第六章人工酶ppt课件

1、l第六章第六章 人工酶人工酶 经过对生物体系的构造与功能的研讨,为设计和建造新的技术提供新思想、新原理、新方法和新途径。 利用化学模拟作为阐明自然界中生物体行为的根底。人们认识到研讨和模拟生物体系是开辟新技术的途径之一。一、人工酶概念：一、人工酶概念： 人工酶是在分子程度上模拟酶活性部人工酶是在分子程度上模拟酶活性部位的外形、大小及其微环境等构造特征，位的外形、大小及其微环境等构造特征，以及酶的作用机理和立体化学等特性的以及酶的作用机理和立体化学等特性的一门科学。一门科学。 二、人工酶的实际根底二、人工酶的实际根底 1 1、人工酶的酶学根底、人工酶的酶学根底 酶是如何发生效能的？酶是如何发生效

2、能的？ Pauling Pauling的稳定过渡态实际：酶的稳定过渡态实际：酶先对底物结合，进而选择性稳定某一特先对底物结合，进而选择性稳定某一特定反响的过渡态定反响的过渡态TSTS, ,降低反响的活化降低反响的活化能，从而加快反响速度。能，从而加快反响速度。 广义的酸碱催化、临近与定向、变形广义的酸碱催化、临近与定向、变形与张力等等，都是酶催化高效性的重要与张力等等，都是酶催化高效性的重要缘由。缘由。设计人工酶应思索：设计人工酶应思索：1 1酶的作用机制，酶的作用机制，2 2模拟体系中的识别、结合和催化。模拟体系中的识别、结合和催化。 这两方面必需一致结合。这两方面必需一致结合。2 2、 “

3、 “主主- -客体化学客体化学 PedersonPederson和和CramCram研讨冠醚时发现：冠醚研讨冠醚时发现：冠醚主体与伯胺盐客体构成复合物。主体与伯胺盐客体构成复合物。把主体与客体经过配位键或其他次级键把主体与客体经过配位键或其他次级键构成稳定复合物的化学领域称为构成稳定复合物的化学领域称为“主主- -客客体化学。体化学。 3. 超分子化学超分子化学 Lehn在研讨穴醚和大环化合物与配体在研讨穴醚和大环化合物与配体络合过程中，提出了超分子化学的概念。络合过程中，提出了超分子化学的概念。 超分子的构成源于底物和受体的结合，超分子的构成源于底物和受体的结合，这种结合基于非共价键相互作用

4、静电作用、这种结合基于非共价键相互作用静电作用、氢键和范德华力等，构成具有稳定构造和性氢键和范德华力等，构成具有稳定构造和性质的实体，即构成了质的实体，即构成了“超分子，超分子， 兼具分子识别、催化和选择性输出的功能。兼具分子识别、催化和选择性输出的功能。 与酶和它所识别的底物结合情况近似。与酶和它所识别的底物结合情况近似。1987年年Cram、Pederson和和Lehn获诺贝尔化学获诺贝尔化学奖。奖。 主主-客体化学和超分子化学为人工模拟酶客体化学和超分子化学为人工模拟酶提供了实际根底。提供了实际根底。 第二节 人工酶的分类 按照属性按照属性, ,人工酶可分为：人工酶可分为：主客体酶模型主

5、客体酶模型, ,包括环糊精、冠醚、包括环糊精、冠醚、穴醚、杂环大环化合物和卟啉类等穴醚、杂环大环化合物和卟啉类等; ; 胶束酶模型；胶束酶模型； 肽酶；肽酶； 抗体酶抗体酶; ; 分子印迹酶模型分子印迹酶模型 半合成酶等。半合成酶等。不限于化学手段，基因工程、蛋白质工不限于化学手段，基因工程、蛋白质工程也发扬了重要作用。程也发扬了重要作用。一、主一、主- -客体酶模型客体酶模型 环糊精酶模型环糊精酶模型 环糊精环糊精(cyclodextrin,(cyclodextrin,简称简称CD)CD)1 1、由、由D-D-葡萄糖以葡萄糖以1 1，4-4-糖苷键结合的环状低聚糖。糖苷键结合的环状低聚糖。2

6、 2、有、有6 6个个-CD-CD、7 7个个-CD-CD及及8 8个个-CDCD环糊精环糊精3 3种，种，3 3、呈锥形的圆筒，伯羟基位于较小口、仲羟基、呈锥形的圆筒，伯羟基位于较小口、仲羟基位于较大开口端。位于较大开口端。 特点：特点：1、CD分子外侧是亲水的，其羟基可与多分子外侧是亲水的，其羟基可与多种客体构成氢键。种客体构成氢键。2、其内侧是、其内侧是C3，C5上的氢原子和糖苷氧上的氢原子和糖苷氧原子组成的空腔，具有疏水性。因此能原子组成的空腔，具有疏水性。因此能包结多种客体分子，类似酶对底物的识包结多种客体分子，类似酶对底物的识别。别。1 1、水解酶的模拟、水解酶的模拟组氨酸咪唑基在

7、酶催化中起着重要作用。组氨酸咪唑基在酶催化中起着重要作用。 Rama等人将咪唑在等人将咪唑在N上直接与上直接与CD的的C3相连，相连，所得的图所得的图6-2催化催化pNPAc的水解比天然酶快的水解比天然酶快一个数量级。一个数量级。“强中自有强中手强中自有强中手2 2、转氨酶的模拟、转氨酶的模拟 Tabushi Tabushi等将催化基团氨基引入等将催化基团氨基引入CDCD。乙二胺的引入乙二胺的引入1 1使反响加速使反响加速20002000倍以上，倍以上，2 2发明了一个极强的手性环境，发明了一个极强的手性环境，3 3表现出很好的立体选择性。表现出很好的立体选择性。 3.3.桥联环糊精仿酶模型桥

8、联环糊精仿酶模型 它的两个它的两个CDCD及桥基上的功能基构成了及桥基上的功能基构成了具有协同包结和多重识别功能的催化活具有协同包结和多重识别功能的催化活性中心，能更好地模拟酶对底物的识别性中心，能更好地模拟酶对底物的识别与催化功能。与催化功能。 lMatsui等将乙二胺偶联到CD上，然后与铜盐作用构成桥联环糊精A部分l 它催化糠偶姻B部分氧化成糠偶酰的反响，比没有催化剂时大20倍。二、肽酶二、肽酶 肽酶肽酶pepzymepepzyme就是模拟天然酶活性部位就是模拟天然酶活性部位而人工合成的具有催化活性的多肽。而人工合成的具有催化活性的多肽。AtassiAtassi和和ManshouriMan

9、shouri利用化学和晶体图像数利用化学和晶体图像数据有关信息，采用据有关信息，采用“外表刺激合成法合外表刺激合成法合成了两个成了两个2929肽。肽。模拟模拟胰凝乳蛋白酶活性部位胰凝乳蛋白酶活性部位模拟胰蛋白酶的活性部位，模拟胰蛋白酶的活性部位，水解蛋白的活力分别与其模拟的酶一样水解蛋白的活力分别与其模拟的酶一样三、半合成酶三、半合成酶 以天然蛋白质或酶为母体，用化学以天然蛋白质或酶为母体，用化学或生物学方法引进适当的活性部位或催化基团，或生物学方法引进适当的活性部位或催化基团，或改动其构造从而构成一种新的或改动其构造从而构成一种新的“人工酶。人工酶。 1 1、选择性修饰氨基酸侧链化学诱变法、

10、选择性修饰氨基酸侧链化学诱变法 Bender Bender等初次胜利地将枯草杆菌蛋等初次胜利地将枯草杆菌蛋白酶活性部位的丝氨酸白酶活性部位的丝氨酸SerSer残基，经残基，经PMSFPMSF活化后再用巯基化合物取代，将丝氨酸转化活化后再用巯基化合物取代，将丝氨酸转化为半胱氨酸。特点：为半胱氨酸。特点：对肽或酯没有水解活力，对肽或酯没有水解活力，但能水解高度活化的底物如硝基苯酯但能水解高度活化的底物如硝基苯酯 2、将辅酶引入到构造知的蛋白质上。例如：黄素木瓜蛋白酶 黄素的溴酰衍生物可与木瓜蛋白酶的Cys25共价结合成黄素木瓜蛋白酶。 特点：酶活力可与老黄素酶相当。 其他的辅酶如维生素B1、吡哆醛

11、、卟啉等都可以共价偶联到某些酶的结合部位，从而产生新的适用催化剂。 3 3、在抗体结合部位附近的适当位置引入催、在抗体结合部位附近的适当位置引入催化活性基团。化活性基团。 根本方法：根本方法： 用化学法将一个催化活性基团引入抗用化学法将一个催化活性基团引入抗原类似物中，利用抗体与抗原类似物的原类似物中，利用抗体与抗原类似物的亲和结协作用，使催化活性基团与抗体亲和结协作用，使催化活性基团与抗体结合部位附近的氨基酸残基共价结合，结合部位附近的氨基酸残基共价结合，将催化活性基团与抗原类似物分别，在将催化活性基团与抗原类似物分别，在结合部位附近就引入了活性基团结合部位附近就引入了活性基团Schultz

12、Schultz等运用此方法已胜利地将等运用此方法已胜利地将-SH-SH引入引入到抗体到抗体MOPC315MOPC315的结合部位附近。的结合部位附近。提高硫解速率达提高硫解速率达 60000 60000倍。倍。分子印记技术概述分子印记技术概述人们对小分子仿酶体系、抗体酶、半合成人们对小分子仿酶体系、抗体酶、半合成酶、分子印迹酶模型和胶束酶模型等人酶、分子印迹酶模型和胶束酶模型等人工酶进展了系统的研讨，曾经获得了很工酶进展了系统的研讨，曾经获得了很大进展。大进展。分子识别在生物体如酶、受体和抗体的生分子识别在生物体如酶、受体和抗体的生物活性方面发扬着重要作用，这种高选物活性方面发扬着重要作用，这

13、种高选择性来源于与底物相匹配的结合部位的择性来源于与底物相匹配的结合部位的存在。存在。为获得这样的结合部位，科学家们运用环为获得这样的结合部位，科学家们运用环状小分子或冠状化合物如冠醚、环番、状小分子或冠状化合物如冠醚、环番、环糊精、杯芳烃等来模拟生物体系。环糊精、杯芳烃等来模拟生物体系。这样的类似于抗体和酶的结合部位能否在聚合这样的类似于抗体和酶的结合部位能否在聚合物中产生呢？物中产生呢？ 分子印记分子印记:以一种分子充任模板，其周围用聚以一种分子充任模板，其周围用聚合物交联，当模板分子除去后，此聚合物就留下合物交联，当模板分子除去后，此聚合物就留下了与此分子相匹配的空穴。假设构建适宜，这种

14、了与此分子相匹配的空穴。假设构建适宜，这种聚合物就像聚合物就像“锁一样对钥匙具有选择性识别作锁一样对钥匙具有选择性识别作用，这种技术被称为分子印迹。用，这种技术被称为分子印迹。 1972年初次报道胜利地制备出分子印记聚合物。年初次报道胜利地制备出分子印记聚合物。分别提纯、免疫分析、生物传感器，特别是人分别提纯、免疫分析、生物传感器，特别是人工模拟酶方面显示出广泛的运用前景。工模拟酶方面显示出广泛的运用前景。 一、生物印记一、生物印记 定义：定义： 生物印记生物印记bioimprintingbioimprinting是分是分子印记的一种方式，它是指以天然的生子印记的一种方式，它是指以天然的生物资

15、料，如蛋白质和糖类物质为骨架，物资料，如蛋白质和糖类物质为骨架，在其上进展分子印记而产生的对印记分在其上进展分子印记而产生的对印记分子具有特异性识别空腔的过程。子具有特异性识别空腔的过程。特点：特点： 1 1产生很好的识别作用。产生很好的识别作用。 2 2生物分子构象的柔性在无水的有机生物分子构象的柔性在无水的有机相中被取消，其构象被固定。相中被取消，其构象被固定。 1.1.以蛋白质为根底的生物印记以蛋白质为根底的生物印记 印记过程印记过程 1 1酒石酸作用于牛血洁白蛋白，酒石酸作用于牛血洁白蛋白， 2 2冷冻枯燥，冷冻枯燥， 3 3用有机溶剂抽提酒石酸，用有机溶剂抽提酒石酸， 4 4得到酒石

16、酸印记的牛血洁白蛋得到酒石酸印记的牛血洁白蛋 白。白。 l 印记的白蛋白在无水乙酸乙酯溶剂中结合酒石酸的量l是未印记蛋白结合酒石酸的30倍印记机理：印记机理：1 配体印迹分子在蛋白质水溶液配体印迹分子在蛋白质水溶液中与多肽链的多个部位发生氢键相互作中与多肽链的多个部位发生氢键相互作用，使多肽链围绕配体拆叠，构成新的用，使多肽链围绕配体拆叠，构成新的构象，构象，2 此构象在除掉配体后仍能在无水有此构象在除掉配体后仍能在无水有机相得以坚持，因此印迹的分子带有恰机相得以坚持，因此印迹的分子带有恰似配体外形的孔穴，可以在有机相中经似配体外形的孔穴，可以在有机相中经过氢键结合配体。过氢键结合配体。3印记

17、的生物分子只能在无水有机相中印记的生物分子只能在无水有机相中起作用。假设将其移入水相起作用。假设将其移入水相,那么没有任那么没有任何印记效果。何印记效果。 例：例： 生物印记法修饰生物印记法修饰-胰凝乳蛋白酶。胰凝乳蛋白酶。 模板分子是：模板分子是： 酶的抑制剂酶的抑制剂N-乙酰乙酰D-色氨酸，色氨酸，印记对象是：印记对象是： -胰凝乳蛋白酶。胰凝乳蛋白酶。 q修饰酶在环修饰酶在环己烷中反响，己烷中反响，可催化合成可催化合成N乙酰乙酰D色氨酸乙酯色氨酸乙酯 q修饰酶在水修饰酶在水中只能催化中只能催化L-型氨基酸型氨基酸酯。酯。 利用生物印记方法可将蛋白质转化为半合成酶，印记后使蛋白质表现出与天

18、然酶类似的性质或被赋子了其他特性。主要过程为首先使蛋白质部分变性，扰乱起始蛋白质的构象;参与印记分子，使印记分子与部分变性的蛋白质充分结合；待印记分子与蛋白质相互作用后，用交联剂交联印记的蛋白质；经透析等方法除去印记分子。产生了类似于酶的新的活性中心，从而赋予了新的酶活力。 起始蛋白质既可以是无酶活力的蛋白质如牛血清蛋白等，又可以是具有催化活力的酶如核糖核酸酶、胰蛋白酶、葡萄糖异构酶等， 印记分子通常是某种酶的抑制剂、底物修饰物或过渡态类似物等。留意： 印记的生物分子只能在有机相中起作用，假设将其移入水相，那么没有印记效果。 2.2.以糖类为根底的生物印记以糖类为根底的生物印记 二、生物印记酶

19、二、生物印记酶 生物印记是分子印迹中非常重要的生物印记是分子印迹中非常重要的内容之一。内容之一。 先后获得了有机相、水相催化印记先后获得了有机相、水相催化印记酶。酶。 1.有机相生物印记酶有机相生物印记酶 例例1：脂肪酶有机相催化的生物印记。：脂肪酶有机相催化的生物印记。 水溶性脂肪酶在通常情况下是非活性的，水溶性脂肪酶在通常情况下是非活性的，其结合部位有一个其结合部位有一个“盖子。盖子。当底物脂肪以脂质体方式接近酶时，盖子当底物脂肪以脂质体方式接近酶时，盖子翻开，脂肪的一端与结合部位结合。翻开，脂肪的一端与结合部位结合。 Braco等将适当两亲性的外表活性剂与酶印迹，待外表活性剂分子与酶充分

20、接触后，将酶复合物冷冻枯燥，用非水溶剂洗去外表活性剂后，脂肪酶的活性中心的“盖子被去除，构成了活性中心开启的活性酶。选择不同活性剂诱导产生的非水相脂肪酶，其结合部位构象发生了新的变化。 2. 2. 水相生物印迹水相生物印迹1 1酯水解生物印迹酶酯水解生物印迹酶 19841984年，年，KeyesKeyes等首例用这种方法制备的印迹酶。等首例用这种方法制备的印迹酶。 印迹分子：吲哚丙酸，印迹分子：吲哚丙酸， 印迹牛胰核糖核酸酶，印迹牛胰核糖核酸酶，待起始蛋白质在部分变性条件下与吲哚丙酸作用，待起始蛋白质在部分变性条件下与吲哚丙酸作用，用戊二醛交联固定印迹蛋白质的构象用戊二醛交联固定印迹蛋白质的构

21、象透析去除印迹分子透析去除印迹分子制得了具有酶水解才干的生物印迹酶。制得了具有酶水解才干的生物印迹酶。特点：特点：印迹酶粗酶具有印迹酶粗酶具有7.3U/g7.3U/g，而非印迹酶那么无酯水，而非印迹酶那么无酯水解酶活力。解酶活力。粗酶经硫铵分级纯化后，比活力增至粗酶经硫铵分级纯化后，比活力增至22U22Ug g。再经柱层析纯化后，出现再经柱层析纯化后，出现 3 3种交联组分，其中低种交联组分，其中低分子量组分显示出最高酶活力到达分子量组分显示出最高酶活力到达600 U/g600 U/g。印迹酶的最适印迹酶的最适 pH pH、底物饱和特性、产物抑制等、底物饱和特性、产物抑制等均与天然酶类似，但具

22、有较宽的底物特异性。均与天然酶类似，但具有较宽的底物特异性。 2 2HFHF水解生物印迹酶水解生物印迹酶氟水解酶催化含氟化合物的水解反响。而使含氟氟水解酶催化含氟化合物的水解反响。而使含氟有机磷和磺酸类化合物解毒。有机磷和磺酸类化合物解毒。常见的底物：二异丙基氟磷酸常见的底物：二异丙基氟磷酸DFPDFP、对苯甲、对苯甲基磺酰氟基磺酰氟PMSFPMSF等。等。KeyesKeyes研讨小组的任务研讨小组的任务印迹分子：不同的底物类似物印迹分子：不同的底物类似物印迹核糖核酸酶印迹核糖核酸酶结果：结果：催化催化DFPDFP的活力比相应的抗体酶高，甚至超越了的活力比相应的抗体酶高，甚至超越了某些天然酶的

23、活力。某些天然酶的活力。 3 3具有谷胱甘肽过氧化物酶具有谷胱甘肽过氧化物酶GPXGPX活性的生活性的生物印迹酶物印迹酶 GPX GPX的酶活性中心具有的酶活性中心具有GSHGSH特异性结合部位。特异性结合部位。罗贵民等运用单克隆抗体制备技术，以罗贵民等运用单克隆抗体制备技术，以GSHGSH修修饰物为半抗原已制备出具有饰物为半抗原已制备出具有GSHGSH特异性结合部特异性结合部位的含硒抗体酶其催化活力已达天然酶程度。位的含硒抗体酶其催化活力已达天然酶程度。如何制备有如何制备有GPXGPX活性的含硒生物印迹酶？活性的含硒生物印迹酶？ 印迹分子的要求：印迹分子的要求：印迹分子应表达印迹分子应表达G

24、SHGSH的构造特征，使其诱导出对的构造特征，使其诱导出对GSHGSH具有较好结合的酶结合部位；具有较好结合的酶结合部位；稳定性好；稳定性好；不与交联剂发生化学反响；不与交联剂发生化学反响；思索到修饰基团能诱导出疏水结合部位。思索到修饰基团能诱导出疏水结合部位。 印迹分子：印迹分子： GSH修饰物修饰物 GSH的巯基的巯基和氨基用疏水基团和氨基用疏水基团2，4-二硝基苯修饰二硝基苯修饰印迹卵清蛋白印迹卵清蛋白产生产生GSH的特异性结合部位。的特异性结合部位。在结合部位引入催化基团是提高酶活力在结合部位引入催化基团是提高酶活力苯甲基磺酰氟苯甲基磺酰氟PMSF活化丝氨酸羟活化丝氨酸羟基，基，NaH

25、Se亲核取代，转化为硒代半胱氨酸亲核取代，转化为硒代半胱氨酸催化基团。催化基团。构成了具有构成了具有GPX活力的印迹酶。活力的印迹酶。 人工模拟酶研讨是生物有机化学的重要研讨领域之一。人工模拟酶研讨是生物有机化学的重要研讨领域之一。人工酶的分子设计在很大程度上反映了对酶的构造以人工酶的分子设计在很大程度上反映了对酶的构造以及反响机制的认识。及反响机制的认识。研讨人工酶模型可以较直观地察看与酶的催化作用相研讨人工酶模型可以较直观地察看与酶的催化作用相关的各种要素，如催化基团的组成、活性中心的空间关的各种要素，如催化基团的组成、活性中心的空间构造特征、酶催化反响的动力学性质等。构造特征、酶催化反响

26、的动力学性质等。人工模拟酶的研讨，是实现人工合成具有高性能模拟人工模拟酶的研讨，是实现人工合成具有高性能模拟酶的根底，在实际和实践运用上都具有重要意义。酶的根底，在实际和实践运用上都具有重要意义。世界兴隆国家重点资助这些高技术、新概念、新构思世界兴隆国家重点资助这些高技术、新概念、新构思探求性课题。探求性课题。 利用环糊精、大环化合物、抗体、印迹蛋白质利用环糊精、大环化合物、抗体、印迹蛋白质等为基质已制备出大量的人工酶，部分人工酶等为基质已制备出大量的人工酶，部分人工酶的催化效率及选择性已能与天然酶相媲美。的催化效率及选择性已能与天然酶相媲美。但大多数人工酶的催化活性并不高，尚缺乏系但大多数人

27、工酶的催化活性并不高，尚缺乏系统的、定量的实际为指点。统的、定量的实际为指点。大多数人工酶模型过于简单，缺乏对催化要素大多数人工酶模型过于简单，缺乏对催化要素的全面思索。的全面思索。催化抗体是不对称合成的理想催化剂，其催化催化抗体是不对称合成的理想催化剂，其催化反响的范围也在不断扩展，反响的范围也在不断扩展，但催化抗表达在还未到达适用阶段。比酶催化但催化抗表达在还未到达适用阶段。比酶催化低低23个数量级。个数量级。因此，如何提高抗体酶的催化效率，抗体酶未因此，如何提高抗体酶的催化效率，抗体酶未来能否与酶竞争是个公开挑战。来能否与酶竞争是个公开挑战。 以底物为半抗原所产生的抗体该当具有底物以底物为半抗原所产生的抗体该当具有底物结合部位，然后在此抗体的结合部位上引入结合部位，然后在此抗体的结合部位上引入催化基团。假设引入的催化基团与底物结合催化基团。假设引入的催化基团与底物结合部位取向正确、空间排布恰到益处，那么应部位取向正确、空间排布恰到益处，那么应产生高活力抗体酶。产生高活力抗体酶。1虽然有了不少抗体酶，但对诱导方法而虽然有了不少抗体酶，但对诱导方法而言，需求寻觅一个最为能够诱导出抗体言，需求寻觅一个最为能够诱导出抗体酶的过渡态复合物，且这是一个最为困难酶的过渡态复合物，且这是一个最为困难的问题。根本缘由是酶催化反响有很多