硕士研究生分子生物学实验讲义

1、分子生物学实验讲义（硕士研究生试用）山西医科大学基础医学院生物化学与分子生物学实验室2010.6实验一 动物组织蛋白质的提取【目的要求】1掌握动物组织蛋白质的提取方法。 2了解动物组织蛋白质提取的原理。【实验原理】 由于蛋白质种类很多，性质上的差异很大，即或是同类蛋白质，因选用材料不同，使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质。蛋白质在不同溶剂中溶解度的差异

2、，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用，将细胞内蛋白质提取出来，并与其它不需要的物质分开。但动物材料中的蛋白质有些以可溶性的形式存在于体液（如血浆、消化液等）中，可以不必经过提取直接进行分离。蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。蛋白质经细胞破碎后，用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来，再用

3、离心法除去不溶物，即得粗提取液。【试剂器材】1 实验小鼠2 0.9%NaCl3 动物组织蛋白裂解缓冲液Tris 50mMNaCl 150mMEDTA 0.5mMDTT 1mMTriton X-100 1%去氧胆酸钠 0.5%SDS 0.1%4 PMSF/异丙醇储备液 100mM（174mg/10ml）于-20储存5 -20储存的冰块【操作步骤】1. 颈椎脱臼处死小鼠，75%酒精擦拭皮肤，剪开腹部，剪切肝脏组织，称取0.6g，置于含预冷0.9%NaCl（6mL）的平皿中。2. 在平皿中剪碎肝脏组织，并转移到匀浆器中。3. 在预冷的裂解缓冲液中添加PMSF/异丙醇储备液（20L/2mL）。4. 迅

4、速将2mL 预冷的裂解缓冲液加入匀浆器中，冰浴条件下充分研磨。5. 将组织研磨液转移到1.5mL的离心管中，于4离心（1 4000rpm，10min）。6. 离心完毕吸取上清液转移至一新的1.5ml离心管中，即为组织蛋白粗提取液。7. 所获蛋白提取液可保存于-20用于后续实验或用考马斯亮蓝等方法进行蛋白质浓度测定后保存备用。【注意事项】在整个制备过程中使组织始终处于冰浴状态，以防蛋白质的降解。实验二 蛋白质的定量（Bradford法）【目的要求】掌握考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)法测定蛋白质含量的原理和方法。【实验原理】考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度是利用蛋白质与染

5、料结合的原理，定量测定微量蛋白质浓度，具有快速、灵敏的特点。考马斯亮蓝G-250存在两种不同的颜色形式：红色和蓝色。当染料与蛋白质结合后由红色转变成蓝色形式。蛋白质与G250的结合是通过范德华力实现的，并且在一定浓度范围内二者的结合显色符合朗伯-比尔定律。结合后的产物在595nm处具有最大吸收峰，通过对溶液的光吸收测定可获得与其结合蛋白质的量。【试剂器材】1. 考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G-250 100mg溶于25mL甲醇中，加入800 mL蒸馏水，再加入 100 mL 85磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL，滤纸过滤。2. 标准蛋白质溶液（1mg /mL）：牛血清白蛋白100mg，加0.9N

6、aCl至100 mL。3. 试管及试管架，吸管。4. 比色计。【操作步骤】 一、 标准曲线的制备：取5支试管，编号，按下表操作编 号 1号液 2号液 3号液 4号液 5号液标准蛋白质溶液（mL） 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0（1mg /mL）0.9NaCl（mL） 0.8 0.6 0.4 0.2 蛋白质浓度 200 400 600 800 1000（g /mL）另取6支试管，编号为05，按下表操作 编 号 0 1 2 3 4 5 1号液 2号液 3号液 4号液 5号液 不同浓度蛋白质溶液（mL） 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.9NaCl（mL） 0.1 考马斯亮蓝试剂（

7、mL） 5 5 5 5 5 5 蛋白质含量（g） 0 20 40 60 80 100 混匀各管，室温下静置10分钟，于595 nm处进行比色。二、 绘制标准曲线：以A 595 nm为纵坐标，标准蛋白质含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。三、 测定未知样品蛋白质浓度：测定方法同上，取适量未知样品，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A 595 nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白质的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度。【注意事项】1 在考马斯亮蓝试剂加入后的520分钟内测定光吸收，因为在此段时间内颜色最稳定。2 测定中，蛋白染料复合物会有少量吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸

8、附量是可以忽略的，测定后可用乙醇将比色杯洗干净。实验三 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳【目的要求】1.了解并掌握SDS-PAGE电泳原理及方法。2.掌握垂直板电泳的操作方法。【实验原理】十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳可根据蛋白质分子大小的差别分离蛋白质，并可测定蛋白质的相对分子量，其原理主要与电泳过程中存在的特殊物理效应有关：1凝胶的分子筛效应：聚丙烯酰胺凝胶是在催化剂的作用下聚合而成的具有网状立体结构的微孔凝胶，蛋白质颗粒在电场中通过此凝胶时，会受到阻碍。大分子蛋白质受到的阻力大，电泳速度小，而小分子蛋白质受到的阻力小，移动快，因而最终在凝胶中得以分离。2电荷效应：SDS

9、是一种表面活性剂，在蛋白样品和PAGE凝胶中加入SDS，则能与蛋白质分子上的疏水基团结合，使蛋白质表面覆盖一层SDS分子。由于十二烷基硫酸根带有大量负电荷，且电荷量远远超过蛋白质分子原有的带电量，因而掩盖了蛋白质分子本身的电荷差别，使各种SDS-蛋白质复合物都带有均等密度的负电荷，分子之间的电荷差异消失。 3变性效应：SDS同时还破坏了蛋白质中的非共价键，导致蛋白质变性，使SDS-蛋白质复合物在溶液中呈现相似的形状。因此，蛋白质在SDS-PAGE凝胶中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而主要取决于分子量的大小。在进行SDS-PAGE电泳时，同时使用蛋白质分子量标准样品，则可以在电泳

10、完毕后根据标准分子量大小得知样品蛋白质的相对分子量。4凝胶对样品的浓缩效应：SDS-PAGE使用一种不连续的缓冲系统，即分为低浓度的浓缩胶和较高浓度的分离胶，配制这两种凝胶所用缓冲液的pH值和离子强度也不相同。电泳时，样品中的SDS-蛋白质复合物首先经过浓缩胶，体积得到极大的浓缩，然后再经过分离胶被分离。SDS-PAGE凝胶已经成为实验室常用的蛋白质分离方法，通常被用于蛋白质制品纯度的鉴定和蛋白质分子量的测定。【试剂器材】130%凝胶贮备液 称取 30g 丙烯酰胺和N，N-亚甲双丙烯酰胺0.8g，用去离子水配制成100ml 的溶液，过滤，贮存于棕色瓶中，4冰箱保存。210%凝胶贮备液 称取10

11、g丙烯酰胺和N，N-亚甲双丙烯酰胺0.5g，用去离子水配制成100ml 的溶液，过滤，贮存于棕色瓶中，4冰箱保存。310% SDS 用去离子水配制，贮存于室温中。41% TEMED（N,N,N,N-四甲基乙二胺）。510% 过硫酸铵 用去离子水在临用前配制。6Tris-甘氨酸电泳缓冲液（pH 8.3）： Tris 6.0g甘氨酸 28.8g10% SDS溶液 10 ml用蒸馏水定容至 1000ml71.5 mol/L pH 8.8 Tris-HCl 缓冲液 称取Tris 181.5g，加适量蒸馏水溶解，用浓HCl调节pH值至8.8，加蒸馏水至1000 ml。80.5 mol/L pH6.8 T

12、ris-HCl 缓冲液 称取Tris 60.6g，加500ml蒸馏水溶解，用浓HCl调节pH值至6.8，加蒸馏水至1000 ml。90.05mol/L pH 8.0 Tris-HCl 缓冲液 称取Tris 6.1g，加500ml蒸馏水溶解，用浓HCl调节pH值至8.0，加蒸馏水至1000 ml。102样品缓冲液： 蔗糖 4g溴酚蓝 2mg10% SDS溶液 2ml5% 巯基乙醇 0.5ml0.05mol/L Tris-HCl（pH 8.0） 2ml用蒸馏水定容至 10.0ml110.25%考马斯亮蓝R250 将2.5g考马斯亮蓝R250溶解于450 ml 甲醇中，再加入450ml蒸馏水和100

13、ml 冰乙酸，混匀，过滤除去颗粒物质。12洗脱液 将50ml 甲醇和75ml 冰乙酸溶解于875ml蒸馏水中，混匀。13预染蛋白质分子量标准:117kD、90kD、49kD、35kD、26kD、19kD共6种蛋白质14电泳槽、电泳仪、扫描仪、染色缸、摇床、一次性手套、微量加样器等。【操作步骤】1 制备凝胶（1）准备玻璃板，洗净、晾干。按电泳槽使用说明装好，按下表配制12%分离胶溶液和5%浓缩胶溶液： 表3-1：浓缩胶与分离胶的配制溶液成分 12%分离胶溶液(ml) 5%浓缩胶溶液(ml)30% 凝胶贮备液 4.0 10% 凝胶贮备液 2.51.5 mol/L pH 8.8 Tris-HCl 2

14、.5 0.5 mol/L pH6.8 Tris-HCl 1.2510% SDS 0.1 0.051% TEMED 0.8 0.4蒸馏水 2.5 0.7510% 过硫酸铵 0.1 0.05 总体积 10.0 5.0（2）小心将分离胶注入准备好的玻璃间隙中，并为浓缩胶留有空间。轻轻在顶层加入几毫升去离子水，以阻止空气中的氧对凝胶聚合的抑制作用。（3）凝胶聚合后，倒掉上层水，用滤纸吸干凝胶顶端的水。（4）按表3-1配制浓缩胶，注入分离胶上端，插入梳子，应小心避免产生气泡。2点样（1）待测蛋白样品的制备：若样品为水溶液，且蛋白质含量大于10 mg/ml，可将待测液与样品缓冲液等体积混匀，100加热3m

15、in。（2）浓缩胶聚合后，拔去梳子，将凝胶放入电泳槽中；在上、下槽中加入电泳缓冲液。（3）将样品混合液、标准蛋白按次序加入梳孔中。3电泳 起始电压为8V/cm，当染料进入分离胶后，将电压调至15V/cm，继续电泳至溴酚蓝到达分离胶底部，关闭电源。4染色 取下凝胶，将凝胶浸泡于考马斯亮蓝染色液中，在摇床上室温缓慢摇动3060min。5脱色 换洗脱液，于摇床上室温缓慢摇动12 小时，其间更换12次洗脱液。洗脱后的凝胶可以照像或干燥，也可置于含有20%甘油的水中密闭保存。【注意事项】1SDS-PAGE电泳要求样品的离子强度尽量要低，如果离子强度过高，应经透析或离子交换除盐后再进行电泳。2丙烯酰胺试剂

16、是一种神经毒素，可通过皮肤吸收，会因多次积蓄而中毒。操作时应极其小心，需要带一次性手套。3上样量以1015l为宜，如果样品蛋白含量过少，为保证区带清晰，可增加上样量，同时应将样品缓冲液浓度提高二倍或更高。 4溴酚蓝染料是指示剂，为电泳时可见的迁移标志物。5凝胶聚合的时间与温度有关，夏天聚合快，可置于冰浴中减慢聚合；冬天室温低，可放入温箱中加快聚合。实验四 蛋白质转印实验（半干式）【目的要求】1掌握半干式蛋白质转印技术的基本操作。 2掌握蛋白质转印后的检测方法。【实验原理】 蛋白质印迹（Western blotting）是将蛋白质电泳分离技术与免疫标记技术结合所形成的一种鉴定特异性抗原的方法。蛋

17、白质转印应先将含某抗原的蛋白混合物进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳，使各种蛋白成分根据分子量的不同分离开来；再通过电转移将各种蛋白成分转印到硝酸纤维素膜（NC）或PVDF膜上；通过特异试剂（抗体）作为探针，与膜上的相应抗原发生结合，再与酶标记的抗Ig 抗体结合，洗涤后加入底物进行显色。根据显色条带的位置和深浅，可以对抗原及其分子量或相对含量进行检测。蛋白质的Western 印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种优点，可检测到低至1-5ng的靶蛋白。本实验的主要目的是采用半干式电转移将SDS-PAGE凝胶电泳分离后的蛋白质从凝胶转移至固相支持材料上。裁剪

18、与凝胶一样大小的硝酸纤维素膜，用去离子水浸湿后，再浸入转移缓冲液内，随后取出进行转移（半干式电转移在室温操作，所需时间较短）；将凝胶及与之相贴的硝酸纤维素膜夹于事先用转移缓冲液浸泡过的滤纸之间，平放在电转仪上，负极在上，正极在下，凝胶在阴极端，薄膜在阳极端，转移方向从阴极到阳极；根据凝胶面积设置电流，室温下进行转移；转移结束，取出薄膜，丽春红染色检测转印效果。【试剂器材】1 半干式电泳转印槽2 硝酸纤维素膜3 滤纸 4 转移电泳仪5 培养皿 6 万向旋转摇床7 转印缓冲液【操作步骤】 1 将电泳后的SDS-PAGE 凝胶浸在转印缓冲液中，洗10 min。2 去掉浓缩胶，测量剩余胶的尺寸大小。3

19、 剪1张和胶大小一致的硝酸纤维素膜，用铅笔在膜的右下角做一个标记，用于定位。剪6张和胶大小一致的滤纸（尺寸一定不能大于胶的尺寸，否则多出的部分会在胶的边缘接触，形成短路，导致转移不充分）。 4 将膜及滤纸在转印缓冲液中浸润10 min 。5 将3张湿滤纸放到半干电转仪的底部平板电极上（负极），然后依次放置胶、硝酸纤维素膜、滤纸（3张），注意堆放整齐，同时注意每层之间避免气泡存在，一般可用试管碾压赶走气泡（注意：一旦胶和膜接触，位于胶表面的蛋白就会结合到膜上，所以胶一定要一次成功，不要试图调整胶的位置，否则蛋白质色带可能会印上去，最后产生重迭影像）。6 待所有的膜和胶都放好后，盖上转印仪的上盖，

20、让上部的平板电极压紧由滤纸、膜、胶形成的三明治结构（注意正负极，转印结束后，才可以打开上盖）。7 连接转移电泳仪，电流通常设为1 mA/cm2左右。8 cm X 7 cm的胶通常使用100 mA恒流转移。大胶必须限制电流在0.8 mA/cm2，防止电流过大，产生过多热量，影响转印。转印时间如下表所示。表4-1转印时间和蛋白分子量的关系*分子量 (MW)转印时间 80 kDa90 分钟* 以8X7 cm的迷你胶在100 mA恒流的条件为例8 转印结束，取出转印三明治，打开后依次取出转印膜及凝胶。9 将转印膜浸入丽春红染色液中，观察是否有红色蛋白条带出现；转印后的凝胶可以进行考马斯亮蓝染色，看有无

21、蛋白质残留；若电泳时加有预染标准蛋白质marker ，则可在转印膜上看到相应色带，帮助确定转印成功，并可评估转印效率。10 若继续进行免疫杂交实验，则用去离子水漂洗转印膜后可进行封闭。【注意事项】1. 不要切去胶的一角以作标记，因为这样容易导致短路或转移不充分。尽可能在电泳结束后就进行转印，防止样品在胶内弥散开来。2. 丙烯酰胺浓度越低，蛋白越容易转移下来。所以应选择可以分离蛋白最低浓度的凝胶进行电泳。梯度胶适用于转印一系列不同大小的蛋白，因为凝胶的孔与不同大小的蛋白匹配良好。3. 蛋白质结合到硝酸纤维素膜上主要是通过疏水键，对于常规使用效果非常好。但对于小的多肽，建议使用小孔径(0.2 m)

22、的膜。 4. PVDF膜比硝酸纤维素膜更疏水，在转印过程中结合蛋白更紧密，可以耐受更多的SDS。目前，PVDF膜一般比硝酸纤维素膜需要更严谨的封闭条件，适用于蛋白测序。尼龙膜通过疏水和静电相互作用结合，其SDS耐受度甚至高于PVDF膜，但也需要更严谨的封闭条件，主要建议用于Northern和Southern杂交。实验五 质粒DNA的提取（碱裂解法）【目的要求】1掌握碱裂解法制备质粒DNA的原理和方法, 进一步认识质粒 DNA 的性质。2初步掌握分子克隆基本操作技术。【实验原理】质粒（plasmid），是能在染色体外自我复制的稳定共生型遗传单位，主要存在于细菌、放线菌、真菌和某些动植物细胞中。它

23、能在细菌中垂直遗传，且保持稳定的拷贝数，赋予宿主细胞某些特殊的表型。迄今为止从细菌中分离得到的质粒都是双链闭合环状DNA分子, 大小为1 kb200 kb。在基因工程研究中，质粒是最常用的一种基因克隆载体，用于运载外源基因进入宿主细胞。因此，质粒DNA的提取和纯化是分子生物学技术中的一项基础工作。质粒DNA提取的关键是要与细菌染色质DNA分开。常用的提取方法有煮沸法、碱裂解法、去污剂法、有机溶剂法和溶菌酶法等, 不同方法各有利弊，应根据不同质粒的性质、不同宿主菌的特性及后继的纯化方法等多种因素综合加以选择。一般以碱裂解法最为常用，因为它对细菌的裂解完全，对染色质DNA和蛋白质的变性充分，因而所

24、提取的质粒DNA产量高、纯度高。但如果碱变性时间过长，有可能会导致质粒DNA变性，导致随后的内切酶酶切困难。碱裂解法提取质粒DNA的主要原理和步骤是：1接种含质粒的单个菌落到培养基中过夜培养。随着细菌的生长, 质粒DNA也随之自主复制。必要时，可以在细菌生长后期在培养基中适量加入氯霉素，以抑制宿主细胞的蛋白质合成和染色质DNA的复制，细菌的数量不再增加，而质粒DNA的复制基本不受影响，从而大量扩增质粒DNA的拷贝数。2离心收集细菌。3加入强碱溶液裂解菌体，必要时可以适量加入溶菌酶。此时大分子量线状的细菌染色质DNA和蛋白质发生变性，而闭合环状的质粒DNA多数仍不变性，处于自然状态。4几分钟后加

25、入中和液，将pH值调至中性。在高盐浓度条件下，大部分染色质DNA与蛋白质不能复性，交连成不溶性网状结构，在去污剂SDS的作用下形成絮状沉淀。而质粒DNA分子量小，且为闭合环状结构，少数变性的质粒DNA也能够迅速复性，呈溶解状态。5离心，去除大部分细胞碎片、染色质DNA、RNA和蛋白质。质粒DNA保留在上清中。6最后再用RNA酶消化，酚/氯仿抽提、透析和乙醇（或异丙醇）沉淀等方法进一步去除残余蛋白质和核酸，纯化质粒DNA。【试剂器材】1LB培养基：蛋白胨10 g, 酵母抽提液5 g，NaCl 10 g, 加蒸馏水至1 000 mL, 用NaOH调pH至7.5 , 高压蒸汽消毒20 min。2I号

26、液：50mmol/L 葡萄糖，25mmol/L TrisCl（pH 8.0），10mmol/L EDTA（必要时在使用前加溶菌酶4mg/mL）3II号液：0.2mol/L NaOH，含1%SDS（II号液必须在实验时新鲜配制）4III号液：5mol/L KAc 60ml，冰醋酸11.5ml，水28.5ml（含3mol/L钾，5mol/L醋酸，pH4.8）5RNase：10mg/mL 20保存备用6TE：10mmol/L TrisHCl(pH 8.0)，1mmol/L EDTA(pH 8.0)。高压灭菌20min，4保存备用。7STE ：0.1mol/L NaCl，10mmol/L TrisCl

27、 （pH 8.0），1mmol/L EDTA8酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）9乙醇（无水乙醇、70%乙醇），-20保存备用10台式低温高速离心机11涡旋混合器（Vortex）121.5ml eppendorf离心管（灭菌）13移液器【操作步骤】1培养：在5ml含适当抗生素的LB培养液中接种含质粒的单个菌落，37，150rpm振荡培养过夜。2收菌：取1-1.5ml培养液于1.5ml Ependorf管中，5000rpm离心3分钟，弃上清，收集细菌。3重悬：弃上清，在沉淀中加入预冷的I号液 100l，vortex强烈振荡，充分悬浮菌体。4裂解：加新鲜配制的II号液200l，立即温和颠倒离心管5

28、次，混匀。置冰水浴中3-5分钟。5中和：加入150l预冷的III号液，立即温和颠倒混匀数次，混匀。置冰水浴中3-5分钟。6沉淀：12 000 rpm离心10分钟，取上清液置新Ependorf管中。7酚/氯仿抽提：加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），振荡混匀，12000rpm离心2分钟。取上清液（小心不要吸到中间蛋白膜），转入另一个Eppendorf管中。8氯仿抽提：加入等体积的氯仿，振荡混匀，12000rpm离心2分钟，取上清液转入另一个Eppendorf管中。 9乙醇沉淀：加入2倍体积的无水乙醇（或0.6倍体积异丙醇），混匀，室温放置10分钟。4，12000rpm离心5分钟。10

29、洗涤：弃上清，沉淀用70%乙醇洗涤，4，12000rpm离心2分钟。11干燥：弃上清，用消毒滤纸条小心吸净管壁乙醇滴。将Eppendorf管倒置于滤纸上，室温蒸发乙醇10分钟。 12溶解：加入20l TE（含无DNA酶的RNA 酶20g/ml），温和振荡2分钟。置于20冰箱保存。实验六 聚合酶链反应（PCR）体外扩增DNA【目的要求】掌握PCR的基本原理与实验技术。【实验原理】聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种通过体外酶促反应大量、快速、选择性地合成目的DNA片段的核酸合成技术，具有高度特异性、操作简单、高效快速、灵敏度高等特点，是最常用的分子生物

30、学技术之一。图6-1：PCR原理示意图PCR的基本原理如图6-1所示。PCR反应体系主要由以下5种成分组成：与目的基因上下游互补的两条单链DNA引物（primer）、含目的基因片段的模板DNA、耐热DNA聚合酶、四种dNTP底物和缓冲液。经过约94的热变性（使双链DNA模板解离为单链）、3760退火（使引物与模板特异性结合）、72延伸（在DNA聚合酶的催化下合成DNA互补链）三步反应为一个循环。每循环一次，目的基因片段数量即大约增加1倍（理论值为2n），而每一次循环所产生的DNA又成为了下一次循环的模板。通过2030次变性、退火、延伸三种温度的循环，目的基因片段的数量可以在几个小时内以指数形式

31、扩增上百万倍。因此可以迅速地从极其微量的样品（如一根毛发、一滴血）中大量获取目的基因片段。PCR反应条件的优化：优化的目的主要有两个，即提高扩增产物特异性和提高产物产量。但在多数情况下，这两个目的却是互相矛盾的。总体来说，适当减少模板、引物、聚合酶、Mg2+的浓度和适当提高退火温度、减少循环次数，可以提高产物的特异性，但相应会减少产量；反之，则可以提高产物的产量，但增加非特异性扩增产物。因此，应根据实验目的合理选择最佳反应条件，必要时可进行多次预实验反复摸索。1引物：引物是决定PCR成败的最关键因素。必须保证引物碱基序列的高度特异性；引物长度一般为15-30bp，过短则特异性降低；G+C含量控

32、制在40-60%，且两个引物的Tm值不得相差太大；引物自身不得存在3bp以上的互补碱基序列；两条引物之间不应存在4个以上连续的同源性或互补性碱基；避免4个以上同一碱基的连续出现；引物合成质量要好，并需要纯化；反应体系中引物浓度一般应控制在0.2-1mol/L，过低则产量降低，过高则导致非特异性扩增。2耐热DNA聚合酶：通常Taq DNA聚合酶用量为0.5-5U/100l，酶量过大会导致非特异产物的增加；传统使用的Taq DNA聚合酶的一个致命缺点是不具备 35校正外切酶活性，错配率高（大约每聚合9000个核苷酸发生一次错误掺入，经过约20个循环后，扩增产物中随机突变率大致为1/400-1/90

33、0），导致扩增产物发生突变。现已有多种高保真耐热DNA聚合酶（如Pfu DNA聚合酶、VENT DNA聚合酶等）可供选择，用于某些精度要求高的实验。3模板：PCR对模板的质和量要求都不是太高。RNA也可作为模板，但须先逆转录为cDNA。模板不需要太纯，但不能混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白。对于扩增哺乳动物基因组中单拷贝序列，模板DNA的加入量一般为0.2-2g。对于质粒DNA模板只需要20ng。模板量过多，会增加非特异性扩增机会。4Mg2+浓度：Mg2+是维持Taq DNA聚合酶活性所必需的，还影响DNA的Tm值、产物的特异性及引物二聚体的形成。Mg2

34、+浓度过低时，酶活性显著降低，使产量降低；过高时，易生成非特异性扩增产物。由于模板DNA、引物、EDTA和dNTP均可与Mg2+结合而降低游离Mg2+浓度，因此Mg2+的浓度应比dNTP高0.2-2.5 mmol/L，模板的DNA应溶于10mmol/L Tris-HCl(pH7.6)/0.1mmol/L EDTA中。5dNTPs：dNTP具有较强的酸性，使用前应调节pH至7.0-7.5。浓度范围为20-200mol/L，高浓度dNTPs易产生错误掺入，而浓度太低则降低反应物的产量。四种dNTP应等当量配制，其中任何一种浓度偏高或偏低，都会诱导错误掺入，降低合成速度，过早终止反应。决定最低dNT

35、P浓度的因素是靶序列DNA的长度和组成。在100l反应体系中，20mol/L dNTPs基本满足合成2.6g DNA，50mol/L dNTPs可以合成6.6g DNA，而200mol/L dNTPs则足以合成25gDNA。6变性温度与时间：通常采用94-95变性1分钟。一般在第1次热循环前预先94变性5-10分钟，然后再进入循环过程的94变性阶段。7复性温度与时间：这是决定PCR成败的又一个关键因素，它直接决定了扩增产物的特异性。合适的复性温度应低于PCR条件下真实Tm值。降低温度可提高产量，但增加非特异性扩增；反之则提高特异性但降低产量。8、延伸温度和时间：延伸温度一般为72。延伸时间主要

36、视目标DNA片段长度而定。正常掺入速度为35-100nt/秒，一般情况下30-60秒就足够，时间过长也增加非特异性扩增。但最后一个循环可将时间延长到4-10分钟。9循环次数：在PCR反应后期，由于底物和引物的消耗、酶活性的下降、终产物（双链DNA、焦磷酸）的堆积等原因，导致产物从原来以指数级增加的形式转变为线性形式，即所谓平台效应。所以即便再增加循环数，由于产物的增加量有限，反而会增加非特异性扩增的机会。常规循环数为25-40，多数为30次左右。如果要进一步提高产量，可将样品稀释1000-10000倍后进行第二轮PCR扩增。10、其它因素：50mmol/L KCl可提高酶促效率。BSA、DTT

37、、明胶、Tween- 20等能有助于酶的稳定。5-10%DMSO有利于DNA变性，但抑制酶活性。5-20%甘油有利于DNA复性。【试剂器材】1DNA模板（0.5mg/ml）210 pmol/L上游引物310 pmol/L下游引物410 PCR buffer：200 mmol/L Tris-HCl pH 8.315 mmol/L MgCl2250 mmol/L KCl0.5% Tween-20l mg/ml BSA510 mmol/L dNTPs：四种dNTP各2.5mmol/L6Taq DNA聚合酶（1 U/l）7PCR仪80.2ml Eppendorf离心管9微量移液器【操作步骤】1在0.2

38、ml离心管中加入： 10PCR缓冲液 5.0l 10 mmol/L dNTPs 4.0l 上游引物 2.0l 下游引物 2.0l 模板DNA 10lTaq DNA聚合酶 0.3-0.5l（1-2U）。 加去离子水至终体积为 50l2混匀后，短暂离心。3将离心管置PCR仪中。4设定热循环参数： 94 5分钟 94 30秒55 30秒 循环30次72 30秒72 10分钟4 1小时5进行扩增反应（约2-3小时）。6取出反应管，吸取少量进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。其余样品置-20保存备用。 实验七 DNA的琼脂糖凝胶电泳【目的要求】学习并掌握DNA琼脂糖凝胶电泳基本原理和操作，了解如何通过电泳判断DNA

39、纯度、含量和分子量。【实验原理】凝胶电泳是分离、纯化和鉴定DNA的常用方法。因为DNA分子是两性解离分子，在pH高于其等电点（约3.5）的中性或碱性溶液中带负电荷，在电场中向正极方向泳动。DNA凝胶电泳的介质主要有两种：琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。聚丙烯凝胶的孔径较小，适合于分离5-500bp的小片段DNA；而琼脂糖凝胶的孔径较大，可以分离100bp-60kb的较大片段DNA。不同浓度的琼脂糖凝胶适合于分离不同大小的DNA片段（表7-1）。 琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，当熔化后再凝固时就会形成固体基质，具有多孔的网状结构，孔径大小取决于琼脂糖浓度。DNA在琼脂糖凝胶中泳动时，受到

40、电荷效应和分子筛效应的双重影响。电荷效应由分子所带的电荷量多少来决定，而分子筛效应则与分子大小和构象有关。在一定的电场强度下，DNA分子的泳动速度主要取决于分子量表7-1：不同浓度琼脂糖凝胶对DNA的有效分离范围琼脂糖浓度（%）线性DNA有效分离范围(kb)0.35-600.61-200.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-42.00.1-3大小和构象。线状双链DNA分子在琼脂糖凝胶介质中的迁移率与其分子量的对数值成反比。分子越大，迁移速度越慢，从而可以将不同大小的DNA分子分开。因此，通过与DNA标准分子量参照物（MW marker）的迁移率对照，可以鉴定DNA分子的

41、大小。DNA分子的构象也可以明显影响其迁移率。在细胞内质粒DNA有3种构象：超螺旋的共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA），松弛型的开环DNA（open circular DNA，ocDNA）和线性DNA，在琼脂糖凝胶电泳中，其泳动速度依次为：cccDNA 线性DNA ocDNA，因而未酶切的质粒DNA在电泳中多显示为3条带，泳动速度最快的超螺旋带越亮，说明质粒DNA提取质量越好。DNA的迁移率还与电场强度（即单位长度的电压降）有关，电场强度越大，泳动速度越快。当需要快速观察电泳结果时，可以适当加大电场强度。但是电泳分辨率会随着电场强度的增大而缩小，因为高分子高速流动时摩擦力增加，相对分子质量与移动速度就不一定成正比，因此一般电场强度应不超过5V/cm。特别是当需要较精确测定DNA片段大小、获得理想的分辨率和漂亮的带型时，应该适当降低电场强度，相应的适当延长电泳时间，并选用相对较低的凝胶浓度。为了显示凝胶中DNA的泳动位置，需要加入染色剂染色。最常用的染色剂是溴化乙锭（ethidium bromide EB）。溴化乙锭可以嵌入核酸双链的配对碱基之间，在紫外线的激发下发出橘红色荧光。一般是在凝胶中直