动物寄生虫的分子生物学研究进展

1、动物寄生虫的分子生物学研究进展作者 :张其艳,杨晓花 来源 :动物医学进展 |云南农业职业技术学院,云南昆明 650212摘 要:动物寄生虫的分子生物学研究始于 20世纪 90年代中期, 虽然起步 较晚,但进展极快。近 10年来,研究广度已涉及所有重要的寄生原虫,并已扩 展到了具有重要公共卫生意义的部分寄生蠕虫, 研究深度已进入寄生虫的基因序 列测定分析、分类比对鉴定、诊断方法的建立和免疫学研究领域,建立了近 50种寄生虫的 cDNA 文库。我国鸡球虫、旋毛虫等虫种的分子生物学研究达到和接 近世界先进水平。 这些研究成果和技术水平, 已为动物寄生虫病的研究和防控工 作展示了新的前景。关键词:分

2、子生物学; 动物寄生虫学;相互关系2004年 11月, 中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会在广西桂林召开了第五 次代表大会暨第八次学术研讨会。会议交流和收录到 2002年以来有代表性的重 要论文和论文摘要共计 247篇(全文 84篇,摘要 163篇。其中,应用先进的分 子生物学、免疫学和生物化学等现代科学技术,在寄生虫病原基因学和分类学, 新型诊断方法的研究探讨和建立, 基因功能分析研究和免疫制剂研制等方面的论 文和论文摘要就达 127篇(全文 48篇,摘要 79篇,占论文总数的 51.4%1。这 过半数的论文及论文所显示的学术水平, 表明我国在动物寄生虫学和寄生虫病学 的研究上,已初步完成了从

3、传统寄生虫学向寄生虫分子生物学研究阶段的过渡, 极大的拓展了寄生虫学的研究领域, 充分开拓和展示了分子生物学新技术、 新方 法在寄生虫分类学和寄生虫病诊断及防控上的重要作用和地位。 本文就会议的相 关论文结合分子生物学的发展情况综述如下。1分子生物学发展史的简要回顾分子生物学是在细胞生物学、 生物化学、 遗传学和微生物学等学科基础上发 展起来的一门进展极快的新兴学科。 大体分为 3个发展阶段:20世纪 50年代前, 处于细胞染色体水平的基因遗传学研究阶段; 之后, 进入 DNA 大分子水平的基因 分子生物学研究阶段;70年代后,DNA 的重组和 DNA 测序技术的发展日趋完善, 使分子生物学进

4、入了一个全新的阶段, 基本形成了系统的现代分子生物学的理论 和实用操作技术体系。其中,最重要的技术发明和技术方法表现为如下几点:1972年 Paul Berg 在体外建立了 DNA 的重组技术,奠定了基因工程的基础。1973年,Boyer H 等首次用质粒克隆 DNA,并发现和建立了多种克隆载体; 1974年首次实现了异源真核基因在大肠埃希菌中的表达,随之逐步建立了在多 种微生物、动物和植物体内的真核表达系统和原核表达系统。1985年 Mulli K 等发现可用大肠埃希菌大片段聚合酶在体外扩增单拷贝的 哺乳动物基因,完成了体外生物的化学合成基因技术,使 DNA 片段以 2n 倍增, 奠定了 P

5、CR 的技术基础。由此建立了许多 PCR 新技术,如 RT-PCR、DD-PCR 技术等。可扩增和显示来源于多种细胞或组织的 mRNA 的 cDNA 等。1996年又建立了 代表性差异分析(RDA方法,应用于基因差别表达的分析。20世纪 90年代后期,为适应大规模、高通量的基因表达分析,区别不同组 织、 不同细胞、 不同阶段和不同状态下基因表达上的差异, 新建立的技术有表达 序列标签法(EsTs技术(吴乃虎, 1998, 微点阵基因芯片(microarray技术(贺 林等,2000,基因表达系列分析(SAGE技术(王彩虹等,2001和 cDNA 微点阵 (Schena等,1995等检测试剂盒或

6、探针。1977年 Sanger F 等发明了双脱氧法测定 DNA 序列,Maxam A M 和 Gilbert W 也于同年建立了化学修饰法测定 DNA。 1986年 Ansorge W 的首台自动 DNA 测序仪 投入使用。1998年全基因组鸟枪法(wholegenomeshotgun作为成熟技术实 际应用,至 2001年,完成了人类基因组和模式生物基因组的 DNA 测序计划。分子生物学领域的这些新技术和新方法, 在兽医学的病原、 诊断、 免疫和疫 病监测控制等方面都得到了较广泛的应用, 取得了一些成果, 从一个侧面为分子 生物学技术方法的完善和发展作出了积极贡献。2分子生物学在动物寄生虫学

7、研究上的应用和成果2.1动物寄生虫的分子生物学研究历史概况和主要成果动物寄生虫及其引发疫病的防治, 是预防兽医学领域的重要组成部分。 除寄 生原虫为单细胞结构、 生物学特性较单纯外, 其余寄生虫病原体较大, 结构较为 复杂, 在分子水平对其进行生物学研究, 比病毒、 细菌和原生动物要复杂和困难 得多。 对寄生虫进行分子生物学的研究大多起步于 20世纪 90年代中后期, 但由 于有许多成熟的分子生物学研究技术和方法可供借鉴, 所以, 寄生虫的分子生物 学研究虽然起步较晚,但研究的起点一般都较高,研究进展也较快 2。2002年前,国内已对重要的动物和人畜共患寄生虫病原体,如血吸虫、肝 片吸虫、猪带

8、绦虫、棘球绦虫、弓形虫、隐孢子虫、球虫、旋毛虫等,利用基因 组计划的细菌人工染色体、 酵母人工染色体技术, 以及芯片技术、 聚类分析技术、 表达序列标签技术、 荧光原位杂交技术、 体内选择技术和同线性分析技术等, 对 病原寄生虫的核酸、 蛋白组成和结构进行了研究, 对大部分所研究的寄生虫种构 建了某发育阶段或系统发育阶段的 cDNA 数据库,对部分虫种构建了遗传图、物 理图、 序列图和基因图。 同时, 利用 PCR 及其相关的 PCR/RELP、 PCR-RAPD、 PCR-TRF、 PCR-核酸杂交技术、PCR/ISH等技术方法,对部分寄生虫进行了分类鉴定,并对 其重要功能基因进行克隆和筛选

9、, 已成为诊断和研究寄生虫病的重要手段。 同期, 国际上对血吸虫基因组的研究较多,也取得了较大的进展。1998年 12月,完成了蠕虫代表种秀丽线虫的基因组测序,为世界最早完成 的真核多细胞生物基因组全序列测定。 为各种寄生虫利用基因组测序的现代分类 学和物种鉴定创造了模式条件。在分子免疫学方面, Kohler(德国和 Milstein(英国在 1975年成功获得单 克隆抗体(McAb后,现已报告的动物用 McAb 已有数百种,几乎包罗了流行严重 的动物传染病和寄生虫病。 在世纪之交, 已研制成功了一批重要疫病快速而准确 的 McAb 试剂盒,投入了临床和检测使用。为这些疫病的诊断方法和免疫预防

10、技 术展现了可期望的前景。意大利的 Ferrcio R,在细胞因子的研究中发现“热休克蛋白(HSP”,经 对其结构和功能的研究, 发现 HSP 在诱导免疫应答, 参与寄生虫分化, 抵御寄生 虫感染方面有明显作用。国外已对锥虫、利什曼原虫、疟原虫、血吸虫等重要寄 生虫的 HSP 展开了研究。利用基因重组技术, 已研制成功牛巴贝斯虫苗和疟原虫苗, 现已发展到基因 核酸疫苗的研制。 目前, 已报道的人用和兽用寄生虫核酸疫苗的实验室研究有疟 原虫、血吸虫和利什曼原虫等 3。2.22002年以来动物寄生虫分子生物学研究的新进展从总体上看, 国内外对动物寄生虫分子生物学的研究在近几年又有了一些新 的进展。

11、分子生物学研究的一些最新技术和最新方法开始在动物寄生虫上应用, 使研究的范围有所扩大,研究的深度也有所加强 4-5。我国寄生虫分子生物学研究对象和范围有所扩大, 在过去研究的基础上对鸡 球虫的研究已扩展到了几乎所有种、 属和其它动物球虫、 隐孢子虫。 新增了对羊 泰勒虫(TheileriaSP、中华泰勒虫(T.sinensis、牛巴贝斯虫、环形泰勒虫、 绵羊无浆体(Anaplasmaovis、 动物附红细胞体(Eperythrozoon、 伊氏锥虫和犬、 猫、牛、羊贾第虫(Giardia等主要危害种原虫的研究,增加了对土耳其斯坦东 毕吸虫、捻转血矛线虫、犬弓首蛔虫、拟地新线虫(P.decipi

12、ens、鸡异刺线虫、 猪蛔虫、鸡蛔虫、犬钩虫、盲囊线虫(C.rudolphii、毛首线虫、犬恶丝虫等寄 生蠕虫的分子生物学研究。 其中, 对鸡球虫、 旋毛虫的研究已达到和接近世界先 进水平。建立了一些寄生虫的 cDNA 文库,开展了部分虫种的分子生物学分类研究。 国内一些学者采用 RNA 抽提、RT-PCR 扩增和克隆,进行 EnMc-2(Gd序列分析和 与 EtMlc-2(Ht序列比较; 或将序列测定结果与登录 GenBank 的基因进行比对(SI值等方法,对国内异源、异地的同种或同属不同种的一些寄生性原虫、蠕虫进 行了同源性差异鉴定, 解决了部分在分类学上有争议虫种的分类学定位问题, 在

13、原虫方面表现较为突出。如广东谢明权等对鸡的毒害艾美耳球虫(Eimeria necatrix广东株、北京株,堆型艾美耳球虫(E.acervulina北京株、广东株的 序列比对,证实为异地同源同种;陶建平等对来自国内外不同地区的 11株巨型 艾美耳球虫(E.maxima进行 RAPD 分析,证实为同一种,但有虫株间亲源关系远 近差异; 安健等也对柔嫩艾美耳球虫 4个不同虫株进行了 mRNA 的差异显示测定, 证实有 2株同源, 有 2株为未知新序列。 张浩吉等将本地采集的牛附红细胞体的 PCR 产物进行鉴定测序, 结果与 GenBank 中登录的温氏附红细胞体(E.wenyonii的同源性为 97

14、%;刘琴等用采自水牛的巴贝斯虫进行 PCR 扩增后的 18s rRNA 片 段测序,结果与 GenBank 中登录的 15种已知巴贝斯虫均有差异,即定为新种东方巴贝斯虫(Babesiaorientalis,修正了原定种为牛巴贝斯虫的结论;罗 建勋等用同种方法对我国 8株黄牛的巴贝斯虫进行分类鉴定和比对, 确定国内巴 贝斯虫为牛巴贝斯虫、 双芽巴贝斯虫、 大巴贝斯虫、 卵形巴贝斯虫和巴贝斯虫未 定种共 5个种。翁亚彪等用 ITS 及 5.8S 序列分析,证实国内弓形虫 QH 绵羊株、 ZS 人株、SH 人株、CN 猪株的序列完全一致,与 GenBank 上登录的 RH 株也一致, 均为同一虫种。

15、 另外, 以分子生物学的多种方法鉴定, 显示我国旋毛虫为 2个虫 种,即猪的 T.spiralis 和犬的 T.nativa,并确认人的旋毛虫病在南方和中原主 要由猪旋毛虫种引起,东北主要由犬旋毛虫种引起。同时, 还完成和建立了 2种旋毛虫、 部分艾美耳球虫、 土耳其斯坦东毕吸虫、 温氏附红细胞体、 猪囊尾蚴、 捻转血矛线虫、 牛巴贝斯各虫种和水牛东方巴贝斯 虫、绵羊无浆体、弓形虫、羊巴贝斯虫、羊泰勒虫、环形泰勒虫、奶牛附红细胞 体广西株、贾第虫、日本血吸虫、肝片吸虫、大片吸虫、拟地新线虫、鸡异刺线 虫、异尖线虫、鸡蛔虫、猪蛔虫、弓首蛔虫、犬钩虫、猪毛首线虫等虫种的基因 测序;并在国内建立了相

16、应的 cDNA 文库,为寄生虫分子生物学研究创造和提供 了更好的基础条件。扩大了寄生虫分子生物学诊断和检测方法的应用范围, 特别在原虫方面有所 突破。但因寄生原虫的同属异种较多,吸虫、绦虫、线虫因虫体较大,结构和生 长发育过程复杂等原因。 应用分子生物学的一般方法进行大多数寄生虫病的诊断 和检测,尚存在准确性、特异性较差,交叉反应不易排除的问题;应用高层次分 子生物学技术,又存在成本过高、操作复杂、不易推广等困难。2.3动物寄生虫基因工程疫苗的研究进展利用现代免疫学、 生物化学和分子生物学的理论和方法, 进行动物寄生虫疫 苗的研究,近几年也取得了一系列可喜的进展 5。目前,囊尾蚴及棘球蚴基因重

17、组疫苗的研制已基本成功。棘球蚴苗 EG95可 诱导牛产生 96%100%的保护率;羊带绦虫 45W-GST 融合蛋白重组虫苗,可诱导 羊产生 92%以上的保护率,对牛无钩绦虫也有较高保护率,该苗即将进入市场。 类似的猪囊尾蚴基因重组苗,减虫率和完全保护率已分别达到 99.2%和 55.5%。 猪囊尾蚴细胞苗的研究也已获得成功,使工厂化规模化生产成为可能。吸虫疫苗研究较多的是日本血吸虫和肝片吸虫, 周金春等(2001用重组的副 肌球蛋白(RSJ97免疫水牛,3次免疫后腹部贴片感染日本血吸虫尾蚴,结果免 疫组减虫率为 49.9%, 肝脏减卵率为 57.3%。 另外, 发现 GST、 FABP、膜蛋

18、白(Sjc 23、卵黄铁蛋(Ferl等也是血吸虫疫苗的重要候选抗原;GST 还具有交叉反应 抗原决定簇, 对多种血吸虫都具有抗性, 使研制广谱抗血吸虫疫苗成为可能。 肝 片吸虫的 GST 重组抗原,可使绵羊感染减少 48%、牛减少 50%。总体看,有效的 吸虫基因重组苗在短期内尚难出现。血矛线虫、食道口线虫、仰口线虫是主要危害牛、羊的一大类线虫,但抗消 化道线虫疫苗的研制至今无大的突破。目前,最有效的是用具有氨酞酶 A 或 M 活性的 110ku 的整合膜蛋白(H11制作的疫苗,试验效果非常好,在持续 23周人工感染下, 可使羔羊达到 90%以上保护率, 但因抗原分子表位含有复合糖成分, 难以在