基因测序实验常见问题分析

1、 基点认知技术（北京）有限公司基点认知技术（北京）有限公司技术支持部技术支持部实验常见问题解析实验常见问题解析 基点认知技术（北京）有限公司基点认知技术（北京）有限公司出现问题的类型出现问题的类型v 光谱校正时出现的问题光谱校正时出现的问题v 电泳时出现的问题电泳时出现的问题v 基因分型时出现的问题基因分型时出现的问题v 其它在出差中遇到的问题其它在出差中遇到的问题 基点认知技术（北京）有限公司基点认知技术（北京）有限公司一、光谱校正时出现的问题一、光谱校正时出现的问题 基点认知技术（北京）有限公司基点认知技术（北京）有限公司1. 软件提示：软件提示： Insufficient number

2、of dye spectra detected! Check raw data.（1）实际原因：泳道没有收集到信号，即没有检测到目的峰，或目的峰信号过实际原因：泳道没有收集到信号，即没有检测到目的峰，或目的峰信号过低，低于低，低于750rfu。解决方案：如有必要重新校正则减少与甲酰胺的比例，或增大进样时间。解决方案：如有必要重新校正则减少与甲酰胺的比例，或增大进样时间。 基点认知技术（北京）有限公司基点认知技术（北京）有限公司2. 软件提示：软件提示：Saturated data detected. Calibration failed. 实际原因：实际原因：气泡引起的气泡引起的峰使信号达峰使

3、信号达到饱和，显到饱和，显示不通过。示不通过。 解决方案：解决方案：尽量保证胶尽量保证胶及通道中没及通道中没有气泡。有气泡。（下图是放（下图是放大图）大图） 基点认知技术（北京）有限公司基点认知技术（北京）有限公司3. 软件提示：软件提示：Bad dye order detected.实际原因：引物峰过高，检测范围包括引物峰部分。实际原因：引物峰过高，检测范围包括引物峰部分。解决方案：调整检测范围到引物峰之后，包括所有目的峰。解决方案：调整检测范围到引物峰之后，包括所有目的峰。 基点认知技术（北京）有限公司基点认知技术（北京）有限公司4. 软件提示软件提示：Failed quality che

4、ck: q=0.93807 is less than minQ threshold (0.95000)实际原因：各颜色之间引起的实际原因：各颜色之间引起的pull up 和和pull down 峰导致峰导致Q值低于设定值。值低于设定值。解决方案：权宜之计是降低解决方案：权宜之计是降低Q值设定值，彻底解决就是重新生产值设定值，彻底解决就是重新生产matrix 。 基点认知技术（北京）有限公司基点认知技术（北京）有限公司5. 选择了不适合选择了不适合Dye set的的M 基点认知技术（北京）有限公司基点认知技术（北京）有限公司二、电泳时出现的问题二、电泳时出现的问题1.所有毛细管没有数据所有毛细管

5、没有数据 原因：毛细管或原因：毛细管或block通路中有气泡通路中有气泡 没有样品进入没有样品进入 自动进样器不在正确位置，使毛细管头吸入气自动进样器不在正确位置，使毛细管头吸入气 泡或接触不到样品泡或接触不到样品 措施：重新正确上样，排气泡，拆毛细管清洗措施：重新正确上样，排气泡，拆毛细管清洗block，syring，更换胶，更换胶 基点认知技术（北京）有限公司基点认知技术（北京）有限公司2. .个别毛细管无信号个别毛细管无信号原因：自动进样器不在正确位置（用原因：自动进样器不在正确位置（用20l 样品试验）样品试验） 样品管是中空的（离心）样品管是中空的（离心） 毛细管有弯曲或有损坏（更换

6、毛细管）毛细管有弯曲或有损坏（更换毛细管） 基点认知技术（北京）有限公司基点认知技术（北京）有限公司3. 信号过饱和信号过饱和原因：上样量过大（稀释样品，减少进样时间）原因：上样量过大（稀释样品，减少进样时间） 基点认知技术（北京）有限公司基点认知技术（北京）有限公司4. 信号过低信号过低表现为信号很弱，内标只有几十表现为信号很弱，内标只有几十rfu。原因：甲酰胺质量不高原因：甲酰胺质量不高 使用的水中盐离子浓度过高（更换超纯水）使用的水中盐离子浓度过高（更换超纯水） 没有足够的样品（增加上样量，校正自动进样器）没有足够的样品（增加上样量，校正自动进样器） 样品稀释倍数过大样品稀释倍数过大 混

7、合的不充分（充分混合，离心）混合的不充分（充分混合，离心） 自动进样器不在最佳位置自动进样器不在最佳位置 基点认知技术（北京）有限公司基点认知技术（北京）有限公司5. 基线不平，峰形明显异常基线不平，峰形明显异常原因：胶中可能有污染物（清洗原因：胶中可能有污染物（清洗block，syring，更换胶），更换胶） 胶中有结晶或沉淀物（将胶在室温放置胶中有结晶或沉淀物（将胶在室温放置30min使之达到室温，旋使之达到室温，旋动使沉淀物溶解）动使沉淀物溶解） 光谱校正的不好光谱校正的不好 基点认知技术（北京）有限公司基点认知技术（北京）有限公司6.信号凌乱，有倒峰信号凌乱，有倒峰原因：所选的原因：所

8、选的dye set不适合不适合 光谱校正的不好光谱校正的不好 基点认知技术（北京）有限公司基点认知技术（北京）有限公司7.无电流或电流异常无电流或电流异常原因：使用的水质量不好（更换超纯水）原因：使用的水质量不好（更换超纯水） buffer槽中是水或槽中是水或 buffer稀释的倍数不对稀释的倍数不对 阳极没有足够的阳极没有足够的buffer block或毛细管中有气泡（排气泡）或毛细管中有气泡（排气泡） 胶已失效胶已失效 整个体系中有泄漏的地方整个体系中有泄漏的地方 基点认知技术（北京）有限公司基点认知技术（北京）有限公司8. 小于小于100 runs毛细管检测结果不好毛细管检测结果不好原因

9、：样品本身不好原因：样品本身不好 甲酰胺质量不好甲酰胺质量不好 buffer稀释的倍数不对稀释的倍数不对9. 检测的结果异常，移动的快或慢检测的结果异常，移动的快或慢原因：注射器中有水导致胶被稀释原因：注射器中有水导致胶被稀释 block或胶中有大气泡或胶中有大气泡 整个体系中有泄漏的地方整个体系中有泄漏的地方 甲酰胺的质量不好甲酰胺的质量不好 基点认知技术（北京）有限公司基点认知技术（北京）有限公司10. 有一根毛细管电泳时背景有荧光，导致基线不平，影响结果有一根毛细管电泳时背景有荧光，导致基线不平，影响结果原因：毛细管中有污染物，会随电泳次数增多逐渐消失。原因：毛细管中有污染物，会随电泳次

10、数增多逐渐消失。处理办法：不加甲酰胺，每次加处理办法：不加甲酰胺，每次加10l 的蒸馏水，电泳几次。的蒸馏水，电泳几次。 基点认知技术（北京）有限公司基点认知技术（北京）有限公司11. 每次电泳时并不是全部泳道信号都很好信号弱或无信号每次电泳时并不是全部泳道信号都很好信号弱或无信号的泳道主要集中在两端的泳道主要集中在两端 解决方法：换成解决方法：换成20l 体系试试，调整自动进样器尤其是体系试试，调整自动进样器尤其是Z轴。轴。 连续多次上样看是否是某根固定毛细管，或者是毛细管有题。连续多次上样看是否是某根固定毛细管，或者是毛细管有题。 或许与所用的或许与所用的96孔板有关，更换孔板有关，更换9

11、6孔板。孔板。 基点认知技术（北京）有限公司基点认知技术（北京）有限公司12. 泳道中间基线明显形成一个台阶泳道中间基线明显形成一个台阶说明：属于正常现象。说明：属于正常现象。 可能是样品中有一些物质导致的，与样品的纯度有关，但并不影可能是样品中有一些物质导致的，与样品的纯度有关，但并不影响判型。响判型。 分析样品是会计算调整基线。分析样品是会计算调整基线。 基点认知技术（北京）有限公司基点认知技术（北京）有限公司13. 电泳导致大片段峰形变宽电泳导致大片段峰形变宽说明：随着时间的推移片段越来越大，所形成的峰变宽，但过宽会影响说明：随着时间的推移片段越来越大，所形成的峰变宽，但过宽会影响分型。

12、可能与试剂的纯度有关。分型。可能与试剂的纯度有关。注：电泳时胶图注：分析时图像 基点认知技术（北京）有限公司基点认知技术（北京）有限公司14. 电泳时易出现尖锐的四种颜色都有的峰（多显示为红色）电泳时易出现尖锐的四种颜色都有的峰（多显示为红色）说明：胶中有气泡，离子，杂质颗粒或其他有机物不透光，发生全反射导致的。说明：胶中有气泡，离子，杂质颗粒或其他有机物不透光，发生全反射导致的。解决方案：灌胶前放置室内半小时平衡室温，离心，注意排净气泡，注意环境的洁净解决方案：灌胶前放置室内半小时平衡室温，离心，注意排净气泡，注意环境的洁净程度，注意操作，以减少杂质进入。程度，注意操作，以减少杂质进入。 基

13、点认知技术（北京）有限公司基点认知技术（北京）有限公司15. 电泳时出现目的片断以外的其他杂峰电泳时出现目的片断以外的其他杂峰原因：主要原因是甲酰胺质量不好，或者是甲酰胺长期在原因：主要原因是甲酰胺质量不好，或者是甲酰胺长期在4度放置有降解。度放置有降解。解决方案：解决方案： 更换质量好的甲酰胺。（确定不是扩增产物）更换质量好的甲酰胺。（确定不是扩增产物） 基点认知技术（北京）有限公司基点认知技术（北京）有限公司16.出现电泳峰出现电泳峰说明：所出现的尖锐的小峰实际上是四种颜色都有的，位置不固定，杂乱无章，说明：所出现的尖锐的小峰实际上是四种颜色都有的，位置不固定，杂乱无章，内标中相对明显，影

14、响分析结果。当室温过高时明显会增多，可能是胶中有气泡，内标中相对明显，影响分析结果。当室温过高时明显会增多，可能是胶中有气泡，受热膨胀，易形成。严重影响分析结果的建议重新电泳。受热膨胀，易形成。严重影响分析结果的建议重新电泳。 基点认知技术（北京）有限公司基点认知技术（北京）有限公司17. 其他常见的电泳不好的现象其他常见的电泳不好的现象说明：内标峰值很低，样品峰值低不能作为扩增不好的依据。需要重新上样说明：内标峰值很低，样品峰值低不能作为扩增不好的依据。需要重新上样 以确定原因。以确定原因。 基点认知技术（北京）有限公司基点认知技术（北京）有限公司说明：内标并不均匀，大片段明显变低，可见是电

15、泳结果不好，样品的峰说明：内标并不均匀，大片段明显变低，可见是电泳结果不好，样品的峰 形不能作为扩增好坏的依据，需要重新上样来确定。形不能作为扩增好坏的依据，需要重新上样来确定。 基点认知技术（北京）有限公司基点认知技术（北京）有限公司说明：可见所有峰的峰形异常，不能正确进行分型，是电泳异常的表现，需重说明：可见所有峰的峰形异常，不能正确进行分型，是电泳异常的表现，需重 新上样。新上样。 基点认知技术（北京）有限公司基点认知技术（北京）有限公司说明：变性不完全现象。更换质量好的甲酰胺，在上样前变性说明：变性不完全现象。更换质量好的甲酰胺，在上样前变性95C 基点认知技术（北京）有限公司基点认知

16、技术（北京）有限公司说明：如果校正时跑出如图的峰型，是电泳现象，与产品质量无关。更换质说明：如果校正时跑出如图的峰型，是电泳现象，与产品质量无关。更换质量好的甲酰胺，重新进行校正。量好的甲酰胺，重新进行校正。 基点认知技术（北京）有限公司基点认知技术（北京）有限公司说明：上图现象是电泳中出现的现象，在校正正常且多数通过情况下，更说明：上图现象是电泳中出现的现象，在校正正常且多数通过情况下，更换质量好的甲酰胺，上样前变性，重新电泳。与产品质量无关换质量好的甲酰胺，上样前变性，重新电泳。与产品质量无关 基点认知技术（北京）有限公司基点认知技术（北京）有限公司 总结：总结：检测结果不好时，对照现象查

17、找原因，主要注意：检测结果不好时，对照现象查找原因，主要注意： 1.使用超纯水使用超纯水 2.有足够的有足够的buffer，且稀释倍数、放置位置准确，且稀释倍数、放置位置准确 3.保证保证block通路中没有气泡，如需要请仪器负责人解决通路中没有气泡，如需要请仪器负责人解决 4.加入适量样品如要加微量则有必要稀释，进样时间要适当，如不能更改则调整上样加入适量样品如要加微量则有必要稀释，进样时间要适当，如不能更改则调整上样 量，使峰高在量，使峰高在1000-3000 rfu 左右。左右。 5.使用使用96孔板上样时如样品太多又复杂则应事先写好记录，加样后振荡，离心变性后孔板上样时如样品太多又复杂

18、则应事先写好记录，加样后振荡，离心变性后立即冰浴立即冰浴3min 6. 注意毛细管的使用次数（在注意毛细管的使用次数（在instrument protocol处可见），注意毛细管不要脱离处可见），注意毛细管不要脱离buffer 超过超过30min 7.如有离子影响结果，可用水上样试一次如有离子影响结果，可用水上样试一次 8.注意甲酰胺的质量注意甲酰胺的质量 基点认知技术（北京）有限公司基点认知技术（北京）有限公司三、基因分型时出现的问题三、基因分型时出现的问题分析及解答：从图分析及解答：从图1可以看出，在样本的每个位点上都有两个或两个以上的可以看出，在样本的每个位点上都有两个或两个以上的目的峰

19、，并且目的峰之间峰值很不均衡，这些都说明这是一个混合样本。等目的峰，并且目的峰之间峰值很不均衡，这些都说明这是一个混合样本。等位基因间峰值不均衡是因为不同来源的模板浓度不同导致。如果样本实际上位基因间峰值不均衡是因为不同来源的模板浓度不同导致。如果样本实际上应该是单一来源的，则说明在应该是单一来源的，则说明在DNA提取或扩增的过程中污染了其它的提取或扩增的过程中污染了其它的DNA，需重新提取需重新提取DNA或扩增。或扩增。1. 有额外的杂峰，并且每个位点均有杂峰有额外的杂峰，并且每个位点均有杂峰 基点认知技术（北京）有限公司基点认知技术（北京）有限公司2. 只在一个位点或几个位点出现了额外的杂

20、峰只在一个位点或几个位点出现了额外的杂峰 分析及解答：图中，分析及解答：图中，D21位点明显污染了位点明显污染了ladder，这可能是由于检测过程中污染，这可能是由于检测过程中污染了了D21 ladder的片段的片段 基点认知技术（北京）有限公司基点认知技术（北京）有限公司3.在个别位点出现的不同于目的峰的染料堆积峰在个别位点出现的不同于目的峰的染料堆积峰 偶尔会在本实验室出现的染料堆积峰（偶尔会在本实验室出现的染料堆积峰（vWA位点、位点、D18位点附近）位点附近） 基点认知技术（北京）有限公司基点认知技术（北京）有限公司4. 峰值过高峰值过高 基点认知技术（北京）有限公司基点认知技术（北京

21、）有限公司5. pull-up或或pull-down峰峰 分析及解答：当峰值过高（大于分析及解答：当峰值过高（大于4000rfu）或）或matrix校正不好时，都可能会观察到在校正不好时，都可能会观察到在某一颜色中出现由另一颜色的信号而拉起（某一颜色中出现由另一颜色的信号而拉起（pull-up）或减低（）或减低（pull-down）的峰。）的峰。如果峰值过高，可以在上样前先将如果峰值过高，可以在上样前先将PCR产物进行稀释，这样电泳时峰值就会下降，产物进行稀释，这样电泳时峰值就会下降，pull-up或或pull-down峰就会减轻。如果峰值小于峰就会减轻。如果峰值小于2000rfu还是出现还是

22、出现pull-up或或pull-down峰，则说明是峰，则说明是matrix校正不好，需要重新进行校正。校正不好，需要重新进行校正。 基点认知技术（北京）有限公司基点认知技术（北京）有限公司6. 位点丢失位点丢失分析及解答：图中出现了明显的位点丢失现象，这是由模板量较低或模板已降解分析及解答：图中出现了明显的位点丢失现象，这是由模板量较低或模板已降解造成的，造成的，DNA降解成为较小的片段，故相对长些的片段无法得到扩增；降解成为较小的片段，故相对长些的片段无法得到扩增； 基点认知技术（北京）有限公司基点认知技术（北京）有限公司7. 峰值低，影响分型峰值低，影响分型分析及解答：峰值较低，可能是模

23、板分析及解答：峰值较低，可能是模板DNA的量不足，或者是模板的量不足，或者是模板DNA中存在较中存在较多的抑制剂，而样本中较多的离子或多的抑制剂，而样本中较多的离子或EDTA都会影响都会影响PCR扩增的效率。此时可以扩增的效率。此时可以增加模板的用量，增加反应的循环数。但要注意的是，模板增加模板的用量，增加反应的循环数。但要注意的是，模板DNA的体积不要超的体积不要超过总反应体积的过总反应体积的20%，否则其中的抑制剂会抑制扩增反应。，否则其中的抑制剂会抑制扩增反应。 基点认知技术（北京）有限公司基点认知技术（北京）有限公司8. 小片段位点优势扩增而大片段位点扩增效率低小片段位点优势扩增而大片

24、段位点扩增效率低 分析及解答：图中是一个明显的小片段优势扩增而大片段扩增效率低的图例。这分析及解答：图中是一个明显的小片段优势扩增而大片段扩增效率低的图例。这种现象经常见于含量过大的种现象经常见于含量过大的DNA模板（模板（ABI的的ID试剂盒此种现象更为明显），可试剂盒此种现象更为明显），可能是因为当模板过多时，体系中的聚合酶，能是因为当模板过多时，体系中的聚合酶，dNTP等资源被小分子量片段（因其等资源被小分子量片段（因其较易扩增）优先利用，而大分子量的片段得不到足够的资源来高效扩增而导致的。较易扩增）优先利用，而大分子量的片段得不到足够的资源来高效扩增而导致的。若想改善这种状况可以适当减

25、少模板的用量，并降低反应的循环数。若想改善这种状况可以适当减少模板的用量，并降低反应的循环数。 基点认知技术（北京）有限公司基点认知技术（北京）有限公司9. 等位基因峰高失衡等位基因峰高失衡 分析及解答：图中峰值很低，等位基因间峰高失衡，以至于难以判型。当模板分析及解答：图中峰值很低，等位基因间峰高失衡，以至于难以判型。当模板量过少时，得到的量过少时，得到的PCR产物较少，等位基因与噪音峰在峰值上相差不多，无法产物较少，等位基因与噪音峰在峰值上相差不多，无法判断是等位基因型还是噪音峰，导致无法准确判型。判断是等位基因型还是噪音峰，导致无法准确判型。 基点认知技术（北京）有限公司基点认知技术（北

26、京）有限公司10. 加加A不完全不完全+A-A 分析及解答：分析及解答： TaqDNA聚合酶可以不依赖于模板的方式在扩增产物的聚合酶可以不依赖于模板的方式在扩增产物的3末端加核苷末端加核苷酸，一般是腺苷酸，发生这一现象的频率取决于不同的引物序列和聚合酶的性质。酸，一般是腺苷酸，发生这一现象的频率取决于不同的引物序列和聚合酶的性质。因此有时能观察到比预计少一个碱基的假带。本试剂盒已将引物序列进行修饰，并因此有时能观察到比预计少一个碱基的假带。本试剂盒已将引物序列进行修饰，并在扩增程序的最后一步加入在扩增程序的最后一步加入60延伸延伸30分钟的步骤，尽量使分钟的步骤，尽量使PCR产物末端都加上产物

27、末端都加上A。 基点认知技术（北京）有限公司基点认知技术（北京）有限公司11. 扩增良好的样本的图例扩增良好的样本的图例 基点认知技术（北京）有限公司基点认知技术（北京）有限公司1. Panel不能导入不能导入弹出的对话框显示为弹出的对话框显示为: Invalid marker repeat in line #5 for marker Amlogenin valid marker repeat are 2，3，4& 9 Amlogenin 6 D16S539 4 vWA 4 FGA 4 D21S11 4 D3S1358 4 D18S51 4 TH01 4 PentaE 5 D8S117

28、9 4 D5S818 4 TPOX 4 D13S317 4 CSF1P0 4 D7S820 4 PentaD 5 marker repeat marker repeat四、在出差中遇到的问题四、在出差中遇到的问题 基点认知技术（北京）有限公司基点认知技术（北京）有限公司2.染料堆积峰染料堆积峰(Amlogenin、 vWA、D13S317、TH01位点）位点） 基点认知技术（北京）有限公司基点认知技术（北京）有限公司 基点认知技术（北京）有限公司基点认知技术（北京）有限公司3. .不同颜色峰峰高均衡性差不同颜色峰峰高均衡性差 基点认知技术（北京）有限公司基点认知技术（北京）有限公司 28个循环

29、，个循环，chelex提取，滤纸上的血斑和唾液斑提取，滤纸上的血斑和唾液斑 4. TPOX位点前存在非特异性峰位点前存在非特异性峰 基点认知技术（北京）有限公司基点认知技术（北京）有限公司5.电泳中产生的问题电泳中产生的问题（1）Off Ladder现象现象 原因：原因：多个多个run的的Ladder之间相互影响，有聚集偏移之间相互影响，有聚集偏移倾向，倾向，Ladder峰偏离了峰偏离了Bin，样品峰也偏离了，样品峰也偏离了Bin。这。这种情况之下将样品和相对应的种情况之下将样品和相对应的Ladder重新建立重新建立project，重新分析，如果能对应就不必重新扩增。重新分析，如果能对应就不必重新扩增。 基点认知技术（北京）有限