蛋白质详解,分类性质,生物化学课件完整版生物化学课件完整版(极其详细)

1、第二章 蛋白质第一节 蛋白质的概念及其生物学意义一、什么是蛋白质？AA 借肽键相连形成的高分子化合物（短杆菌肽含D-苯丙氨酸）O 肽键：CNH 也叫酰胺键二、蛋白质的生物学作用（或称功能分类）物质吸收与运输、运动，调节代谢、储存养分、催化各种生化反应、分子间的识别（支架蛋白）、信息传递（受体 复制酶）、记忆、疾病防御 抗体。应用：固体酶的工业应用（联于水不溶性树脂上）、脱（纺织品）浆（淀粉酶）、生化制药，蛋白酶用于皮革的脱毛及软化等，都是利用蛋白质的催化作用，蛋白质生物芯片（贮存信息量大，将多种蛋白质抗体固定、排列到玻璃板上，能检测各种疾病蛋白及其他基因表达蛋白），进行病原体与疾病诊断等。第二

2、节 蛋白质的组成一、蛋白质的元素组成： C（50-55）、H（6-8）、O（20-30%）、N（15-18）、S（半胱aa）（0-4%）有的还含有P（酪蛋白）、Fe、Zn、Mo（钼Fe蛋白）、Cu、I，特别是含N量都很接近，平均为16% 。所以，测出含N量 × 6.25（100/16 蛋白质系数）即可推测出蛋白质的含量凯氏定氮。二、蛋白质的aa组成通常只有20种，除Pro外均为 aa ，除甘氨酸外，都有D、L两种异构体（碳原子为不对称碳原子）所以有旋光性。投影式如下： COOH COOH H2N C H H C NH2 R R L D aa的分类方法：（一）氨基酸的种类分类一 根据侧

3、链基团R的化学结构分为四类：第一类 脂肪族aa：侧链是脂肪烃链一氨基一羧基（中性）：一氨基一羧基aa中共九种：H CH COOH CH2 CH COO CH2 CH COO NH2 OH NH+3 SH NH+3 (Gly:G) (Ser:S) (Cys:C)CH3 CH COO CH3 CH CH COO CH3 CH CH COO NH+3 OH NH+3 CH3 NH+ 3 (Ala:A) (Thr:T) (Val:V 支链aa)CH3 S CH2 CH2 CH CO CH3 CH CH2 CH O(Leu: L支链aa)(Met:M) NH+3 CH3 NH+3 CH3 CH2 CH

4、CH COO CH3 NH+3 (Ile:I支链aa)一氨基二羧基aa(酸性)及其酰胺OOC CH2 CH COO OOC CH2 CH2 CH COO NH+3 NH+3 (Asp:D) (Glu:E) O O H2N C CH2 CH COO H2N C CH2 CH2 CH COO NH+3 NH+3 (Asn:N) (Gln:Q)二氨基一羧基aa（碱性： NH2-COOH）H3N+ CH2（CH2）3 CH COO H2N C NH （CH2）3 CH COO NH3+ NH2+ NH3+ （Lys:K） (Arg:R)第二类 芳香族aa（含有苯环的化合物叫做芳香族化合物，有的包括Tr

5、p）： CH2 CH COO HO CH2 CH COO NH+3NH+3 (Phe:F) （丙aa取代） (Tyr:Y)第三类 杂环aa：HC CCH2 CH COO CH2 CH COO HN+ NH NH+3 N NH+3 CH （His:H 咪唑基） (Trp :W 吲哚基 苯并吡咯)第四类 脯氨酸，也称杂环亚氨基酸：由Glu还原、环化、再还原形成 COO 四氢吡咯-2-羧酸 NH2+ (Pro:P)分类二 按侧链R基团的极性（及在pH7左右时的解离状态）分为：非极性：甘、丙、缬、亮、异亮、苯丙、蛋、脯、色氨酸。不带电荷：带OH、SH、酰胺基极性 带负电荷（酸性aa） 带正电荷：Lys

6、、Arg、His (碱性aa) . His等电点为7.59此外在蛋白质代谢中还有鸟aa、瓜aa（尿素循环中）、胱aa、羟脯aa、羟赖aa（胶原蛋白的组分）。甘aa的H介于极性与非极性之间，有时归入极性不带电荷类中。 人和动物的必需aa：不能自身合成必须由食物获得。Thr、Val、Met、Leu、Ile、Phe、Lys、Trp、His*、Arg* (*半必需aa，儿童合成不足)（二）aa的性质1. 物理性质：无色结晶，易容于水，不容于有机溶剂，熔点高（Gly：232,乙酸：16.6，分子间靠氢键缔合），这些特性说明是离子化合物。2. 两性解离及等电点：（难点*） COO 加碱解离出H+带负电，加

7、H+结合H+带正电，向阴极移动， 在某一pH下带正、负电荷量相等。 H3N+ C H （由很酸向碱变化NH+3 CH COOH NH+3 CH COO ） R R R在电场中不移动，此时的pH称为aa的等电点（pI）。此时aa的溶解度最小（因为静电作用），pI与COOH和NH2的解离常数有关。K1：COOH解离为 COO + H+的解离常数；K2：H3N+解离为 NH2 + H+的解离常数。其pI可从pK计算或测定(用酸碱滴定法测定)。 aa等电点的计算：只有一个解离基团的物质AH，其解离常数与pH的关系为pH=pK+lg(A-/AH).证明：AH A+H+ K=A-* H+/AH H+=K*

8、AH/ A-=K/（A-/AH）-lg H+=-lgk-lg（A-/AH） 即：pH=pK+lg（A-/AH）Henderson-方程。当有一半解离时，即 A-=AH时，pH=pK，即溶液的pH可由其溶质的解离常数与解离量计算而得，溶质的解离常数可查得。pK：解离常数K的负对数。aa可看作二元弱酸（酸性条件）有两个可解离的H+其分步离解如下： K1（+OH）在充分酸的条件下 RCHCOOH RCHCOO + H+ NH+3 NH+3 （R+） （R0） K2 RCHCOO RCHCOO + H+ NH+3 NH2 （R0） （R）R0H+R0H+ R+ R+= K1= K1 R0=R+ 时K1

9、=H+R-H+ K2R0K2= R = R0 H+ 用NaOH滴定到R0 = R时K2 =H+等电点时：aa处于两性离子状态，可有少量解离成阳离子和阴离子，但解离成阳离子和阴离子的数目和趋势相等。即：R=R+ 即 R0H+ / K1=K2R0 / H+ H+2= K1* K2 H+2=K1 K2 lgH+=pH；lgK1=pK1； lgK2=pK2 两边取负对数得2×lgH+lg K1lgK2即： pH= pK1 + pK2 / 2 = pI 分子的存在状态是多种多样的，但在一定条件下以某一状态为主。即aa的等电点pI就是两性离子(R0)两侧的pK值的平均值。基团的pK值可查得，故p

10、I值可由二pK值计算得之。对于有三个解离基团的aa，如Asp、Lys只要取其兼(两)性离子两侧的pK值的平均值即得pI值。COOH COO COO CH NH+3 K1 CH NH+3 K2 CH NH+3 K3 Asp= CH2 CH2 CH2 COOH COOH COO Asp+(R+) Asp0(R0) Asp（R）等电点时Asp主要以兼性离子R0存在，(R+)与（R）很小且相等（等电状态为理想状态，pI为理论值）。pI=（pK1+pK2）/ 2 同上赖COOH COO COO COO CHNH+3 K1 CHNH+3 K2 CHNH2 K3 CHNH2 （CH2）4 （CH2）4 （C

11、H2）4 （CH2）4 NH+3 NH+3 NH+3 NH2 （R2+） （R+） （R0） （R）pI=（Pk2+pK3）/ 2 因R2+可忽略不计（pI时可认为它是不存在的，否则就不是等电状态了）。NH2比NH2碱性强，结合H+能力大，结合后不易放出H+（因受COOH影响小）。3. 氨基酸的化学性质：与强酸、强碱都可生成盐（铵盐与羧酸盐）如 谷氨酸钠与水合茚三酮的反应 80-100的条件下，首先使aa氧化脱羧脱氨形成醛，而本身被还原成还原型茚三酮，然后还原型茚三酮、氨和另一分子的水合茚三酮缩合形成蓝紫色的二酮茚二酮茚胺，这是aa 定性定量测定的基础，反应如下ONHOOOHOHOOHOOOO

12、NHOHOOO3H2O+ NH3 + （二酮茚-二酮茚胺 紫兰色 吸收峰 570nm ）Pro、羟Pro生成黄色物质(因为无氨基) 用于比色、测定、层析、电泳的显色剂。因为产生CO2 ，也可用CO2气体分析法测定aa（只限于-氨基酸），肽和蛋白也有此反应，肽越大灵敏度越差。与亚硝酸的反应（aa的NH2基被氧化成 OH），+NH3N被氧化成N2，HNO2N被还原为N2，等量进行。所以N2一半来自HNO2（其他伯氨基均可）。生成N2的反应叫van slyke（范斯莱克）反应。可测N2量（体积）计算氨基的含量。用于测定蛋白质的水解程度。 与甲醛的反应：酸碱滴定没有适宜的指示剂（因为等当点过高或过低）

13、。其氨基可与甲醛反应（加成），生成N羟甲基或N，N二羟甲基aa。使NH+3变为NH2释放出H+。使溶液酸性增强，可用NaOH滴定之。与NH2的含量相当，即aa含量。这就是aa的甲醛滴定法，（滴定到放出的H+被中和时的 pH为终点）。RCHCOO RCHCOO+H+ +NH3 NH2 +HCHO RCHCOO NHCH2OH +HCHO RCHCOO N(CH2OH)2与2，4二硝基氟苯的反应（胺与卤代烷的反应）NH3的烷基化，生成黄色DNPaa，不被酸水解。也可用之测肽和蛋白质的N端aa，反应后酸解得N端的DNPaa，有机溶剂提取分离，层析与标准氨基酸对比即可鉴定之。 O2NFNO2NCH3O

14、=S=OH3CClDNFB 丹磺酰氯 Sanger试剂 （5二甲氨基萘磺酰氯）O2N NF NO2O2NF NO2 R H R + H2NCHCOOH CHCOOH 因为丹磺酰aa有强烈的荧光，所以可用荧光光度计测定。（均在试剂与NH2之间脱去卤化氢）均称 Sangar反应。DNFB亦可与非氨基反应,如可生成：DNP-鸟氨酸。+aaS RNHCNHCHCOOHCONCNHCHSRN=C=S与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应，称艾德曼反应（Edman）反应：弱碱性条件下，形成苯氨基硫甲酰aa(PTC aa)，在无水酸（硝基甲苯中与酸作用）环化为苯乙内酰硫脲氨基酸（简称PTH或PTH-氨基酸）。PT

15、H在无水酸中极稳定。PTC基的引入使紧接着的肽键减弱，所以在无水酸中只切下之（环化断裂同时发生）PTHaa在紫外区有强吸收。Vmax=268nm.PTHaa可用各种层析技术分离，紫外分析测定与标准PTHaa对比即可知为何种aa（N 末端），多肽、蛋白的N 末端aa也可与PITC反应，不断重复可得蛋白质aa顺序，多肽的aa顺序自动分析仪，即以此原理设计而成。一次可测60多个aa。7. 成肽反应：肽即氨基酸脱水缩合而成的化合物RCHCOOH + H2NCHCOOH RCHCONHCHCOOH NH2 R NH2 R二肽、三肽含一个自由的氨基与羧基，还可缩合为多肽蛋白质 活性肽：谷胱甘肽GSH *G

16、lu的r羧基Cys的氨基缩合成r肽键： SHCOOH O CH2 O HCH （CH2）2 C NH CH C NH C COOHNH2 2H H GSSG（氧化还原酶的辅酶 SH）催产素与加压素（激素类）：前者使子宫与乳腺平滑肌收缩二者只有两个aa不同：3Ile 3Phe 8Leu 8Arg 所以有催产和促排乳作用，后者则使血管平滑肌收缩使血压升高（也使肾小球血管收缩形成尿减少）（也是血压升高的原因之一）。所以也叫抗利尿激素，也与学习的记忆过程有关。均由下丘脑合成，神经垂体分泌入血H3N+S67 8 99肽O CysS TyrPheGlnAsnCysPro Arg GlyCNH2 升压素 C

17、端Met 脑啡肽：许多有镇痛作用： C端Leu（ Leu脑啡肽已人工合成） 似吗啡有镇痛作用但不上瘾 （5肽）TyrGlyGlyPheMet 促肾上腺皮质激素（ACTH 39肽，脑垂体分泌）、 胆囊收缩素（33肽，十二指肠分泌）括约肌收缩，胆汁分泌减少引起厌食(减肥) 胰高血糖素(29肽，胰岛-细胞分泌)使糖原降解，血糖升高，与胰岛素相反。8 与荧光胺反应（氨基）：产物具有荧光 RN CHCOOH + CO2OOOO +aa OHO 荧光胺 荧光产物（被390nm光激发，发射475nm的荧光）ng级9. 与5，5/双硫基双（2硝基苯甲酸）反应 测半胱aa （Cys） 等的游离SH含量，生成含S

18、H的硝基苯甲酸产物OD412nm有一吸收峰可测之Cys的含量。SNO2COOH SHOOCNO2SNO2COOHCH2 CH COO SH NH+3 + H Cys 5，5/双硫基双（2硝基苯甲酸） 硫代硝基苯甲酸 Cys与抗性有关 (吸收峰412nm)（三）aa制备与分析 （可略）制备： 蛋白水解：毛发水解（H+） 胱aa、半胱氨酸 发酵：Glu菌发酵 Glu钠 化学合成： 酮酸 + NH3 aa 分 离：层析与电泳 第三节 蛋白质的结构蛋白质多肽链可分为四级结构。一、蛋白质的一级结构：其aa种类、连接方式及排列顺序，包括二硫键(共价键)。H2NCHCONHCHCONHCHCONHCHCOO

19、H R1 R2 R3 RnNHCHCO （称为aa残基） R 成环则无书写： N端(氨基末端)：有氨基的一端写在左边用H表示 C端(羧基末端)：有羧基的一端写在右边用OH表示连接方式：CONH。SS与稳定肽链的空间结构和生物活性有关如胰岛素：51aa（分子质量5734）21A+30B 6 7 7 11 19 20 21 OH H H OH 研究方法：测定蛋白质的aa序列。Edman法一次只能测定60-70个aa残基的肽段 单条肽链测定如下：1.测定aa组成。酸解、碱解，可避免多肽链的aa丢失。（测分子量确定aa个数 氨基酸残基的平均分子量为120）2.测N、C末端aa 。DNFB法等，确定肽链

20、的数目，（羧肽酶A释放除Pro、Arg和Lys的所有C末端残基，羧肽酶B只水解Arg和Lys为C末端残基的肽键，二者合用）3.用两种以上的方法将蛋白质断裂为不同的肽段。如用不同的酶水解。4.分离各肽段，并测出它们的序列。Edman法5.根据各肽段的重叠部分推出蛋白质的全部aa排序。也可DNA测序后反推。 关键是小肽段aa顺序的测定：Edman反应（降解法）与外肽酶酶解法。如：某十肽，用胰凝乳蛋白酶酶解得4个小肽：A1:AlaPhe；A2:GlyLysAsnTyr； A3:ArgTyr；A4:HisVal 胰蛋白酶酶解得3个小肽：B1:AlaPheGlyLys； B2:AsnTyrArgB3:T

21、yrHisVal.根据重叠结构拼接为： AlaPheGlyLysAsnTyrArgTyrHisVal(可直接Edman法)如果含两条以上的肽链先拆分成单链，若含二硫键需先拆开：过甲酸氧化形成二个半胱氨磺酸(或用-巯基乙醇还原后用碘乙酸保护-形成羧甲基衍生物)：HCOOOH-CH2-S-S-CH2- -CH2-SO3H + -CH2-SO3H 含SO3H，分析时即知SS的位置（可先水解成只含一个或少量SS的小肽段，以便确定SS的准确连接位置）。二硫键位置的确定（另取一份样品） + + - 熏蒸 一般用蛋白酶水解带有二硫键的蛋白质，从部分水解产物中分离出含二硫键的肽段，再拆开二硫键，将两个肽段分别

22、测序，再与整个多肽链比较，即可确定二硫键的位置。常用胃蛋白酶，因其专一性低，生成的肽段小，容易分离和鉴定，而且可在酸性条件下作用（pH2），此时二硫键稳定。肽段的分离可用对角线电泳，将混合物点到滤纸的中央，在pH6.5进行第一次电泳，然后用过甲酸蒸汽断裂二硫键，使含二硫键的肽段变成一对含半胱氨磺酸的肽段。将滤纸旋转90度后在相同条件下进行第二次电泳，多数肽段迁移率不变，处于对角线上，而含半胱氨磺酸的肽段因负电荷增加而偏离对角线。用茚三酮显色，分离，测序，与多肽链比较，即可确定二硫键位置。 提取 DNA测序后反推蛋白：蛋白质抗体 蛋白mRNA 反转录 cDNA测序反推（见后一章）。 第三节 蛋白

23、质的结构多肽链可分为四级结构。一、蛋白质的一级结构：其aa种类、(共价)连接方式及排列顺序，应包括二硫键。二、蛋白质的空间结构多肽链按一定方式盘绕折叠，形成立体（空间）结构（各基团的作用力之故）。也称蛋白质的构象（或高级结构）：指蛋白质分子中所有原子在空间的排列及肽链的走向，以一级结构为基础。肽键及肽键平面，双键性质（不能自由旋转且比一般C-N键短，比C=N键长） O O O CCCNCCNC C=N O与H成反式 H H C H 亚氨基肽键中的4个原子CONH（羧基与另一aa的氨基构成）和与之相连的两个C原子都处于同一平面上。这个平面叫肽键平面，有部分单键的性质，只有C，C键可以旋转。多肽的

24、主链由许多肽键平面构成，平面可以C为顶点绕NC和CC键旋转，但受侧链基团的影响，只有少数的特定结构。所以肽链折叠有一定的限制，分为二、过渡、三、四级结构。1. Pr的二级结构：指多肽链本身的折叠与盘绕方式，驱使蛋白质折叠的主要动力来自各侧链基团及其与介质的相互作用（H键维持系统的能量平衡）。主要有螺旋结构、折叠、转角、无规则卷曲四种。1）螺旋结构：毛、发、羽毛中的角蛋白中的主要形式，多肽链盘绕成右手或左手螺旋（是由肽键平面绕C相继旋转一定的角度形成的）。典型的右手N 3.6aa残基为一圈，高0.54nm 0.54/3.6=0.15nm，3600/3.6=1000侧链R基伸向螺旋外侧相邻螺旋圈

25、C=O与亚氨基（ NH）氢间形成链内H键，每个残基的C=O 都与它后面的第四个 aa残基（隔三隔aa残基）形成H 键，氢键平行中心轴。 O H O H CNH C C N nS 3.613 (3×3)+4=13 3 Rs：形成氢键封闭（合）环内共价连接的原子数，几乎全为右手螺旋（也有极少数左手螺旋）。但整条肽链并非全是，如有Pro存在时，即中断（无H可形成H键）。带同电荷的aa出现在邻近位置上就会影响螺旋的形成，甘氨酸也不易形成螺旋。2） 折叠结构： O=C C N C纵向排列形成片层 N-HN N N N C N平行(角蛋白) 反平行(丝心蛋白) 折叠片层也可在同一肽链的不同部分之

26、间形成。凸起：折叠的一股弯曲使一个氨基酸残基突出出来不形成氢键。 3）转角 出现在180°回折角处，此处Gly、Pro多（侧链小才可形成），也叫发夹结构、回折、弯曲。 O H O H CNH C C N nS 310 (3×2)+4=10 2 4）自由回转（无规则卷曲）：无规则的松散结构。一种蛋白质中往往含几种二级结构2. 超二级结构与结构域：相邻的二级结构的组合体（构象单元）在空间上能与其它部分分开，、（靠近）、×（连接链连接平行的片层）、曲折（转角连接）、回形拓扑结构 × 曲折 左手超螺旋 希腊钥匙构象超二级结构无特定功能（只有一定的组合规则，在空间

27、上能辨认）。结构域：是球蛋白的折叠单位，超二级结构进一步盘曲折叠成球状的，在空间上独立（相对）的、具有部分（一定）功能的结构，较小的蛋白可能只有一个结构域，这时结构域等于三级结构，超二级结构与结构域在结构上很难区别（后者比前者更复杂）。结构域的类型：圆桶、螺旋束结构域（后二者）等转角相连3 78 62541 丙酮酸激酶 溶菌酶 肌红蛋白三级结构(单域) 由两个以上结构域组合成三级结构（可以是完整功能的蛋白质）。 每个结构域都有其功能，三级结构是指多肽链的所有原子在空间的排列与分布，如肌红蛋白的三级结构一条多肽链，非极性侧链埋于分子内部，极性基团分布在分子表面与水结合，所以具水溶性。有几个结构域

28、常常就有几个功能区，结构与功能的统一。两条以上肽链才有四级结构：分子量大的蛋白多由几条多肽链组成，它们以非共价键结合成一个功能单位，执行一个特定功能，其中一条肽链就称为该蛋白的一个亚基（Subunit）如血红蛋白由2、2亚基组成。 1 2以共价键连接的肽链不能称为亚基，如胰岛素A、B链以两个SS键相连。四级结构：就是指亚基之间的连接及空间排列，不包括亚基内部得空间结构，亚基单独存在无活性或活性很低，只有聚合成四级结构，才能有完整的生物活性。如血红蛋白只有2、2（141、146aa）=574个aa一起才能组成完整的功能单位。胶原蛋白：左手螺旋的多肽链缠绕成三股右手超螺旋的原胶原蛋白分子。胶原蛋白

29、。 三、蛋白质分子中的共价键与次级键（非共价键）一级结构由共价键维持：肽键（酰胺键），二硫键；空间结构由次级键（非共价键）维持：氢、盐键（离子键）、疏水键、范德华引力（包括H键）。二级结构主要是H键，三级结构主要是疏水力，盐键、范氏力也都起着重要作用（维持特定构象）。四、蛋白质分子结构与功能的关系 一级结构：结构决定功能，相同的功能有相同或相似的结构1. 不同动物的胰岛素大同小异（差异在A链：8、9、10、30位aa残基）。变化的aa不起决定（功能）作用；细胞色素C（呼吸链的重要组分）在动物间亲缘关系越近，差异越小，人与黑猩猩的差异小于人与鸡的差异。细胞色素C的结构中与之功能密切相关的部位在各

30、种动物中都是不变的（104个aa组成）。2. 关键部位结构上的一点变化，就会引起功能的显著变化。如：镰刀型贫血病。只是血红蛋白（2：141aa，2：146aa）的链的第六位Glu Val代替就使患者红细胞在缺氧时成镰刀状，易胀破、溶血，引起头晕、胸闷等贫血症状，都证明Pr结构与功能的统一性。 构象与功能的关系构象：即空间结构。指取代基团，因为单键旋转所形成的不同立体结构。别构现象：构象改变功能也随之改变的现象。血红蛋白与O2的亲和力是很弱的，但其一个亚基与O2结合后引起的构象改变，亚基间次级键破坏，使其它亚基与O2结合力变大，结合速度变快。氧结合曲线成S型 1 2氧饱和度氧饱和度 P(o2)

31、P(o2) 肌红蛋白的氧合曲线 血红蛋白的氧合曲线第四节 Pr的性质一、分子量大小：一般为1万100万主要测定方法：1. 超离心：在一定离心力下，分子量大沉降速度快。可用沉降系数来表示(正相关)。沉降系数：单位离心力下的沉降速度，cm/s/(cm/s2)单位（S：斯威伯格单位10-13秒）2. 凝胶过滤：分子筛作用。分子量越大过滤速度越快，用标准蛋白作标准曲线与之比较即可知未知蛋白分子量。3. SDS凝胶电泳：分子量与迁移率成反比，与标准样品比较。（因为SDS使各种蛋白的荷/质比均相同）。大多数蛋白质与SDS按1:1.4(W/W)的比例结合 SDS：十二烷基硫酸钠二、Pr的两性电离与等电点Pr

32、也是两性电解质：解离基团：末端的氨基与羧基、aa残基侧链上的氨基、羧基、咪唑基、胍基、SH等。 NH2 Pr COOH NH+3 H+ NH+3 H+ NH2 Pr Pr Pr COOH OH COO OH COO pH pI pI = pH pHpI 两性离子pI：使Pr所带的正电荷与负电荷相等，静电荷为零的溶液pH值。此时在电场中不移动，溶解度最小。pI：决定与Protein的aa组成，碱性aa多则pI大，否则小。电泳：带电物质在电场中移动的现象叫电泳。方向：取决于所带电荷的性质(正负)（后者又取决于溶液的pH值和蛋白质的氨基酸组成）。速度：取决于所带电荷的多少(正相关)和分子的大小(负相

33、关)（荷质比）混合蛋白的分离：电泳 自由界面电泳 电泳 纸上电泳 醋酸纤维薄膜电泳 区带电泳 凝胶电泳 圆盘电泳 平板电泳 等电聚焦电泳 免疫电泳在pH8.6的电泳缓冲液中（各蛋白最大pI为6.35-7.3）滤纸电泳血清蛋白的电泳图如下： 清蛋白 1 2 球蛋白 + 三、Pr的胶体性质大小：直径1100nm，胶体颗粒：布朗运动、丁多尔现象、电泳现象、不能透过半透膜，具吸附能力（分子大表面具电荷和非极性基团），可用玻璃纸、火棉胶等透析纯化（去除小分子杂质），是生产上和实验室常用的纯化方法。稳定蛋白质溶液的因素（不聚集成大颗粒而沉淀）：水化膜（层）与电荷pHpI四、Pr的沉淀反应1. 加高浓度盐盐

34、析：破坏蛋白质的水膜又中和其电荷。不同蛋白质所带电荷不同，所以，所需盐浓度不同，可分段盐析，（NH4）2SO4半饱和，球蛋白析出；（NH4）2SO4饱和，清蛋白析出（分子量小pI低），（只要pH 或pI可以认为所有的分子均带同样的电荷，所以，在一定pH下的盐析与分子量有关：越大越易沉淀，pI过低或过高中和其电荷所需盐浓度高）。2. 有机溶剂沉淀：极性有机溶剂与水的作用大于蛋白，破坏水膜，多同时调节pH使其接近pI(pI时消除了静电斥力)。多用乙醇。3. 重金属盐沉淀(pH 高于pI时)：蛋白质的重金属盐溶解度很小 。 沉淀4. 某些酸如：单宁酸、苦味酸、三氯乙酸等生成不溶性盐而沉淀（pHpI）

35、，并破坏分子内氢键，使疏水性氨基酸残基移至分子表面，各分子靠疏水力结合。5. 加热变性沉淀：破坏分子内氢键，疏水基团外露，与水亲和力减弱，水溶性降低，水化膜破坏。如制豆腐：加热大豆蛋白的浓溶液，并加入MgCl2（盐卤）使蛋白凝固。制取蛋白并保持其生物活性：盐析、低温下加有机溶剂沉淀，有机溶剂在高温或长时间接触会使蛋白质变性。五、蛋白质的变性：理化因素影响，使空间（次级）结构，理化性质和生物学性质改变(但一级结构并未破坏)的现象。变性蛋白质的特点：卷曲的肽链 伸展，构象破坏；生物功能丧失：酶的催化能力、血红蛋白的运O2能力、胰岛素调节血糖的功能。溶解度降低、丧失结晶能力。因肽链松散，易被蛋白酶消

36、化。变性因素：化学变性因素：强酸、强碱与尿素、胍盐、乙醇、重金属。物理变性因素：超声波、紫外线、加热、震荡与搅拌。变性的本质：次级结构破坏，但一级结构没破坏，所以分子量和组成不变。可逆或不可逆，胃蛋白酶的升温(80-90)与降温(37)可使活性可逆变化。应用：制作豆腐、尿蛋白检验(加热)、急救重金属中毒病人(给中毒病人吃大量乳品、浓豆浆或蛋清，然后催吐)等。制备蛋白与酶应防变性：应用低温等。六、蛋白质的颜色反应（分析测定的依据）1. 双缩脲反应（要求含两个以上肽键）O O 在碱性条件下能与CuSO4反应生成红紫色的络合物，具有双缩脲结构的物质都有此反应（二脲加热脱氨形成双缩脲：H2NCNHCN

37、H2）与Cu +形成络合离子（两侧的氨基），540nm有吸收峰。O O CNHCHCNH ：含两个肽键的结构与双缩尿相似。2. 米伦（氏）反应：米伦试剂：硝酸、硝酸汞、亚硝酸与亚硝酸汞的混合液（millon,reaction/反应）与蛋白质相遇产生白色沉淀(加热后则呈砖红色)，酪aa等含酚基化合物都有此反应。 3. 乙醛酸的反应（Trp）将浓H2SO4加入蛋白质与乙醛酸的混合液，H2SO4与混合液成两层，两层间出现紫色环，为Trp与乙醛酸的缩合物，不含Trp的白明胶无此反应。浓H2SO4提供反应条件。4. 坂口反应（精aa的胍基）Arg的胍基与次氯（溴）酸钠及萘酚在碱性条件下反应生成红色产物，可用于鉴定含Arg的蛋白及测定 Arg的含量。5. 酚试剂（碱性CuSO4及磷钨酸钼酸）反应酚基（Tyr）可还原磷钼酸及磷钨酸为兰色的钼蓝与钨蓝。6. 与水合茚三酮反应生成蓝紫色物质（似aa）7. 黄色反应：Phe、Tyr的苯环与硝酸生成黄色的硝基苯化合物。8. 与醋酸铅反应生成黑色的硫化铅沉淀（Cys与胱aa含量）9. 与考马斯亮蓝显色（5