生物物理技术的PPT

1、 邹晶露 121601背景背景目的目的各种检测方法各种检测方法展望展望1234随着科技的快速发展，纳米材料因其特殊物理化学特性而被广泛应用于化妆品、电学器件、染料、涂料及医药诊断等各个领域，尤其在生物医药领域的作用及其显著，因此而备受关注，而人们对于纳米材料对环境安全和人体健康所潜在的影响却知之甚少。纳米毒理学应运而生。 纳米毒理学是专门研究纳米颗粒或材料毒性的学科, 运用一系列方法来分析纳米材料在体内和体外所产生的影响。本文就如何检测这些毒性作用导致出现的特征对磁性纳米颗粒的毒性检测方法作一简要综述, 以供大家对纳米材料的细胞毒性进行评价时作为参考。磁性纳米颗粒对细胞产生毒性影响导致细胞的变

2、化有：炎症、凋亡小体的产生、线粒体功能障碍、膜破裂导致乳酸脱氢酶的泄露、活性氧的产生、DNA损伤、染色体的浓缩等。图1. 细胞毒性的反应1.1.针对线粒体功能障碍的检测针对线粒体功能障碍的检测1.1 MTT1.1 MTT法法原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性 的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。优缺点： 灵敏度高，简单，快速又简单。 产生的甲臜产物不溶于水，需被溶解后才能检测。生成的甲瓒不易 充分溶解。测试后的细胞不能

3、继续培养。 图3. Morteza等用此法检测到不同浓度SPIONs处理下心脏细胞，脑细胞，肾细胞数量的变化图2.MTT处理后的显微图像2 CCK-82 CCK-8试剂盒法试剂盒法原理： WST-8是一种类似MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体的脱氢酶还原成橙黄色的formazan，用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，不需要裂解细胞，可直接进行比色。细胞毒性越大，则颜色越浅。颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。优点： 产生的formazan都是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤CCK一8法检测后细胞可重复利用，将细胞用生理盐水洗2遍，加入培养液可继续培养进行传代，还

4、可进行染色和组化实验等。3 3 Alamar Blue Alamar Blue 法法原理： 此试剂的主要成分是一种氧化还原指示剂其在氧化状态下呈现紫蓝色无荧光性，而在还原状态下，转变为呈粉红或红色荧光的还原产物，其吸收峰为530560nm。在细胞增殖过程中，细胞内NADPH/NADP、 FADH/FAD、 FMNH/FMN和NADH/NAD的比值升高，处于还原环境。摄入细胞内的染料被这些线粒体酶还原后释放到细胞外并溶于培养基中，使培养基从无荧光的靛青蓝变成有荧光的粉红色。最后用普通分光光度计或荧光光度计进行检测，吸光度和荧光强度与活性细胞数成正比。优点： Alamar blue 法对细胞的毒性

5、小，对样品破坏小、试剂用量少、操作简单，特异性高、灵敏度高、重复性好。图4.2. 2. 针对乳酸脱氢酶泄露的检测（针对乳酸脱氢酶泄露的检测（LDHLDH法）法）原理： LDH（乳酸脱氢酶）是一种稳定的蛋白质，存在于正常细胞的胞质中，正常情况下，LDH不能透过细胞膜，一旦细胞膜受损，LDH即被释放到细胞外。此时培养液中 LDH 活性与细 胞死亡数目成正比。LDH 可使乳酸脱氢，进而使NAD还原成NADH，后者再经递氢体吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）还原碘硝基氯化四氮唑（INT），INT 接受H被还原成紫红色甲臜类化合物。在酶标仪上用490nm比色测定。优缺点： 此法测定迅速, 并且能够进行定量分析。

6、但是乳酸脱氢酶是大分子, 只有靶细胞膜完全被破坏后才能释放出来，不能较早的反映细胞的存活状况。影响因素较多, 例如, 培养基、测定环境的温度、pH、反应时间等。图5.Soenen等用此法检测了超顺磁性纳米颗粒等不同纳米颗粒对PC 12细胞后细胞活力的变化。3. 针对细胞凋亡的检测（形态学观察）针对细胞凋亡的检测（形态学观察）在荧光显微镜下，吖啶橙染色后，活细胞核染色质呈现均匀分布的黄绿色荧光, 胞质呈橘红色荧光，而凋亡细胞核染色质的黄绿色荧光浓聚在核膜内侧。图6.凋亡细胞的荧光显微图像4. 针对细胞坏死的检测（细胞膜不完整）针对细胞坏死的检测（细胞膜不完整）4.1 中性红染色中性红染色原理：

7、中性红不带电荷，可以被活细胞所摄入，并在溶酶体中积累。在细胞增殖加快时，细胞数量增多，可以摄入的中性红的量就会增加。在细胞受到损伤时，中性红的摄入能力会下降。这样通过对于中性红摄入量的不同就可以确定细胞的增殖或毒性情况，它在540nm出有较高的吸收值。4.2 台盼蓝染色台盼蓝染色原理： 台盼蓝是带电荷的分子，不能进入正常的胞膜结构完整的活细胞；而丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，台盼蓝就会进入细胞，将细胞染成蓝色，并且在605 nm 波长处有较强的吸收。通过显微镜下直接计数或显微镜下拍照后计数，就可以对细胞存活率进行比较精确的定量。优点： 借助台盼蓝染色可以非常简便、快速地区分活

8、细胞和死细胞。用此方法检测细胞毒性，可重复性好。图7.台盼蓝染色后的显微图像4.3 乙酰氧甲基钙黄绿素和溴化乙锭乙酰氧甲基钙黄绿素和溴化乙锭原理： 乙酰氧甲基钙黄绿素，是电中性的酯分子，可以通过扩散进入细胞，一旦进入细胞就会被酯酶转化为带绿色荧光的钙黄绿素分子。相反，若细胞损坏或死亡，本身不能渗透进入细胞的溴化乙锭与核酸结合，可激发发红色荧光，在495nm出激发，乙酰氧甲基钙黄绿素和溴化乙锭分别在515nm、635nm荧光信号最明显。图8.荧光显微图像5. 针对针对DNA损伤的检测（彗星电泳法）损伤的检测（彗星电泳法）原理： 将单个细胞悬浮于琼脂糖凝胶中，经裂解、碱化处理后，再在电场中进行短时间的电泳，并用荧光染料染色，凋亡细胞中形成的DNA降解片段，在电场中泳动速度较快，使细胞核呈现出一种彗星式的图案。 正常的无DNA断裂的核在泳动时保持圆球形，彗星尾部即为迁移出类核的DNA片段。图9.荧光显微图像大量研究表明，多种纳米颗粒显示其细胞生物毒性效应，因而纳米材料的细胞生物毒性效应研究工作广泛开展，但是其细胞毒性评价方法仍有缺陷，对于纳