呼吸，（在有氧條件下進行），以其他無機化合物（如硝酸鹽等）為受氫體的稱為厭氧呼吸（在無氧條件下進行）。發酵是以有機化合物為受氫體（也多在無氧條件下進行）。這幾種氧化形式都是產能代謝。大多數致病菌都只進行需氧呼吸和發酵。     (1)需氧呼吸：是以分子氧為受氫體的產能（生成ATP)代謝過程。多數致病菌（包括需氧菌和兼性厭氧菌），均能進行需氧呼吸而獲得能量。     (2)發酵：是在無氧條件下進行的產能代謝過程，其供氫體和受氫體都是有機物質，有時最終受

12、氫體就是碳源分解的有機副產品，所以很多細菌能利用葡萄糖作為碳源、能源，並以其分解的有機副產品作受氫體，以進行發酵性生長。專性厭氧菌和兼性厭氧菌都能進行發酵。 基因重組育種法: 重組（recombination）遺傳育種的另一基本方法，是基因或部分基因的重新排列，能將兩種或兩種以上生物的遺傳訊息一起放在一個生物中。很多自然程序和實驗技術都能產生重組現象。同源重組（homologous recombination）的發生，是具有相似的DNA鹽基順序的細菌或真核細胞的染色體，由於某種交配過程，藉著DNA的剪接而交換相對應的部分。以真核生物來說，有性生殖更提供一種洗牌的重新分配過程，使來自兩個個體的兩

13、套染色體攪混。 通常親緣近的成員之間才能雜交成功。然而，不同生物之間重組的天然屏障常常可以以原生質體的製備來打破。原生質體就是將細菌或真菌細胞剝去外層細胞壁，而暴露出薄薄的細胞膜。因為各種生物的細胞膜成分大致相同，因此能誘導彼等互相融合成雜種細胞，使它們的基因得以重組。 對於同種之間罕有天然交配的生物，原生質體融合也是一種增加重組頻率的有效技術。鏈黴菌（streptomyces）中許多種就是如此。細菌用溶菌酶（lysozyme）脫除細胞壁造成原生質體；整個操作在糖液中進行，維持滲透壓與細胞內壓力的平衡，否則嬌嫩的細胞膜就會漲破。兩種菌株的原生質體的融合，可以利用聚乙二醇（polyethylen

14、e glycol）之類的化學劑促進。融合後的雜種細胞中，親代的DNA之間可以重組。然後雜種原生質體可以誘導而再生成細胞壁，產生正常的菌體。兩種鏈黴菌之間的融合效率之高，可達到整個群落中至少有五分之一的細胞有新的基因組合。利用這種方法，應該有可能一步就把各菌種經過數次突變和選擇所辛苦累積來的抗生素高產量的突變基因結合在一起。 重組DNA技術 同源重組導致相應一段DNA鏈相互的交換，另一類型的重組是在微生物已有的DNA上增加新的DNA。這種方式之一就是質體（plasmid）的轉移。質體是細菌和某些酵母菌染色體外的小型環狀DNA分子，它們能在宿主細胞裏自主複製，而由子細胞繼承。質體通常帶有賦予細菌專

15、門特性的基因，它們可以從菌株轉到另一無親緣關係的菌株，有時還可以轉到不同的種，而引入全新的遺傳特性。有些質體使宿主細菌具備接合生殖的能力，因而能促進細菌間基因的轉移。質體也可以由噬菌體（即細菌病毒）從一個細菌帶到另一個細菌中。另外，由於寄主細胞（自發的或誘導的）裂解而游離出來的裸露質體DNA，也能夠以所謂轉化（transformation）的過程進入新的細胞，這種轉化可以用很多實驗室技術加強。 利用天然質體的轉移來做微生物育種的一個例子是：製造一種能分解石油中主要碳氫化合物的細菌。許多戀臭假單胞菌（pseudomonas putida）的菌株含有某些質體，它們具備有基因，產生能夠分解某一類碳氫

16、化合物的酶。這類的質體有四種：OCT（分解辛烷、己烷和癸烷）XYL（分解二甲苯和甲苯）CAM（分解樟腦）NAH（分解）其中兩種質體（CAM和NAH）可以藉細菌間的交配而彼此轉移；另外兩種質體則不能，但若有可促進交配的其他質體的存在，它們也能相互轉移。有人利用連續交配的辦法，創造出了一種超級菌：帶有XYL和NAH質體以及一個由部分的CAM和部分的OCT重組而成的雜種質體（CAM和OCT質體是不相容的，亦即不能以完整質體的方式共存於同一細菌內）。具複合質體細菌能夠以原油為食物，迅速生長，因為它代謝碳氫化合物的能力比任一單質體菌株要強得多。超級菌能否有效地清除石油污，或者清洗油輪的底層，還不清楚；但

17、它已經留名於法律史上：它是第一個經美國最高法院確認，而以經過遺傳操縱微生物的方式獲准的專利。 最近發現很多種鏈黴菌的抗生素的合成，並不是由黴菌的染色體所控制，而是由質體所控制。這類抗生素種類繁多，具有廣泛的用途：不僅可用於人類醫學和獸醫學，而且也可以用做動物飼料的添加物以及防治某些植物的病害。把數種具備不同抗生素的質體放入單一的鏈黴菌寄主細胞內，也許能使它們的酶合作製造出具有新特性的新抗菌素。 能夠從一個菌種中分離質體DNA並誘導另一個菌種接納它，乃是操縱重組DNA的基礎。來自無親緣的生物，或者人工合成的基因，都可以剪接到質體上，然後把質體引入新的微生物寄主中。這些質體基因是受體生物中嶄新的對

18、應物，不能透過同源重組而穩定地遺傳下來；但是現在用質體作媒介，這些基因可以跟著質體的複製，一代接一代無限制地遺傳下去。有些病毒的DNA也能做為媒體，只要它們能感染微生物而又不殺死寄主就可以遺傳下去。許多細菌病毒（溫和性的噬菌體）都可以攜帶新的基因進入寄主細胞。有些感染動植物的病毒也可以，所以動植物細胞也和微生物一樣，成為以工業應用為取向而進行基因重組。 重組DNA的目標是利用微生物生產本來不會合成的蛋白質，譬如某種酶或激素。基本的觀念是將具備能夠合成某一產品的個別基因轉移到一種寄主微生物中，然後大量培養此微生物以生合成產品。迄今我們幾乎完全用大腸桿菌作寄主，將來或許可以選用其他更適於在大型工業

19、醱酵槽中生長的寄主。質體工程的另一目標是將現有的工業菌株予以改良。不是引進全新的遺傳能力，而只用修改遺傳訊息的方式，也能夠改良現有菌株的效率。最後，重組DNA技術應該可以在某一基因的特定位點引發突變，以克服一般誘變技術的盲目性質，提高傳統育種法的精確性。 借助能在DNA特定鹽基對切割的所謂限制內核酸酶（restriction endonuclease），可以把巨大的DNA分子（如染色體中的DNA）切割成許多小片段。這些酶中有的會切割出帶有黏性末端（sticky end）的片段。將它們嫁接到同種酶切割（因此有相配的末端）的質體（或噬菌體）內，由此得到的重組質體通過轉化引進大腸桿菌中。然後從帶有複

20、合質體的細菌複殖株（clone）中篩選需要的菌株。因為質體上的基因提供對抗生素的抵抗性，使它們能夠在含有抗生素的培養基中生長。重組質體上有沒有所要的外來基因，可以用靈敏的蛋白質檢定法測定。帶有質體的細菌可以培養成好幾十億細胞的複殖體，每一細胞都攜帶著同一個外來基因的拷貝。 不管是拷貝的基因，還是人工合成的基因，上面都沒有在細菌染色體上表現所需要的適當起動區和其他的控制信號。因此，必須要把人造的基因剪接到媒體DNA上適當的位置，利用媒體上的細菌控制信號引導人造基因的表現。細菌常常會把外來的蛋白質消化掉，因此寄主細胞可能要加以改造，使它不會破壞自己所合成的新化合物，如胰島素。寄主還必須經過篩選或改

21、造，使它在累積或分泌大量對它本身沒有用途的蛋白質的情形下，還能旺盛地生長。人類胰島素、生長激素或抗病毒干擾素，這類治療用蛋白質的醱酵生產極具商業價值，所以大規模生產所面臨的這些障礙必會早日設法突破克服。 遺傳工程甚至還可能用來使微生物製造從不存在的蛋白質。最近人體干擾素的拷貝DNA的複殖成功，使我們發現干擾素的種類多得令人驚訝。這些干擾素不僅在胺基酸順序上不同，而且特性也不同。我們可以用類似同源基因重組的技術，把兩種大腸桿菌複殖體中不同的天然干擾素基因，各取一部分拼接起來，然後把這雜種基因引進細菌寄主中，就可以製造出種種全新的干擾素來。這種方法可以提供大量的新分子，然後再測定它們的醫療價值。將

22、來我們更了解蛋白質的結構與其生物特性之間的關係後，我們甚至可能設計全新的蛋白質，用合成和複殖人造基因的方式，來製造它們。 用遺傳方式改良現有的菌種，特別適於抗生素和生物鹼這類不是直接由基因轉譯，而是經由許多基因產物酵素而合成的物質。與其費心冒險地將合成這些產物的整套基因，移植到一個完全陌生、不慣於表現它們的寄主中，還不如改造現有工業菌株的遺傳訊息。例如，我們可以多添加一個拷貝的基因來暢通一個代謝瓶頸的流量；或者把一種新酶提供給微生物，將改變天然代謝物成為我們所要的產品。這類的複殖系統正在發展中。 重組DNA技術有一個特別令人興奮的用途，就是定位突變（site-directed mutation

23、）。自發突變或甚至誘發突變的盲目性質，使我們很難找到在DNA的特定位置上發生改變的突變種。如果我們要的是缺乏某一種酶的營養異株時，倒沒有什麼大問題，因為誘變的目標相當大：整個基因的數百個鹽基對中，任何一對發生改變都能使基因失去活性。但是，要有計畫地改變基因上特定的部位，以改良它的功能（例如改變起動區中某一特殊的鹽基對，以增加轉錄效率），則困難多了。現在基因可以從一個複殖體中分離出來，它的DNA順序可以在細胞外用特殊的化學處理來改變，然後這個基因可以重新引入寄主中，依賴同源重組把細菌的基因用修飾過的基因換下來。 Ethanol Production in Sealed Cultures of E

24、. coli 微生物將葡萄糖代謝至丙酮酸（pyruvate）主要路徑：醣解(glycolysis) 葡萄糖經1,6-二磷酸果糖降解至丙酮酸，酵解過程分十步完成，代謝至丙酮酸其中 磷酸果糖激酶 烯醇酶 為調節糖解作用主要的酶   微生物將糖類代謝至丙酮酸後，在無氧情形下因不同微生物細胞內的不同脢系統而異,進行醱酵作用產生不同醱酵產物如酒精或乳酸等。酵母菌醱酵產物為酒精,  乳酸菌醱酵產物乳酸，其他尚有不同醱酵產物.。但若於有氧情形下，以氧作為最後電子接受者，則會進行呼吸作用，丙酮酸將進入TCA循環（Tricarboxylic acid cycle）完全氧化為二氧化碳

25、。下圖為E. coli 的 醣解(glycolysis)與酒精生成的路徑圖烯醇酶磷酸果糖激酶一般的情形下E. coli要生成酒精是有困難的，應為缺少pyruvate decarboxylase alcohol dehydrogenase因此上圖中無 (紅色方塊內) 的路徑，而主要產物酒精(在紫色方塊內)無法生成E. coli要生成酒精主要的路徑如左下圖因此運用前述基因工程的方式進行晶因重組的技術(右上圖) ，使E. coli有pyruvate decarboxylase alcohol dehydrogenase可以逕行酒精的生成路徑，而生成酒精總結  不同微生物在特定

26、條件,  採何種代謝途徑或混合多種途徑來降解糖類物質,對發酵產品有很大影響.了解各種微生物體內糖類物質的分解方式,對發酵菌的定向培育.遺傳控制.代謝調控很重要. Ethanol 酒精的歷史及用途 人們自古已經製造及使用酒精。在公元前二千年，已有撒瑪利亞人（Sumerian）醫師用作處方；聖經亦記載耶穌參加喜宴前從水變出更多酒；而中國三國時代名醫華陀更是第一個人使用酒精作麻醉藥。 酒精是一種非常好的有機溶液；不同的酒精可用於不同的用途，如消毒酒精、化妝品、殺蟲劑、燃料等。 用於醫院消毒，工業用，及化學實驗室等的酒精均危害身體，絕不可飲用。 酒精，學名乙醇，是一種無色而略有香味

27、的液體，沸點七十八度。通常由廢糖蜜或澱粉醱酵生成，新法則由石油熱裂而得的乙烯氣體通入水中，如少許弱酸為催化劑生成，新法的成本很低。 初生成的酒精，經過蒸餾，得到的蒸餾液，其成分中只含有乙醇最高為百分之九十五。換言之，其中尚含有百分之五的水分，必須另設法將此少許水分除去之，然後得到純粹的乙醇。純粹的乙醇，特名之為絕對酒精。絕對酒精的市價較普通酒精（即含有百分之五水分者）貴得多。 絕對酒精為一種極重要的工業原料，可作許多有機物的溶媒，來製造多種化學工業物品，包括香料、西藥、塑膠等。例如調稀油漆用的香蕉水，便是由乙醇製成的，這是一種無色的液體（並非水），也是噴漆的主要溶媒，經常用來噴塗機車及汽車的外

28、殼，在施工時，可聞到很濃的香蕉氣揮發出來。 香蕉水的化學名為乙酸乙酯，是由乙醇與醋酸反應生成，其中並不含有水分。 由乙醇可以氧化生成醋酸，醋酸是很重要的工業原料，許多人造纖維、染料，及西藥是由醋酸製成的。 由醋酸與乙炔反應所得的產品，可以聚合成一種塑膠，這種塑膠若調入糖粉、薄荷及其他香料，便製成適口的香口膠。這種塑膠的用途很多。酒精的用途統整(1) 酒啤酒小麥 紅酒葡萄 米酒米 (2) 防棟劑-具有較低的溶點的特性(3) 消毒劑-改變生物體蛋白質特性與溶解其酯質(4) 麻醉藥-酒精直接作用在神經細胞膜上如同麻醉藥。其部分成份是脂溶性的主要作用在細胞膜酒精不是中樞神

29、經的興奮劑而是抑制劑。(5) 化妝品、香水(如花露水)-酒精本身易溶於水且亦是良好的溶劑。(6) 殺蟲劑(7) 香蕉水-為乙酸乙酯(CH3COCH2COOC2H5)(由乙醇生成)，酒精是有機物體的良好溶劑，香蕉水用來 調稀油漆。(8) 燃料-化學實驗室酒精甘蔗玉米MTBE(甲基第三丁基醚)酒精取代石油(酒精燃料)降低25% CO2產出DNA萃取酒精燈麻醉劑消毒水殺蟲劑酒類重要成分紅酒-葡萄啤酒-小麥米酒-米化妝品防凍劑香蕉水會導致癌症用E. coli以glucose來生產酒精會牽涉到的代謝路徑主要有transport of glucose, glycolysis, mixed acid fer

30、mentation 和 ethanol degradation.最主要的是，讓E. coli處於無氧發酵的環境下，進行mixed acid fermentation來產出酒精。如下圖所示，這些路徑是從Ecocyc網站中查詢而來：Glycolysis Transport of glucose Ethanol degradationMixed acid fermentation在KEGG的代謝路徑資料庫中的E.coli K-12 MG1655 pathway 中並沒有特別列出 mixed acid fermentation的代謝路徑。參考其glycolysis/gluconeogenesis代謝路

31、徑，我們標示出會影響酒精產量的重要調控酵素。在此代謝路徑中若能以基因工程方式加入pyruvate decarboxylase, alcohol dehydrogenase，則我們產生酒精的路徑就會更直接快速。調控: 磷酸果糖激酶, 烯醇酶 缺少: pyruvate decarboxylase ,alcohol dehydrogenase以下我們就從Ecocyc網站中查詢而來四個代謝路徑分別說明：Transport of glucose又稱PTS (PhosphoTransferase System)，EC 9。在有Mg2+的正常生理環境下，有兩套系統EIIMan和EIIGlc負責

32、glucose uptake和磷酸化。EIIGlc是專門負責glucose的。兩套系統的組成及負責輸送的分子詳列如下： EIIMan : ptsI , ptsH , manX , manY , manZ glucosamine, -D-glucose, N-acetyl-D-glucosamine, mannose, fructose EIIGlc : ptsI , ptsH , crr , ptsG -D-glucoseEIIGlcGlycolysis: 將磷酸化的glucose分解代謝成pyruvate。一分子glucose可以生成兩分子pyruvate。 Mixed acid ferme

33、ntation - partialGlycolysis - IIMixed acid fermentation: pyruvate在無氧發酵環境下，進入mixed acid fermentation, 主要會產出酒精，乳酸，水，二氧化碳和succinate。Ethanol degradation: 酒精超過一定濃度在生物體內是會有毒性的，所以E. coli會將酒精去氫還原成acetaldehyde。若能提高E. coli對酒精的耐受度及減緩ethanol degradation的反應，則可提高酒精產率。之前提到以基因工程方式在glycolysis/gluconeogenesis路徑加入pyru

34、vate decarboxylase, alcohol dehydrogenase，一般選殖基因的策略如下：加入pyruvate decarboxylase, alcohol dehydrogenase後由pyruvate產生酒精的路徑選殖基因方法：將基因解接至plasmid中，送入E. coli細胞中，以抗生素來篩選含有此特定plasmid的E. coli，再加以大量繁殖生產。如下圖：GEEPE:下圖中是我們將需要的pyruvate decarboxylase, alcohol dehydrogenase兩個基因合併至同一plasmid中，在將其transduction到E. coli中即可

35、。在石化燃料日益短缺的今天，酒精這種可再生性能源可以穩定能源的供應，也可以用來取代汽油中的甲基第三丁基醚(MTBE)。MTBE被懷疑有致癌性，目前學界仍分兩派說法。MTBE(甲基第三丁基醚) 化學式 (CH3)3COCH 3 Propose experiments to determine the metabolic fluxes of the network associated with each product .Anaerobic fermentation pathway of non-growing yeast, with glucose as the sole carbon sou

36、rce。 Solid arrows : reaction steps 。 Dashed arrows : activation。 Dotted arrows : inhibition。 regulatory loops # (+,-) : 7How to maximize specific ethanol production?Which of the existent regulatory loops should be inactivated?What associated changes should be made in enzyme expression levels?Three e

37、nzymes must beover-expressedTwo activation loops should be retainedThis method will maximize ethanol production, giving an increase of 100% relative to the reference state.E.coli & Yeast regulatory superstructure Dashed arrows : yeast Dotted arrows : E. coli Dashed-dotted : yeast & E.coliThe

38、 optimal regulatory structureThis method will maximize ethanol production, giving an increase of 114% relative to the reference state.Specific glucose uptake(B) and ethanol production rate(A) at 0.5% initial glucose concentration of anaerobic, resting E. coli KO20 strains with the plasmid pTrc99A on

39、ly (control), overexpression pfkF from E. coli(PYKec), and overexpression pyk From B. stearothermohilus(PYKbs). Cells were harvested from anaerobic mid-exponential growth phase cultures. The indicated values represent the mean value of at least two independent experiments, and error bars indicate th

40、e standard deviation.Specific glucose uptake (B) and ethanol production rate (A) at 2% initial glucose concentration of anaerobic, resting E. coli KO20 strains with the plasmid pTrc99A only (control), overexpressing pfkF from E. coli (PYKec), and overexpressing pyk from B. stearothermophilus (PYKbs)

41、.Different shading indicates different time points after the start of the experiment: 3 h (light grey), 5 h (grey), and 7 h (dark grey). Cells were harvested from the late exponential growth phase of aerobically grown cultures. The indicated values represent the mean value of at least two independent experiments, and error bars indicate the standard deviationHistory Records system biology tools we try to use /index.psp Many tools for pathway analysis Gepsi, Copsi, and FluxAnalysis Advantage : using kinet